一、细胞松弛素B对K562细胞脱核作用的观察（论文文献综述）
刘茜[1]（2020）在《mTOR信号通路在人脐带血造血干/祖细胞红系定向分化中的作用及机制研究》文中研究表明背景:红细胞成分输血已广泛应用于临床各个领域疾病的治疗,是血液病、免疫缺陷综合征、严重创伤、器官移植、恶性肿瘤等疾病得以有效治疗的重要保障,更是重型再生障碍性贫血、重型地中海贫血及镰刀形红细胞贫血等疾病骨髓移植之外唯一有效和维持患者生命的治疗手段。目前,临床使用的红细胞等血制品仍依赖于献血志愿者外周血捐献,然而,全球献血量中存在供给和需求的不平衡,输血存在血液相容性及感染的风险。在献血志愿者之外找到更为充足、安全、经济的血液替代来源一直是世界范围内的重要研究方向。在过去的几十年里,许多研究小组已经建立了体外诱导包括人骨髓、外周血、脐带血等来源的造血干/祖细胞分化为红细胞的方法,并在免疫缺陷小鼠模型及非人类灵长类动物（NHP）模型中证实了体外培养得到的红细胞的生理。然而目前已有的诱导方法所获得的红细胞在脱核效率与扩增效率方面都远未达到临床应用的要求。因此,只有充分阐明人红细胞分化、增殖各调控层面及信号通路间的相互作用与机理,尤其是终末期成熟的调控机制,才能突破目前的技术瓶颈,建立并优化大规模体外诱导分化的方法,提高分化终末期脱核成熟及扩增效率,使之尽早用于临床,同时为治疗地中海贫血、慢病性贫血等疾病中出现的无效红系造血,改善患者的贫血症状提供新的药物作用靶点与思路。目前自噬被认为是红细胞终末成熟的主要机制。自噬相关的信号调节通路非常复杂,mTOR信号通路是其中最主要的负性调节因子。雷帕霉素是最早发现的mTOR抑制剂,已经被FDA批准用于临床。然而,雷帕霉素到底是治疗贫血还是导致贫血,存在争议。我们前期在动物体内的研究发现,mTOR信号通路是在红细胞分化早期造血干细胞分化和增殖中所必须的;体内和体外对mTOR通路的抑制显示可部分纠正缺陷红细胞成熟的异常。但由于受实验材料及手段的限制,mTOR在人红细胞分化与终末期成熟过程中的作用及分子机制,目前尚缺乏足够的直接证据。目的:1)观察人脐带血来源的造血干细胞向红系定向分化过程中,mTOR信号通路对细胞增殖,分化和成熟的影响。2)研究mTOR通路调控人脐带血来源的造血干细胞的红系定向分化的机制。3)优化体外诱导人造血干/祖细胞红系定向分化的培养体系,提高红细胞的终末期成熟效率。方法:1)采用密度梯度离心与免疫磁珠法分离纯化人脐带血CD34+细胞。2)采用无血清无饲养层体系体外诱导人脐带血来源的CD34+细胞向红细胞定向分化。3)实验分组:在红系定向分化不同时间点（Day8,Day11,Day18,Day22,Day44）,向培养基中加入50n M雷帕霉素作为药物处理组,以未处理组和DMSO组（溶剂组）作为对照组。4)通过流式细胞术检测进行细胞表面抗原CD34、CD36、CD71和CD235a染色,以分析分化进程;CFDA SE染色后比较细胞增殖能力;PI染色后比较细胞周期;Brd U染色后进一步验证细胞增殖和细胞周期的结果;Annexin V-FITC/7-AAD染色检测凋亡率;DRAQ5染色后,检测脱核细胞比例;CD235a和Mito Tracker染色后,流式细胞术检测红细胞中线粒体的清除;H2DCFDA染色后检测活性氧水平;JC-1染色检测成熟末期红细胞线粒体膜电位变化。5)Wright-Giemsa染色观察分化过程中细胞的形态,May-Grünwald-Giemsa（MGG）染色观察挑出的BFU-E/CFU-E细胞形态及表型。6)CD235a和Mitotracker染色后,用激光共聚焦检测CD235a阳性细胞中Mitotracker的平均荧光强度。Lysotracker和Mitotracker染色后,用激光共聚焦检测检测红细胞中线粒体自噬。7)RT-q PCR检测珠蛋白基因,红系分化特异性基因,脱核相关基因及mTOR下游基因及自噬相关基因的转录水平。8)Western blot检测脱核相关基因,mTOR下游基因及自噬相关基因的蛋白表达。结果:1)从人脐带血中纯化得到CD34+细胞,并成功诱导其向红细胞分化。2)集落形成实验显示,在分化早期,雷帕霉素处理细胞后,BFU-E和CFU-E-E数目显着降低,尤其是BFU-E形成明显被抑制。3)在分化早期,雷帕霉素处理细胞后,细胞增殖被抑制,细胞周期停滞在G0/G1期,凋亡和分化进程未受影响,同时检测发现G1-S过渡调控基因p27的m RNA水平和蛋白水平升高。4)在红系分化中、后期,雷帕霉素处理使红细胞脱核率增高,珠蛋白转录水平增高,活性氧水平降低,且促进了成熟末期红细胞内的线粒体清除。5)雷帕霉素处理细胞后,mTOR通路的下游靶蛋白（p70S6及S6）磷酸化水平降低,mTOR通路被抑制,大部分自噬相关基因的m RNA和蛋白水平升高。结论1)我们在体外建立的无血清无饲养层培养体系可成功诱导人脐带血CD34+细胞向红细胞定向分化,且在我们建立的人脐带血CD34+细胞红系分化体系中,于分化的第18天加入雷帕霉素处理可明显提高红细胞终末期脱核成熟的效率而不降低细胞数量。2)mTOR信号通路对于人红系早期分化与细胞增殖是必需的,mTOR通路抑制导致了细胞周期停滞与细胞增殖抑制,从而抑制了BFU-E与CFU-E等红系集落的形成,但凋亡率和分化进程未有明显改变。3)在人红系分化中后期,mTOR通路的抑制使自噬过程增强,从而提高了红细胞的脱核效率,促进了线粒体清除,并最终促进了红细胞的终末期成熟。
文海若,任璐,罗飞亚,汪祺[2]（2019）在《比较细胞松弛素A与B在胞质分裂阻断法微核试验中的应用》文中指出目的比较细胞松弛素A（Cyto A）及细胞松弛素B（Cyto B）对微核试验常用细胞系——中国仓鼠肺成纤维细胞（CHL）毒性及对体外微核试验结果的影响。方法在荧光显微镜下观察由微丝组成的应力纤维结构,并使用CHL开展胞质分裂阻断法微核试验,比较两者对多核细胞率及含微核双核细胞率的影响。结果不同浓度的Cyto A和Cyto B与细胞作用24 h后,与对照组（26%±7%）比较均可诱导多核细胞形成率的显着升高（Cyto A及Cyto B 3.0μg/ml浓度组分别为58%±12%和72%±9%,P <0.001）,且Cyto A在3.0μg/ml浓度条件下诱导的平均多核细胞率与1.5μg/ml浓度组比较有所降低。Cyto A处理组在MMC浓度分别为0、0.1和0.3μg/ml时的微核率分别为0.25%±0.16%、 1.98%±0.59%和3.80%±0.90%;而Cyto B处理组在相同MMC浓度时的微核率分别为0.32%±0.16%、2.50%±0.61%和5.05%±1.09%。结论虽然Cyto B的多核细胞造模效果略优于Cyto A,两者均可有效用于胞质分裂阻断法微核研究。研究结果将为相关领域研究者提供可借鉴的实际经验。
张文霞,康宏,吕玮,李燕梅,钟妮,包广洁[3]（2016）在《细胞松弛素B对山羊颞下颌关节盘细胞及细胞骨架肌动蛋白的影响》文中研究指明目的:肌动蛋白作为细胞骨架的重要结构蛋白,其与细胞形态和功能有着密切关系。因此本实验通过肌动蛋白抑制剂-细胞松弛素B检测细胞骨架完整性与山羊颞下颌关节盘细胞功能变化的关系。方法:检测不同浓度的细胞松弛素B对关节盘细胞增殖及形态的影响并得出最适浓度;观察最适浓度作用后细胞凋亡、粘附及肌动蛋白形态和mRNA表达的变化。结果:2μmol/L浓度的细胞松弛素B对关节盘细胞增殖活性具有明显抑制作用,但随培养时间延长抑制率明显降低,无促进凋亡作用;细胞粘附率明显下降;与对照组相比,处理组细胞突起结构逐渐消失,形态变圆,肌动蛋白纤维丝明显的断裂,荧光强度降低;肌动蛋白mRNA表达降低。结论:细胞松弛素B可能是通过破坏肌动蛋白的结构抑制了颞下颌关节盘细胞形态及功能。
