心肌细胞移植的现状与发展前景

一、心肌细胞移植的现状与发展前景（论文文献综述）

颉丽英^[1]（2021）在《人脐带间充质干细胞通过调节巨噬细胞极化参与小鼠心肌肥厚的修复过程》文中指出研究背景:高血压（hypertension）是以体循环动脉血压持续升高（≥140/90 mm Hg）为主要表现的一类临床综合征。高血压所并发的左心室肥厚是最为常见的高血压靶器官损害之一。高血压诱发的左心室肥厚可使心血管疾病的发病及死亡风险升高2倍以上,其已成为临床预测心血管疾病总死亡率的强预测因子。因此,逆转高血压所导致的左心室肥厚是降低临床心血管事件发生风险,并提高患者生存率的最有效途径。压力负荷型心肌肥厚是长期血压增高导致的慢性病理损伤。目前,临床上主要通过药物治疗将患者血压控制在正常范围,以此来延缓心肌肥厚乃至心力衰竭的发生;然而,左心室肥厚并不会因为血压水平的降低而发生完全逆转,在血压达标的患者中仍有高达20%的人存在左心室肥厚,提示:压力负荷型心肌肥厚可能存在未知的发病机制。因此,寻找针对左心室肥厚的更加有效的治疗措施就势在必行。间充质干细胞是一类具有自我更新及多向分化潜能的多能干细胞。研究发现,间充质干细胞可以在心脏受损后,定向归巢到损伤部位,并在这些部位存活、增殖、分泌细胞因子,发挥调节炎症反应的作用。人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells,h UC-MSCs）是一种来源广泛,免疫原性低,无伦理问题限制的干细胞类型;其在体外培养时,可稳定生长、细胞均一性较好,同时对多种损伤,如:神经损伤、心肌缺血、骨质疏松及自身免疫性疾病等均有良好的修复作用,作为一种新型种子细胞,其具有更广阔的应用前景。那么,h UC-MSCs对心肌肥厚是否有良好的缓解能力,同时,经腹腔和静脉进行干细胞移植的疗效有无差别;如果h UC-MSCs对压力负荷型心肌肥厚有效的话,其可能的调节机制是什么?尚缺乏有效的实验证据。综上所述,本项目以脐带间充质干细胞为切入点,通过腹腔及尾静脉注射两种方式进行干细胞移植治疗小鼠心肌肥厚。观察h UC-MSCs是否对心肌肥厚小鼠的心功能、心肌肥厚程度、局部炎症反应、微血管再生以及心室重构进程等有影响;然后进一步在细胞水平探讨h UC-MSCs是否可以直接抑制药物诱导的心肌肥大;并通过h UC-MSCs与RAW264.7巨噬细胞共培养,探讨h UC-MSCs抑制心肌肥厚的可能机制。通过以上的研究,旨在为后期h UC-MSCs应用于临床心肌肥厚病人的治疗,提供可行的移植方式及理论和实验依据。目的:本研究以人脐带间充质干细胞为切入点,通过不同移植途径,观察h UC-MSCs移植治疗小鼠心肌肥厚的疗效,并对h UC-MSCs抑制心肌肥厚的可能机制进行了探索。方法:（1）采用主动脉弓缩窄术（transverse aortic constriction,TAC）构建C57BL/6J小鼠心肌肥厚模型,通过测量左室质量/体重、心重/肺重,评价模型是否建立成功。（2）模型建立成功后,h UC-MSCs通过尾静脉（TAC+MSCs-iv）以及腹腔（TAC+MSCs-ip）注射移植入小鼠体内连续治疗4周,对照组给予等量PBS（TAC+PBS）,观察h UC-MSCs对各组小鼠生存率,心功能（超声心动图）,心肌肥厚指标（心重/体重比、心重/肺重比、心重/胫骨长比、左室质量/体重比、心肌组织ANP、BNP和β-MHC蛋白含量）,心电轴偏移（心电图）,心肌细胞横截面积大小（HE染色）,心肌胶原容积分数（Masson三色染色）,微血管再生情况（CD31免疫组化染色）,炎症细胞浸润情况（CD45免疫组化染色）以及巨噬细胞分布（CD68免疫组化染色）的影响。（3）在离体实验中,首先对复苏后的人脐带间充质干细胞相关表面抗原的表达（流式细胞术）及h UC-MSCs分化成骨（茜素红染色）、成脂（油红O染色）能力进行鉴定。然后通过异丙肾上腺素（isopropyl adrenaline,ISO）诱导H9c2细胞肥大,并将h UC-MSCs与肥大的H9c2细胞共培养于Transwell TM小室中,观察共培养48h后,h UC-MSCs对H9c2细胞面积（F-actin染色）、H9c2细胞内ANP、BNP和β-MHC m RNA表达量（q RT-PCR）的影响。（4）使用IFN-γ+LPS诱导RAW264.7巨噬细胞向