张文霞[4]（2016）在《细胞松弛素B及单轴拉伸应力对山羊颞下颌关节盘细胞影响的体外研究》文中研究指明目的:采用肌动蛋白抑制剂-细胞松弛素B（Cytochalasin B,CB）及单轴拉伸应力作用于山羊颞下颌（Temporalmandibular joint,TMJ）关节盘细胞,观察细胞骨架蛋白及细胞功能的变化,为组织工程化颞下颌关节盘的研究提供必要的研究基础。方法:1、体外分离、培养及鉴定原代山羊TMJ关节盘细胞,传至P1代,液氮内冻存备用。2、检测不同浓度的CB对TMJ关节盘细胞增殖能力的影响,并筛选得到最适浓度,用于后期实验。3、观察单轴循环拉伸应力作用下TMJ关节盘细胞生长及形态的变化,确定合适的拉伸应力参数。4、免疫荧光染色检测CB和单轴拉伸应力作用后TMJ关节盘细胞形态和细胞骨架的变化。5、实时荧光定量PCR检测CB和单轴拉伸力作用后TMJ关节盘细胞肌动蛋白、微管蛋白、波形蛋白、糖胺多糖及Ⅰ型胶原mRNA的表达。结果:1、TMJ关节盘细胞培养及鉴定:原代培养的山羊TMJ关节盘细胞生长较慢,10天左右可贴壁生长至80%-90%,细胞从组织块爬出生长;但随传代次数增加,细胞生长速度加快,约7天可进行下次传代;细胞形态分为两种,长梭形和多边形,且数量上以长梭形为主;甲苯胺蓝染色（糖胺多糖）及免疫组化染色（Ⅰ型胶原）均为阳性。2、CB浓度筛选:不同浓度的CB均对TMJ关节盘细胞增殖能力具有抑制作用,但2μmol/L组随培养时间延长细胞的增殖能力逐渐恢复;而≧4μmol/L各组细胞均未出现增殖,因此2μmol/L更适合后期实验的研究。3、拉伸应力参数:2%拉伸比（0.5Hz,1小时/天,连续3天）作用可促进TMJ关节盘细胞增殖及调整细胞生长方向,细胞的生长方向一致,且与力学加载方向垂直;而4%和8%拉伸比作用对TMJ关节盘细胞的生长具有抑制作用,随拉伸应力的作用时间延长细胞逐渐脱壁凋亡。4、细胞形态及骨架的变化:CB（2μmol/L）作用后TMJ关节盘细胞突起结构逐渐消失,细胞形态变圆,肌动蛋白纤维丝明显的断裂,荧光强度降低;拉伸应力（拉伸比为2%）可使TMJ关节盘细胞形态变得更狭长,肌动蛋白和微管蛋白纤维丝增粗,荧光染色强度增加,而波形蛋白纤维丝稀疏,荧光染色强度降低。5、RT-PCR检测:CB（2μmol/L）作用后细胞的肌动蛋白和Ⅰ型胶原mRNA表达分别下降了57%、41%,糖胺聚糖mRNA表达上调了137%;2%拉伸应力作用后细胞肌动蛋白、微管蛋白及糖胺聚糖mRNA的表达分别上调了90%、71%、83%,Ⅰ型胶原mRNA变化不明显,而波形蛋白mRNA的表达下降了57%。结论:1、细胞松弛素B对山羊TMJ关节盘细胞形态、表型及细胞基质合成都具有明显调控作用,抑制肌动蛋白的表达可能有利于自组装的颞下颌关节盘的构建。2、TMJ关节盘细胞只能适应低拉伸比的单轴拉伸应力,且应力作用下细胞的表型、生长方向、细胞骨架及胞外基质的合成均可产生适应性作用效果。
王婕[5]（2015）在《Wnt-10a在红系分化中的功能研究》文中提出红系分化是生物体内复杂又精细的重要调控过程之一,涉及机体的发育,干细胞分化与体细胞起源,细胞癌变的调控失序等。红系分化的过程由众多的转录因子,小分子物质如piRNA和microRNA,各种信号通路的综合调控协同进行。当其中的某种调控方式出现异常,则可能会使得造血干细胞的正常分化机制失调,细胞过度增殖导致疾病甚至癌症的发生。一系列关于白血病的相关研究中已发现,在某些小分子物质如亚铁血红素、二甲基亚砜、丁酸钠等的诱导下白血病细胞能够发生逆转,表明细胞的分化状态可以被人为地调控。至今为止,主要是通过发现和研究与分化相关的蛋白质（如细胞分化因子）的功能来解析红系分化调控机制。蛋白质组学的思路与技术以及基因芯片等技术为此研究提供了关键的支撑作用,也为研发能使白血病细胞自癌变状态脱离,进入可控正常分化凋亡途径并且适用于临床的的诱导剂提供了实验依据。各种白血病细胞如MEL细胞与K562是研究细胞分化的重要模型细胞系,在某些诱导剂存在的体外培养条件下,这些细胞能够进入红系分化途径,重新表达分化后特有的红系标志蛋白如血红蛋白和血型糖蛋白A等。本文前期利用双向凝胶电泳/质谱蛋白质组学技术,通过比较亚铁血红素（Hemin）诱导人白血病细胞K562分化前后的差异蛋白质组,得到了数百种差异表达的蛋白质。Wnt是一大类与胚胎发育,干细胞维持与分化,细胞增殖、迁移、极性决定、死亡及癌症发生有关的分泌型糖蛋白家族。由于Wnt信号转导途径也参与了干细胞的分化调控,而Wnt-10a又是在K562细胞诱导前后呈现明显差异表达的蛋白质。为了进一步研究Wnt-10a在红系分化中的功能及其与红系分化的关系,本文通过Western Blot,半定量PCR,Real-Time PCR对Wnt-10a在K562细胞诱导分化过程中表达量的变化进行分析,又通过免疫细胞化学研究了Wnt-10a蛋白在细胞中的定位情况,同时利用MTT实验对诱导分化的K562细胞活性变化进行了检测。此外,通过构建Wnt-10a重组过表达载体来提高K562细胞中Wnt-10a的表达量后进行细胞诱导分化能力和Wnt信号途径中关键因子蛋白水平的检测,加入Wnt信号传导途径的激活剂来进一步研究Wnt信号途径对红白血病细胞诱导分化所产生的影响。结果表明:在Hemin诱导K562细胞分化过程中,Western Blot和半定量PCR分析均发现细胞中的Wnt-10a蛋白表达量和mRNA量都出现了短暂下降后回复的趋势,于此同时,也在K562诱导分化的过程中Wnt-10a向胞膜迁移。而Western Blot、半定量PCR与Real-Time PCR都证实了在Hemin诱导K562细胞红系分化的过程中,Wnt蛋白所参与的三条信号途径中的关键因子表达水平均有着不同程度的变化,说明Wnt信号通路在红系分化中起着重要的作用。使用Wnt信号通路抑制剂后,诱导分化过程中的细胞增殖活力提高情况,Wnt-10a过表达后,K562被Hemin诱导分化的能力也有了提高,并且Wnt经典信号途径的关键因子表达水平也有上升,上述两点同样从另一个侧面证实Wnt信号通路对于白血病的发生有着显着影响。上述的研究结果表明Wnt-10a乃至Wnt信号通路对哺乳动物细胞红系分化的作用具有值得继续深入探讨的价值。也为进一步揭示细胞红系分化机制的研究打下了基础。
万培红[6]（2015）在《基于P-gp靶点天然小分子化合物DHA和SM抗肿瘤多药耐药作用及其机制的研究》文中提出目前,人类生存环境改变,在一些不利的外部环境作用下,肿瘤的发病率正在逐步上升,成为严重威胁人类健康、高死亡率的常见疾病。化学治疗是临床上治疗肿瘤的最常见和有效的策略。然而,肿瘤多药耐药（MDR）已成为临床化疗失败的重要原因,故抗耐药研究和发现耐药逆转剂成为抗肿瘤研究的重要方面。来源于自然界的动植物、微生物以及海洋生物的天然药物是新药研发的重要源泉。多酚化合物是存在于自然界的最为普遍的天然化合物,双联苄（Bisbibenzyl）是苔鲜植物中特有的一类天然多酚类化合物,具有昆虫拒食、抗微生物、抗氧化、抗真菌、细胞毒、植物生长调节和抗血小板凝集等显着而广泛的生物学活性。近期研究报道表明,双联苄化合物可以作用于P-糖蛋白、环氧合酶等靶点产生生物学活性。目前,已从苔鲜植物中分离得到了许多具有耐肿瘤多药耐药的活性化合物。本论文的研究对象之一Dihydroptychantol A （DHA）是山东大学天然药物研究所从苔藓植物狭叶花萼苔中得到的新型联苄化合物。该化合物已经被全合成,同时也证实了其抗真菌活性。为了研究该化合物的其他生物活性,我们首先利用多种多药耐药细胞株和其亲本的敏感细胞株,用MTT法筛选了包括双联苄在内的多个多酚化合物的逆转肿瘤多药耐药作用,结果发现DHA的细胞毒性较低（对K562/A02、K562细胞株的IC50均大于40μM）,却能明显逆转多药耐药肿瘤细胞株对阿霉素的耐药性。随后,我们进一步展开了DHA在体外逆转MDR作用机制的研究。以多药耐药的阿霉素抗性的K562/A02细胞为试验对象,研究了DHA及其衍生物（化合物1-3）的抗肿瘤活性。MTT试验结果表明,DHA在四种化合物中的抗肿瘤活性是最强的；流式细胞仪检测结果表明,不同浓度的DHA处理K562/A02细胞后,阿霉素和罗丹明123在K562/A02细胞中的累积明显增加。同时还减少了罗丹明123的泵出量,说明DHA抑制了P-gp的外排泵功能。用流式细胞仪和RT-PCR对P-gp的表达进行分析。结果发现DHA处理K562/A02细胞24小时,P-gp蛋白表达和MDR1 mRNA的表达均减少,具有浓度依赖性。但DHA对其亲本细胞K562细胞无明显影响。以上试验结果证实,DHA能够有效地逆转肿瘤多药耐药,该作用与其抑制P-gp的功能、蛋白表达和降低MDR1 mRNA水平有关。本论文的另一部分内容是研究从中药茄属类植物龙葵中分离得到的甾体生物碱类化合物龙葵碱Solamargine（SM）单体对多药耐药细胞生长的抑制作用及机制探讨,结果发现该化合物具有高效低毒的特点。这一部分实验观察了化合物SM对三种耐药细胞K562/A02, KB/VCR和H460/paclitaxel （Taxol）的细胞毒性和相关机制。MTT结果显示,SM能明显抑制三种耐药细胞株的增殖,与对应的敏感细胞株K562,KB和H460相比具有相同甚至更敏感的生长抑制作用。DAPI核染色和流式细胞术实验结果发现,SM可显着促进耐药K562/A02细胞凋亡。RT-PCR结果显示SM能够下调MDR1的mRNA水平,同时采用流式细胞术检测发现SM能够抑制P-gp的表达水平。此外,蛋白印记实验结果显示SM处理的耐药细胞中bcl-2和actin蛋白表达降低,bax蛋白表达升高。以上结果提示SM能够明显诱导MDR肿瘤细胞的凋亡,这与肌动蛋白裂解和MDR1表达下调有关。这种化合物值得作为一种可以绕过MDR机制的用于治疗MDR肿瘤的潜在药物进行深入的研究。天然药物在癌症的化疗中扮演着非常重要的角色。本论文的两种天然产物DHA和SM都具有抗肿瘤多药耐药作用,但机制不同,都是具有潜在开发价值的抗癌先导物,值得更进一步的研究。
丁冲[7]（2014）在《稳恒磁场对细胞电磁特性和生物学效应的影响》文中研究指明稳恒磁场（static magnetic fields，SMFs）是强度恒定的一种磁场，适合作为磁生物学研究的切入点。前期研究显示SMFs对不同细胞具有不同的生物学效应，与磁场作用的时间，强度，以及细胞类型有关。临床上发现SMFs对肿瘤生长具有抑制或协同杀伤作用，对骨骼健康具有促进生长和促进骨折愈合的维护作用。细胞作为生物体的组成和行使功能的最小单位，可以看作是由各种大分子、小分子和离子靠电磁相互作用组成的一个有机整体，其本身具有一定的电磁特性。磁场对细胞的作用可看作是外界磁场与细胞本身电磁特性耦合的结果。本文从细胞的电磁特性角度研究SMFs对细胞的作用。结果发现SMFs对生物细胞的作用与细胞的介电特性和铁磁性金属元素含量有关，且不同的细胞响应各异。论文首先进行不同强度SMFs对成骨细胞和白血病细胞生物学效应和胞内金属元素含量影响的研究。实验以贴壁生长的成骨细胞MC3T3-E1和悬浮生长的白血病细胞K562为材料，分别研究了500nT亚磁场、200mT中强磁场、50μT地磁场和16T强磁场四种强度的SMFs对细胞生长、金属元素含量的影响。结果显示K562细胞和MC3T3-E1细胞对相同的磁场处理条件具有不同的响应。与正常地磁场环境相比，中强磁场可显着抑制K562细胞增殖，细胞周期被阻滞在G0/G1期，胞内活性氧水平升高；而强磁场可显着促进MC3T3-E1细胞增殖，细胞周期在S期和G2/M期分布增多，胞内活性氧水平升高，且胞内Fe元素含量显着升高、Cu元素含量显着降低。其次，论文建立白血病细胞和成骨细胞介电特性的检测方法，并研究SMFs作用下两种细胞介电特性的变化。实验设计并制作了用于悬浮生长的白血病细胞介电特性检测的圆柱形测量池，和用于贴壁生长的成骨细胞介电特性检测的平行导线测量池。采用电流回路分析的方法对两种测量池的浮游电容、残余电感和电极极化误差进行校正和消除。针对两种细胞的生长方式不同，建立了相应的介电特性检测的方法，并检测了SMFs作用下细胞介电特性的变化。结果显示亚磁场对K562细胞悬浮液的介电常数和电导率无明显改变，但是显着影响其介电参数。亚磁场处理4h，介电增量显着升高，低频电导率也显着改变，处理组的变化随时间的增加呈现波动性。中强磁场作用后K562细胞悬浮液电导率变化较大，且弛豫时间显着变化。弛豫时间改变可能与细胞悬浮液电导率的变化，以及中强磁场抑制K562细胞增殖有关。中强磁场处理后，MC3T3-E1细胞的形态无明显变化，但其介电特性随接种密度和作用时间的不同产生不同的改变。其中受中强磁场作用，细胞电容和电导的变化大约呈现以细胞周期为周期的波动性。该变化可能与细胞所处周期的骨架状态、蛋白质合成等因素有关。最后，论文建立了动物组织介电特性的检测方法，并进行了SMFs作用下大鼠组织介电特性检测的初步研究。实验采用亚磁场和后肢去负荷环境对大鼠进行处理，4周后取大鼠全血、腓肠肌、睾丸和脾脏组织进行介电特性检测，采用Cole-Cole模型拟合介电参数，并对大鼠全血进行血细胞容积检测。结果表明不同的组织的介电特性对同样处理条件的响应不一样。全血的介电特性对亚磁场作用具有明显的响应。与对照组相比，大鼠全血的介电常数和电导率受亚磁场处理后升高，增幅最高达19.6%和19.1%。介电参数拟合的结果显示介电增量显着升高，弛豫时间显着延长。对血细胞容积的检测结果提示大鼠全血介电特性的改变不是由血细胞浓度的改变引起，而是与细胞膜、血浆等组分的电特性改变相关。后肢去负荷不影响腓肠肌的介电特性，但是亚磁场却能显着增加腓肠肌的低频电导率。睾丸组织的介电特性在后肢去负荷处理后变化显着，介电增量显着增加，弛豫时间显着延长，低频电导率显着增强。该变化与后肢去负荷条件下睾丸组织的萎缩有关。亚磁场单独作用不改变睾丸的介电特性。脾脏组织介电特性受亚磁场或后肢去负荷条件作用变化均不明显，但是亚磁场和复合处理环境能显着延长了脾脏组织的弛豫时间。综合以上的研究表明SMFs对生物细胞的作用与细胞的介电特性以及金属元素含量相关，因此，对生物电磁特性的研究可为从物理角度解析磁场的作用机制提供理论和实验支持。
蒋春洁[8]（2014）在《海南粗榧内生真菌抗肿瘤活性菌株筛选》文中研究指明本文以我国珍稀药用植物海南粗榧为研究材料,对分别采自海南省热带植物园、海南省尖峰岭国家自然保护区、海南省霸王岭国家自然保护区的海南粗榧树皮、树枝、树叶和树根样品,进行了内生真菌的分离,并纯化保藏,对其发酵产物进行了抗肿瘤活性筛选,以期望找到可以产三尖杉酯碱类或其他抗肿瘤活性物质的内生真菌,为开发新的药物资源提供依据。经过分离纯化,并根据菌落形态分类,挑选出247株海南粗榧内生真菌,其中海南省热带植物园36株,尖峰岭自然保护区68株,霸王岭自然保护区143株。采用MTT法对其发酵液抗肿瘤活性进行了分析。共发现32株菌株对人慢性粒白血病细胞K562具有抑制活性,占测试菌株总数的12.96%。选择其中具有较高抑制活性且形态差异显着的9个菌株,测试其乙酸乙酯提取物对K562、NB4、HL-60、HepG-2和LoVo细胞的抑制活性,进行抗肿瘤活性复筛。结果显示,9株菌株发酵液的乙酸乙酯提取物对K562、NB4、HL-60和HepG-2细胞呈现出不同程度的抑制活性：9株内生真菌均表现出对2种以上的指示肿瘤细胞株有细胞毒活性。其中,BWL6127对K562细胞的抑制活性最强,IC50值为3.582μg/mL; ZWY1021对NB4细胞的抑制活性最强,IC50值为29.750μg/mL; JFL3007a对HL-60细胞的抑制活性最强,IC50值为35.075μg/mL. JFL3007a、BWL6045是表现出对HepG-2细胞有活性的仅有的两株菌株。9株菌中,JFL3007a对4种肿瘤细胞的IC50值都在40μg/mL以下。所有菌株乙酸乙酯提取物在实验浓度条件下,均未对LoVo细胞显示出抑制活性。采用HPLC-MS的方法对菌株JFL3007a和BWL6045的发酵代谢产物进行初步分析。菌株JFL3007a含有22种主要化合物,其中,2’-乙酰白芷素、异苦鬼臼酮可能为其主要的抗肿瘤活性物质；菌株BWL6045含有23种主要化合物,其中,8-p-乙氧基白术内酯Ⅲ、O-甲基唐松草檗碱可能为其主要的抗肿瘤活性物质。对菌株JFL3007a和BWL6045的菌落及显微形态特征的分析显示,两者均为半知菌亚门,腔孢纲,球壳孢目中的拟茎点霉属（Phomopsis）,为第一次在海南粗榧植物中分离得到。
李婧琦,刘楠,梁瑞,佟志国,顾云鹤,祝继原,戚基萍[9]（2014）在《细胞松弛素B对U87细胞增殖及凋亡的影响》文中进行了进一步梳理目的研究细胞松弛素B（CB）对人胶质瘤细胞系U87细胞增殖及凋亡的影响及机制。方法采用CCK-8试剂盒检测不同浓度的CB对胶质瘤细胞系U87细胞增殖的影响并得出一个最适时间及半抑制浓度（IC50）。观察最适半抑制浓度处理的细胞其透射电镜下的细胞形态及微丝改变。流式细胞术Annexin-Ⅴ-FITC/PI双染检测U87细胞的凋亡情况。结果不同浓度的CB对U87细胞的抑制效应呈时间及剂量依赖性。CB作用于U87细胞的最适作用时间为72 h,其最适半抑制浓度为2.694×10-5mol/mL。可诱导（12.667±1.159）%的细胞凋亡。电镜显示细胞内微丝结构,微丝断裂,出现大量短棒状微丝结构。结论 CB可能是通过破坏胶质瘤细胞质内微丝结构抑制U87细胞增殖,促进胶质瘤细胞凋亡。
王妮莎[10]（2013）在《水通道蛋白1基因对白血病K562细胞红系分化的影响》文中指出研究背景和目的白血病是世界范围内常见的血液系统恶性肿瘤,是一种细胞分化障碍性疾病,其核心问题是白血病细胞失去进一步分化为成熟细胞的能力而停滞在细胞发育的不同阶段。人红白血病细胞株K562最初源于一位慢性髓性白血病患者的胸膜渗出液,K562细胞携有Ph染色体t（9；22）（q34；q21）,9号染色体abl基因与22号染色体bcr基因由于染色体异常重组形成bcr/abl融合基因,翻译产生P210蛋白,该蛋白是致病的主要原因,其具有增强酪氨酸激酶的活性。K562细胞在体外可被诱导向红系分化,表现为抑制该细胞的恶性增殖能力,以及具有相应的红系成熟标志。以β-珠蛋白是否表达来判断其是否真正的向红系细胞方向分化。研究证明,小鼠红白血病细胞（MEL）、K562细胞、人早幼粒白血病HL-60细胞等造血系统肿瘤细胞,都可以通过诱导分化剂在体外促进其向终末方向分化,并表达终末分化产物,从而使这些肿瘤细胞失去恶性增殖的能力。因此利用诱导分化物使癌细胞的增殖和基因的活动趋于正常,使基因表达亦趋于正常,为肿瘤的治疗领域提供了新策略。目前诱导分化疗法是肿瘤研究的新领域,尤其是白血病的治疗,使恶性肿瘤细胞能够在体内外分化诱导剂的作用下向正常细胞方向分化逆转。K562细胞是体外研究肿瘤细胞恶性表达调控的极好模型,因为他能够向多种血细胞系方向分化。因此分化策略主要是将K562细胞向红系方向诱导分化。其中,全反式维甲酸诱导分化治疗已成为治疗急性早幼粒细胞白血病（Acute promyelocytic leukemia, APL）的首选手段。随着对白血病诱导分化机制的深入研究和动物实验的开展,诱导分化疗法将成为白血病临床治疗的主攻方向,但目前仍有诸多问题阻碍着其应用：1、诱导分化的具体机制尚未明确；2、诱导分化剂本身毒副作用大。因此白血病诱导分化相关基因或治疗靶点的发现将是解决这些问题的突破点。水通道蛋白（Aquaporin, AQP）是一组小分子跨膜蛋白家族,参与水的快速跨膜转运。对于水通道蛋白的认识最开始主要是基于AQP1的结构分析,AQP1是第一个被发现的AQPs蛋白,Agre因此获得了2003年的诺贝尔化学奖,之后陆续发现哺乳动物水通道家族有13个成员（AQPO-AQP12）,其基因结构、基因表达调控、染色体定位、蛋白结构、组织分布和生理功能均得到了较为深入的研究。AQP1能使红细胞适应环境巾血浆的渗透压变化,通过调节水的运输使红细胞膨胀或皱缩。促红细胞生成素可使红细胞容积瞬间增高,胞膜AQP1密度也大大增高。研究发现氧气除了在红细胞膜上自由扩散,也能够在AQP1运输和扩散。因此AQP1既是红细胞胞内胞外水进出交换的通道,同样也是红细胞运输和交换气体的通道,AQP1不仅是水通道蛋白,还是氧气氧分子进出细胞的通道。大量研究显示AQP1的功能或表达异常与多种肿瘤的发生关系密切。用丁酸盐诱导HEL细胞向红系分化后,AQP1的转录表达明显增加,在人红白血病K562细胞中也出现了同样的结果。重要的是在AQP1启动子巾包含CACCC元件,该元件具有红细胞特异性,并且AQP1启动子的活性在K562和HEL细胞巾是非红系细胞的24倍。无论是9-顺式维甲酸（9-cis retinoic acid）还是全反式维甲酸（all-transretinoic acid）, AQP1启动子中含有的维甲酸（retinoic acid, RA）反应元件可通过与RA结合诱导人红白血病细胞细胞表达AQP1,并且随着RA剂量增加,AQP1的表达明显增加,维甲酸诱导的AQP1蛋白主要在细胞质膜上表达。另外,还有研究发现除了RA,二甲亚砜和皮质类固醇亦可诱导小鼠MEL细胞表达AQP1。以上研究可以看出多种促红系分化的药物都可增强AQP1的表达,说明红白血病细胞的红系分化调控和AQP1的表达可能有着密切联系。目前对于AQP1基因的功能研究还多局限于与液体吸收或分泌有关的上皮细胞及可能协同水跨细胞转运的内皮细胞中。AQP1高表达在红白血病细胞向红系分化过程的作用如何及其具体机制,有待进一步研究。因此在以前的研究基础上,结合国内外文献资料,首次将AQP1作为靶基因,构建AQP1基因的真核表达重组载体,在K562细胞中稳定表达,同时采用逆转录病毒载体shRNA表达系统对K562细胞中AQP1基因表达进行长效抑制,研究AQP1的高表达和表达抑制对K562细胞向红系分化过程及生理生化各项指标的影响,深入研究AQP1基因在细胞诱导分化中的功能,以期进一步明确AQP1基因与白血病发生机制之间的关系,为临床诱导分化治疗白血病提供新的治疗靶点。目的确定AQP1与K562细胞红系分化的相关性。构建稳定表达AQP1基因的K562-AQP1细胞系以及稳定抑制AQP1基因表达的K562-shAQP1细胞系。比较三种不同细胞系K562、K562-AQP1、K562-shAQP1在肿瘤细胞诱导分化、生长增殖等方面的差异,明确AQP1基因的在红系分化中的新功能。应用生物信息学方法比较K562细胞与AQP1表达增高或降低的K562细胞中大量相关基因表达的变化,从而发现一组疾病相关基因在特定条件下的相互作用,为临床诱导分化治疗白血病提供一组新的治疗靶点。方法1.使用RA处理K562细胞,收集24h、48h及72h的细胞,同时设立未加RA的K562细胞为对照组。采用RA诱导K562细胞向红系分化之后,通过Real-time PCR法检测红系指标γ-globin的表达变化；分光光度法检测血红蛋白（hemoglobin）含量,研究RA对K562细胞红系分化的影响。为了研究APQ1基因与K562细胞红系分化的关联,使用Real-time PCR法、蛋白质印迹法检测RA诱导后K562细胞AQP1mRNA和蛋白表达水平。2.以人脑cDNA文库为模板,通过PCR扩增出AQP1基因的编码序列,构建pBABE-puro-AQP1真核表达载体；转染K562细胞,筛选建立稳定过表达AQP1基因的K562细胞株（K562-AQP1）; real-time PCR法、细胞免疫荧光染色法及蛋白质印迹法检测AQP1转录和蛋白表达水平。通过MTT法检测细胞生长增殖、real-time PCR法检测红系指标γ-globin表达和分光光度法检测血红蛋白含量,研究AQP1过表达对K562细胞红系分化、增殖的影响。3.设计特异AQP1shRNA序列,构建pSUPER-retro-puro重组质粒,转染K562细胞,筛选建立稳定抑制AQP1基因表达的K562细胞株（K562-shAQP1）; real-time PCR法、细胞免疫荧光染色法及蛋白质印迹法检测AQP1转录和蛋白表达水平。通过Real-time PCR和紫外分光光度计法比较K562-shAQP1细胞株与对照组细胞在RA诱导后红系指标γ-globin和hemoglobin的表达,研究AQP1在RA诱导K562细胞红系分化中的作用,能否阻断RA诱导的K562细胞红系分化。4.比较三种不同细胞系K562、K562-AQP1、K562-shAQP1在肿瘤细胞诱导分化、生长增殖等方面的差异,明确AQP1基因的在红系分化中的新功能。5.利用K562细胞和AQP1过表达的K562细胞所生成的全基因组表达谱芯片,获取共同表达差异基因,然后应用GO、Pathway等生物信息学方法比较相关基因表达的变化,从而发现一组白血病相关基因在特定条件下的相互作用,为临床诱导分化治疗白血病提供一组新的治疗靶点。6.本文统计分析采用SPSS13.0。计量资料的统计描述用均数±标准差的形式给出,两组比较采用两独立样本t检验,多组比较的情况下用one-way ANOVA,重复测量资料采用重复资料的方差分析；两两之间的比较,方差齐时用LSD法,不齐则用Dunnett’s T3检验法。检验水准设为P<0.05。结果1.RA体外诱导K562细胞红系分化Real-time PCR检测RA处理K562细胞不同时间后红系分化指标γ-globin mRNA的表达增加,48h时表达增加最显着（可达未加RA处理组的10.05倍）,且差异具有统计学意义（F=20.191,P=0.008）。紫外分光光度计法进行K562细胞hemoglobin含量的测定结果显示,RA诱导后的K562细胞hemoglobin含量较对照K562细胞增加,且随RA作用时间延长含量递增,差异具有统计学意义（F=651.197,P<0.001）。2.AQP1基因表达与K562细胞红系分化的相关性Real-time PCR检测RA诱导K562细胞红系分化后AQP1基因mRNA的表达较对照组均有所增加（24h、48h、72h与对照组相比分别为8.23、12.81、12.57倍）,不同水平间差异具有统计学意义（F=18.834,P=0.009）; Western blot结果也显示AQP1蛋白表达量也随RA作用时间延长而递增。3.AQP1基因稳定过表达与K562细胞红系分化和增殖成功构建AQP1基因的真核表达载体之后,使用免疫组化法鉴定K562细胞中AQP1的表达。AQP1经一抗孵育后用goat anti-rabbit IgG-R荧光二抗显色为红色,DAPI进行核复染显色为蓝色,将抗原显色部分与核染色部分叠加在一起观察抗原表达的变化。结果显示K562-AQP1细胞中红色荧光较对照组K562细胞增强,表明pBaBb-puro-AQP1逆转录病毒载体感染K562细胞后,AQP1蛋白在细胞中的表达增多。Real-time PCR和Western blot检测K562-AQP1细胞中AQP1mRNA和蛋白表达情况。Real-time PCR检测结果显示K562-AQP1细胞中AQP1mRNA的表达较对照组增加,较对照细胞增高700倍以上,且差异具有统计学意义（t=24.845,P=0.002）；Western blot结果显示K562-AQP1细胞中AQP1蛋白表达量也有所增加。Real-time PCR结果显示,在稳定转染AQP1基因真核表达载体的K562-AQP1细胞中γ-globin mRNA的表达较对照K562细胞有所增加（7.369：1）,且差异具有统计学意义（t=24.965,P=0.001）。紫外分光光度计法的测定结果显示,AQP1稳定过表达细胞株血红蛋白含量较对照K562细胞有所增加（增加49%）,差异具有统计学意义（t=26.561,P<0.001）。MTT法检测K562-AQP1细胞的生长曲线结果显示,AQP1过表达组（K562-AQP1）较对照组（K562）细胞的生长速度降低（F=171.36,P=0.001）,说明AQP1在促进K562细胞向红系分化的同时对细胞增殖有抑制作用。4.AQP1基因表达抑制与K562细胞诱导分化筛选建立稳定抑制AQP1基因表达的K562细胞株（K562-shAQP1）之后,细胞免疫荧光染色法检测AQP1在K562细胞巾的表达改变结果显示,AQP1荧光显色为红色,定位在细胞膜上,K562-shAQP1细胞膜上红色荧光较对照组K562细胞有所减少,表明pSUPERretro-puro-shAQP1逆转录病毒载体感染K562细胞后,AQP1蛋白在细胞中的表达受到抑制。用Real-time PCR法检测K562-shAQP1细胞中AQP1基因mRNA的表达结果显示, K562-shAQP1细胞中AQP1mRNA的表达较对照组有所下降,表达量约为对照组的27%,差异具有统计学意义（t=-34.138,P=0.001）；Western blot结果显示K562-shAQP1细胞中AQP1蛋白表达量也有所降低,Bandleade软件分析内对照GAPDH与目的蛋白条带灰度比,抑制效率达89.8%。通过比较K562-shAQP1细胞株与对照组细胞在RA诱导后红系指标γ-globin和hemoglobin的表达,研究AQP1在RA诱导K562细胞红系分化中的作用,能否阻断RA诱导的K562细胞红系分化。用Real-time PCR法检测γ-globin mRNA表达结果显示,RA作用于AQP1表达下调的K562-shAQP1细胞系24h、48h、72h的γ-globin mRNA表达量为2.348、2.926、2.836,与RA处理的对照K562细胞组（6.709、9.561、8.284）相比有所下降,差异具有统计学意义（F=53.062,P<0.001）。紫外分光光度计法的测定结果显示,RA处理的K562-shAQP1细胞系hemoglobin含量与RA处理的对照K562细胞比较也有有所降低,差异具有统计学意义（F=1.736,P=0.177）。当RA诱导K562细胞红系分化时,下调AQP1表达可抑制RA的诱导分化作用。5.应用全基因组表达谱芯片分析AQP1基因对K562细胞红系诱导分化的作用机制本研究重点分析K562组与K562-AQP1组之间的差异表达基因,其中363个基因表达上调,421个基因表达下调。这些差异表达基因的GO分类有317个,分析发现差异基因的生物学途径主要与氧气运输、程序性凋亡以及红系分化等相关；分子功能则与氧气运输活性相关,证实AQP1基因的过表达确实能促进红系分化并且在该进程中发生细胞凋亡；差异表达基因的细胞组成多为血红蛋白复合物,证实AQP1过表达能显着增加K562细胞血红蛋白的表达,表现出红系分化的显着特征。将K562组和K562-AQP1组共同上调和下调的基因经过整理筛选,上传至STRING分析这两组的差异基因所编码蛋白质的相互关系,结果发现有24个基因编码的蛋白质的相互作用主要集中在核心位置。将上述24个基因上传至pSTIING工具,进一步分析这些基因及其转录因子的网络拓扑结构,其中7个差异基因仍然处在重要结点位置,分别是：POLR2L、SOS1、 CDKN1A、PIN1、NCOA3、ATF3、FOS。再根据参与重要分子通路的基因、以及在重要GO term有所富集的基因使用pSTIING工具进行网络图谱的构建,有5个基因位于重要结点位置,分别是：TRIB3、CDKN1A、DDIT3、 ATF3、ALCAM。最终将这12个基因将进行下一步的文献挖掘,以探讨与白血病以及红系分化之间的联系。FACTA文本挖掘工具对10个差异表达基因进行进一步的分析比较,结果发现,其中大部分都与白血病相关,并且大多数基因存在大量的相关文献报道,为白血病红系分化分子靶标的筛选提供明确有力的支持。相关文献挖掘的结果发现FOS、ATF3在白血病中高表达,促进白血病细胞的增殖；SOS1、NCOA3这2个基因经文献查阅跟白血病没有直接关系,但是通过信号通路或者与相关基因融合而参与白血病的发生,在白血病的治疗以及预后起到负面作用；并且这4个基因在本研究巾均发生了下调。另外,与红系分化相关的血红蛋白HBD、HBE1、HBG2、HBQ1在K562-AQP1细胞中均差异表达上调,其中HBD基因的差异表达最显着,因此推测AQP1与血红蛋白表达关系密切,并且在红系分化过程巾存在着共表达作用。预计后期再加以实验验证。下一步再加上AQP1表达抑制的表达谱芯片进行共同研究,从巾再筛选出特异性和实用性更强的基因,作为白血病临床诊断的分子靶标候选基因。还要确定AQP1参与的信号通路以及如何发挥诱导血红蛋白表达的功能。结论本研究通过基因增加、基因抑制、Real-time PCR、Western Blot等分了生物学方法,采用Y-珠蛋白、血红蛋白表达,细胞增殖曲线作为红系分化检测指标,对水通道蛋白1（AQP1基因）在K562细胞红系分化巾的作用进行了研究,取得以下研究结果：1.维甲酸（RA）诱导K562细胞红系分化的过程巾,红系分化指标Y-珠蛋白、血红蛋白表达均明显增加：并且AQP1mRNA及蛋白的表达显着增加。确定了AQP1表达与K562细胞红系分化的相关性；2.通过构建pBABE-puro-AQP1真核表达载体确定了AQP1过表达可以显着促进K562细胞向红系分化,同时抑制细胞增殖。3.AQP1基因的表达抑制可部分阻断RA诱导的红系分化作用,证实AQP1基因在RA诱导K562细胞红系分化过程中发挥重要作用,提示AQP1基因可能作为治疗红白血病新的靶基因。4.以K562-AQP1和K562为对象,利用全基因组表达谱芯片获取差异表达基因进行分析。选取8个与AQP1基因相关的基因,分别是：差异表达下调基因FOS、ATF3、SOS1、NCOA3,以及差异表达上调基因HBD、 HBE1、HBG2、HBQ1。推测这些基因与红系分化相关,预计后期再加以实验验证并进行深入研究。本研究的创新之处1.研究AQP1的表达变化在红白血病细胞红系诱导分化中的作用及机制,国内外未见报道,有明显创新。2.本课题从基因增强、基因抑制正反两个方面研究AQP1的作用,采用高特异性的RNA干扰技术,方法先进,可望发现AQP1在红白血病诱导分化中的新机制。3.应用全基因组表达谱芯片和生物信息学工具筛选到若干红系分化相关基因,下一步拟针对这些基因再加以实验验证,进一步研究AQP1基因对K562细胞红系诱导分化的作用机制,从而发现一组疾病相关基因作为药物筛选靶标。
二、细胞松弛素B对K562细胞脱核作用的观察（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、细胞松弛素B对K562细胞脱核作用的观察（论文提纲范文）
（1）mTOR信号通路在人脐带血造血干/祖细胞红系定向分化中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 输血治疗的重要性及面临的挑战 |
| 1.2 体外制备的红细胞的研究现状 |
| 1.3 自噬是红细胞最终成熟的主要机制 |
| 1.4 自噬与红系分化 |
| 第二章 材料及方法 |
| 2.1 实验仪器及设备 |
| 2.2 实验试剂 |
| 2.3 器械的处理 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.5 统计学方法 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 体外诱导人脐带血造血干祖细胞向红细胞定向分化体系的建立 |
| 3.2 雷帕霉素对人脐带血造血干细胞红系分化早期增殖的影响及机制 |
| 3.3 雷帕霉素对人脐带血造血干细胞红系分化中晚期分化和成熟的影响及机制 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 无血清、无饲养层体系体外诱导人脐血CD34+细胞生成红细胞 |
| 4.2 mTOR在人脐带血来源造血干细胞红系定向分化早期增殖阶段的重要作用 |
| 4.3 mTOR与人脐带血造血干细胞红系定向分化进程 |
| 4.4 mTOR在人脐带血来源造血干细胞红系定向分化中晚期与红细胞成熟的关系 |
| 4.5 总结和展望 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 自噬调控红细胞成熟 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）比较细胞松弛素A与B在胞质分裂阻断法微核试验中的应用（论文提纲范文）
| 1 仪器与材料 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验仪器 |
| 1.1.2 材料与试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 细胞松弛素对微丝的影响 |
| 1.2.1. 1 细胞培养及处理 |
| 1.2.1. 2 染色与固定 |
| 1.2.1. 3 镜下观察 |
| 1.2.2 体外胞质分裂阻断法微核试验 |
| 1.2.2. 1 给药处理 |
| 1.2.2. 2 制片与染色 |
| 1.2.2. 3 镜检指标 |
| 1.3 统计及数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 比较细胞松弛素A与B对微丝的影响 |
| 2.2 比较细胞松弛素A与B对体外胞质分裂阻断法微核结果的影响 |
| 3 讨论 |
（3）细胞松弛素B对山羊颞下颌关节盘细胞及细胞骨架肌动蛋白的影响（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试剂及仪器 |
| 1.2细胞培养及鉴定 |
| 1.3 MTT法筛选CB浓度及细胞增殖检测 |
| 1.4 检测细胞凋亡及粘附 |
| 1.5 Actin免疫荧光染色及半定量分析 |
| 1.6 RT-PCR检测Actin mRNA的变化 |
| 2 结果 |
| 2.1 细胞培养、鉴定及CB对其形态的影响 |
| 2.2 细胞增殖检测 |
| 2.3 细胞粘附及凋亡检测 |
| 2.4 Actin半定量分析及mRNA表达的变化 |
| 3 讨论 |
（4）细胞松弛素B及单轴拉伸应力对山羊颞下颌关节盘细胞影响的体外研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 颞下颌关节概述 |
| 1.1 颞下颌关节的主要组织结构及功能 |
| 1.2 颞下颌关节盘细胞概述 |
| 1.3 颞下颌关节紊乱症 |
| 1.4 组织工程化颞下颌关节盘的研究现状 |
| 2 细胞松弛素 |
| 3 细胞骨架 |
| 4 TMJ关节盘组织工程中力学因素的影响 |
| 4.1 TMJ关节盘的生物力学特性 |
| 4.2 细胞机械力学的研究现状 |
| 实验一 细胞松弛素B对山羊颞下颌关节盘细胞及肌动蛋白骨架的影响 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料及试剂 |
| 2.1 主要试剂 |
| 2.2 主要试剂的配制 |
| 2.3 主要仪器 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 体外分离培养关节盘细胞 |
| 3.2 细胞鉴定 |
| 3.3 筛选CB浓度及细胞增殖检测 |
| 3.4 细胞凋亡检测 |
| 3.5 Countstar自动细胞计数仪检测细胞粘附率的变化 |
| 3.6 肌动蛋白免疫荧光染色及定量分析 |
| 3.7 RT-PCR检测Actin、GAG、ColⅠ的mRNA的变化 |
| 3.8 统计学处理 |
| 4 结果 |
| 4.1 TMJ关节盘细胞培养、鉴定及CB对其形态的影响 |
| 4.2 CB对TMJ关节盘细胞增殖能力的影响 |
| 4.3 CB对TMJ关节盘细胞粘附及凋亡的影响 |
| 4.4 CB对TMJ关节盘细胞Actin、GAG、CollageⅠ的影响 |
| 5 讨论 |
| 实验二 单轴拉伸应力对山羊颞下颌关节盘细胞及骨架蛋白的影响 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料及试剂 |
| 2.1 实验主要的仪器和试剂： |
| 2.2 主要溶液的配制 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 山羊颞下颌关节盘细胞的分离和培养（同实验一） |
| 3.2 单轴拉伸应力作用 |
| 3.3 免疫荧光染色检测细胞骨架蛋白的变化 |
| 3.4 RT-PCR检测：微管、波形、肌动蛋白、GAG及ColⅠ的mRNA表达 |
| 4 结果 |
| 4.1 细胞形态改变 |
| 4.2 LSCM检测3种细胞骨架蛋白形态变化及半定量分析 |
| 4.3 RT-PCR检测微管、波形、肌动蛋白、GAG及ColⅠ的mRNA表达 |
| 5 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 缩略语表 |
| 在学期间研究成果 |
| 致谢 |
（5）Wnt-10a在红系分化中的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究背景、目的及意义 |
| 1.2 红系分化的研究概况 |
| 1.2.1 红系分化与白血病 |
| 1.2.2 诱导分化模型与体外诱导剂 |
| 1.3 Wnt信号转导途径的研究 |
| 1.3.1 Wnt家族 |
| 1.3.2 Wnt信号途径的作用与概况 |
| 1.3.3 Wnt信号通路与肿瘤发生 |
| 1.3.4 药物对Wnt信号通路的作用 |
| 1.3.5 Wnt信号通路与红系分化 |
| 1.4 Wnt-10a蛋白的研究概况 |
| 1.4.1 Wnt-10a的发现及亚细胞定位 |
| 1.4.2 Wnt-10a与肿瘤疾病的发生 |
| 第二章 材料方法 |
| 2.1 实验材料、试剂和仪器 |
| 2.1.1 细胞、菌株以及质粒 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要试剂配制 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 MTT法检测细胞活力 |
| 2.2.3 联苯胺染色检测诱导分化情况 |
| 2.2.4 流式细胞仪检测细胞周期 |
| 2.2.5 免疫细胞化学 |
| 2.2.6 免疫印迹 |
| 2.2.7 半定量PCR |
| 2.2.8 Real-Time PCR |
| 2.2.9 Wnt-10a过表达载体的构建 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 联苯胺染色验证Hemin诱导K562的细胞分化结果 |
| 3.2 Western Blot验证Wnt-10a在Hemin诱导K562细胞过程中量的变化 |
| 3.3 半定量PCR分析Hemin诱导K562过程Wnt-10a的m RNA变化水平 |
| 3.4 Wnt-10a在K562细胞中的定位与诱导分化相关联 |
| 3.5 半定量PCR分析Hemin诱导K562下Wnt信号转导途径关键因子mRNA水平的变化情况 |
| 3.6 Real-Time PCR分析Hemin诱导K562下Wnt信号转导途径关键因子mRNA水平变化情况 |
| 3.7 Western Blot分析Hemin诱导K562下Wnt经典信号转到途径关键因子蛋白水平的变化情况 |
| 3.8 GSK-3β抑制剂能增强K562细胞活性 |
| 3.9 Wnt信号通路的激活对Hemin诱导K562过程细胞活力的影响 |
| 3.10 Wnt-10a高表达K562细胞的筛选、鉴定 |
| 3.10.1 Wnt-10a高表达载体的构建 |
| 3.10.2 Wnt-10a高表达情况的鉴定 |
| 3.11 Wnt-10a高表达后K562细胞的诱导分化情况 |
| 3.12 Western Blot分析高表达Wnt-10a细胞经诱导后Wnt信号途径变化情况 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（6）基于P-gp靶点天然小分子化合物DHA和SM抗肿瘤多药耐药作用及其机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词说明 |
| 第一章 前言 |
| 1 研究背景 |
| 1.1 肿瘤耐药是临床化疗失败的最主要原因 |
| 1.2 肿瘤耐药的主要发生机制 |
| 2 肿瘤细胞产生多药耐药的主要靶点机制及途径 |
| 2.1 P-gp是肿瘤细胞产生多药耐药的主要靶点机制 |
| 2.2 基于P-gp为靶点的抑制剂是逆转肿瘤多药耐药的有效途径之一 |
| 2.3 多酚类中的双联苄化合物以P-gp为靶点发挥逆转肿瘤多药耐药的作用 |
| 3 天然产物库是发现肿瘤耐药逆转剂的宝库 |
| 3.1 双联苄化合物 |
| 3.2 龙葵碱 |
| 第二章 双联苄类化合物DHA逆转肿瘤多药耐药及其机制的研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 细胞株 |
| 1.2 药品及试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 细胞毒性和多药耐药逆转试验 |
| 2.2 细胞内阿霉素蓄积实验 |
| 2.3 RT-PCR方法检测MDR1的mRNA表达 |
| 2.4 流式细胞仪检测细胞P-gp蛋白表达 |
| 2.5 细胞内罗丹明123的蓄积与泵出试验 |
| 2.6 细胞松弛素B预处理后DHA对细胞内罗丹明123蓄积的影响 |
| 2.7 数据分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 DHA及其衍生物对阿霉素细胞毒性的影响以及细胞耐药逆转效应 |
| 3.2 DHA增加细胞内阿霉素的蓄积浓度 |
| 3.3 DHA降低P-gp的表达 |
| 3.4 DHA对细胞内罗丹明123蓄积和泵出的影响 |
| 3.5 细胞松弛素B预处理后DHA对细胞内罗丹明123蓄积的影响 |
| 4 讨论 |
| 第三章 龙葵碱SM对多药耐药肿瘤细胞生长的抑制作用及机制研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 细胞株 |
| 1.2 化学试剂 |
| 1.3 试剂配制 |
| 1.4 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 细胞毒性实验 |
| 2.2 DAPI染色检测细胞凋亡 |
| 2.3 流式细胞仪检测细胞调亡 |
| 2.4 蛋白印迹法检测蛋白表达水平 |
| 2.5 流式细胞仪检测P-gp蛋白表达 |
| 2.6 RT-PCR法检测MDR1的mRNA表达水平 |
| 2.7 免疫荧光染色检测细胞骨架蛋白actin表达水平 |
| 2.8 统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 SM抑制多药耐药肿瘤细胞增殖 |
| 3.2 SM诱导耐阿霉素的K562/A02细胞发生凋亡 |
| 3.3 SM抑制K562/A02细胞P-gp的表达 |
| 3.4 SM抑制K562/A02和KB/VCR细胞中actin的表达 |
| 4 讨论 |
| 第四章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
| 附件 |
（7）稳恒磁场对细胞电磁特性和生物学效应的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 1 绪论 |
| 1.1 稳恒磁场生物学效应及机制研究 |
| 1.1.1 稳恒磁场的来源及表征 |
| 1.1.2 稳恒磁场对细胞生物学行为的影响 |
| 1.1.3 稳恒磁场与癌细胞 |
| 1.1.4 稳恒磁场与骨组织细胞 |
| 1.1.5 稳恒磁场生物学机制研究 |
| 1.2 稳恒磁场在生物学和医学中的应用 |
| 1.2.1 稳恒磁场在生物学研究中的应用 |
| 1.2.2 稳恒磁场在临床中的应用 |
| 1.3 生物电磁特性 |
| 1.3.1 生物电特性来源与表征 |
| 1.3.2 生物电特性检测 |
| 1.3.3 生物磁特性来源与表征 |
| 1.3.4 生物磁特性检测 |
| 1.4 本论文研究意义和主要研究内容 |
| 1.4.1 本论文研究意义 |
| 1.4.2 本论文主要研究内容 |
| 1.5 本章小结 |
| 2 介电理论及其在生物体系中的应用 |
| 2.1 介电谱方法的理论基础 |
| 2.1.1 电介质的极化 |
| 2.1.2 介电弛豫 |
| 2.2 生物细胞的介电行为 |
| 2.2.1 生物细胞等效模型 |
| 2.2.2 生物体系介电谱 |
| 2.2.3 细胞电参数模型 |
| 2.3 生物样品介电谱的检测 |
| 2.3.1 测量的外部配置和测量值的校正 |
| 2.3.2 生物组织介电谱检测 |
| 2.3.3 细胞悬浮液介电谱检测 |
| 2.4 生物样品介电谱检测的应用 |
| 2.4.1 在评价电磁辐射中的应用 |
| 2.4.2 在解析细胞生物学过程中的应用 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 稳恒磁场对细胞生长和金属元素含量的影响 |
| 3.1 材料与仪器 |
| 3.1.1 实验材料和试剂 |
| 3.1.2 实验仪器和装置 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 细胞培养 |
| 3.2.2 细胞增殖测定 |
| 3.2.3 细胞周期检测 |
| 3.2.4 细胞内活性氧水平检测 |
| 3.2.5 细胞内金属元素含量测定 |
| 3.2.6 数据分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 细胞培养的定性观察 |
| 3.3.2 细胞增殖 |
| 3.3.3 细胞周期 |
| 3.3.4 细胞内活性氧水平 |
| 3.3.5 细胞内金属元素含量 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 稳恒磁场对细胞介电特性的影响 |
| 4.1 材料与仪器 |
| 4.1.1 实验材料和试剂 |
| 4.1.2 实验仪器和装置 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 白血病细胞介电特性检测测量池的研制 |
| 4.2.2 成骨细胞介电特性检测测量池的研制 |
| 4.2.3 测量池的校正 |
| 4.2.4 细胞培养 |
| 4.2.5 白血病细胞介电特性检测方法 |
| 4.2.6 成骨细胞介电特性检测方法 |
| 4.2.7 数据分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 用于白血病细胞介电特性检测的测量池 |
| 4.3.2 用于成骨细胞介电特性检测的测量池 |
| 4.3.3 测量池的校正 |
| 4.3.4 稳恒磁场对白血病细胞介电特性的影响 |
| 4.3.5 稳恒磁场对成骨细胞介电特性检测的影响 |
| 4.4 本章小结 |
| 5 亚磁场和后肢去负荷对大鼠组织介电特性的影响 |
| 5.1 材料与仪器 |
| 5.1.1 实验材料和试剂 |
| 5.1.2 实验仪器和装置 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 组织介电特性检测测量池的研制 |
| 5.2.2 测量池的校正 |
| 5.2.3 大鼠全血介电特性检测 |
| 5.2.4 大鼠腓肠肌介电特性检测 |
| 5.2.5 大鼠睾丸介电特性检测 |
| 5.2.6 大鼠脾脏介电特性检测 |
| 5.2.7 数据拟合 |
| 5.2.8 数据分析 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 用于组织介电特性检测的测量池 |
| 5.3.2 测量池的校正 |
| 5.3.3 亚磁场和后肢去负荷处理下大鼠全血介电特性 |
| 5.3.4 亚磁场和后肢去负荷处理下大鼠腓肠肌介电特性 |
| 5.3.5 亚磁场和后肢去负荷处理下大鼠睾丸组织介电特性 |
| 5.3.6 亚磁场和后肢去负荷处理下大鼠脾脏介电特性 |
| 5.3.7 拟合参数 |
| 5.4 本章小结 |
| 6 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文和参加科研情况 |
| 致谢 |
（8）海南粗榧内生真菌抗肿瘤活性菌株筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 1 前言 |
| 1.1 海南粗榧简介 |
| 1.2 海南粗榧化学成分研究进展 |
| 1.3 植物内生菌及其抗肿瘤活性物质研究进展 |
| 1.3.1 植物内生菌简介 |
| 1.3.2 植物内生菌与宿主的关系 |
| 1.3.3 植物内生菌的次级代谢产物研究进展 |
| 1.4 海南粗榧内生真菌及其次级代谢产物研究进展 |
| 1.4.1 海南粗榧内生真菌的多样性 |
| 1.4.2 海南粗榧内生真菌次级代谢产物研究进展 |
| 1.5 MTT比色法在抗肿瘤活性筛选中的应用 |
| 1.5.1 MTT比色法的起源与原理 |
| 1.5.2 MTT比色法在筛选抗肿瘤活性菌株中的应用 |
| 1.6 本研究的目的意义与主要内容 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料、仪器与试剂 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 肿瘤细胞 |
| 2.1.3 仪器与试剂 |
| 2.2 培养基 |
| 2.2.1 内生真菌分离培养基 |
| 2.2.2 内生真菌发酵培养基 |
| 2.2.3 肿瘤细胞培养基 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 内生真菌的分离 |
| 2.3.2 内生真菌的纯化与保藏 |
| 2.3.3 肿瘤细胞筛选模型的建立 |
| 2.3.4 内生真菌抗肿瘤活性初筛 |
| 2.3.5 内生真菌抗肿瘤活性复筛 |
| 2.3.6 活性菌株代谢产物研究 |
| 2.3.7 活性菌株的形态鉴定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 海南粗榧内生真菌的分离 |
| 3.2 最佳细胞铺板浓度的确定 |
| 3.2.1 K562细胞的最佳铺板浓度 |
| 3.2.2 NB4细胞的最佳铺板浓度 |
| 3.2.3 HL-60细胞的最佳铺板浓度 |
| 3.2.4 HepG-2细胞的最佳铺板浓度 |
| 3.2.5 LoVo细胞的最佳铺板浓度 |
| 3.3 内生真菌抗肿瘤活性初筛 |
| 3.4 内生真菌抗肿瘤活性复筛 |
| 3.4.1 菌株ZWY1021对五种细胞的抑制率 |
| 3.4.2 菌株JFL2014对五种细胞的抑制率 |
| 3.4.3 菌株JFL3007a对五种细胞的抑制率 |
| 3.4.4 菌株BWL6007对五种细胞的抑制率 |
| 3.4.5 菌株BWL6026对五种细胞的抑制率 |
| 3.4.6 菌株BWL6045对五种细胞的抑制率 |
| 3.4.7 菌株BWL6075对五种细胞的抑制率 |
| 3.4.8 菌株BWL6091对五种细胞的抑制率 |
| 3.4.9 菌株BWL6127对五种细胞的抑制率 |
| 3.4.10 高活性菌株的IC_(50)值 |
| 3.5 活性菌株代谢产物研究 |
| 3.5.1 菌株JFL3007a的代谢产物分析 |
| 3.5.2 菌株BWL6045的代谢产物分析 |
| 3.6 活性菌株JFL3007a和BWL6045的初步鉴定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 植物内生真菌的分离 |
| 4.2 抗肿瘤活性菌株的筛选 |
| 4.2.1 样品的制备 |
| 4.2.2 抗肿瘤筛选模型的选择 |
| 4.2.3 测试细胞株的选择 |
| 4.2.4 活性部位的选择 |
| 4.3 活性菌株代谢产物的研究 |
| 4.4 活性菌株JFL3007a和BWL6045的初步鉴定 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 附录 |
| 致谢 |
（9）细胞松弛素B对U87细胞增殖及凋亡的影响（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1. 1 主要试剂及仪器 |
| 1. 2 方法 |
| 1. 3 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2. 1 CCK-8 试剂盒检测CB对细胞增殖抑制作用 |
| 2. 2 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 2. 4 透射电镜观察 |
| 3 讨论 |
（10）水通道蛋白1基因对白血病K562细胞红系分化的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 目录 |
| 前言 |
| 第一章 AQP1基因在RA诱导K562细胞红系分化的表达改变 |
| 1.1 材料和方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 第二章 AQP1基因的过表达对K562细胞诱导分化和增殖的影响 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 AQP1基因的表达抑制对K562细胞诱导分化和增殖的影响 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 应用全基因组表达谱芯片分析AQP1基因对K562细胞红系诱导分化的作用机制 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 英文缩略语表 |
| 攻读博士期间成果 |
| 致谢 |
| 统计学证明 |
四、细胞松弛素B对K562细胞脱核作用的观察（论文参考文献）
- [1]mTOR信号通路在人脐带血造血干/祖细胞红系定向分化中的作用及机制研究[D]. 刘茜. 汕头大学, 2020
- [2]比较细胞松弛素A与B在胞质分裂阻断法微核试验中的应用[J]. 文海若,任璐,罗飞亚,汪祺. 中国医药生物技术, 2019(02)
- [3]细胞松弛素B对山羊颞下颌关节盘细胞及细胞骨架肌动蛋白的影响[J]. 张文霞,康宏,吕玮,李燕梅,钟妮,包广洁. 口腔医学研究, 2016(08)
- [4]细胞松弛素B及单轴拉伸应力对山羊颞下颌关节盘细胞影响的体外研究[D]. 张文霞. 兰州大学, 2016(08)
- [5]Wnt-10a在红系分化中的功能研究[D]. 王婕. 浙江理工大学, 2015(03)
- [6]基于P-gp靶点天然小分子化合物DHA和SM抗肿瘤多药耐药作用及其机制的研究[D]. 万培红. 山东大学, 2015(02)
- [7]稳恒磁场对细胞电磁特性和生物学效应的影响[D]. 丁冲. 西北工业大学, 2014(07)
- [8]海南粗榧内生真菌抗肿瘤活性菌株筛选[D]. 蒋春洁. 海南大学, 2014(07)
- [9]细胞松弛素B对U87细胞增殖及凋亡的影响[J]. 李婧琦,刘楠,梁瑞,佟志国,顾云鹤,祝继原,戚基萍. 哈尔滨医科大学学报, 2014(01)
- [10]水通道蛋白1基因对白血病K562细胞红系分化的影响[D]. 王妮莎. 南方医科大学, 2013(06)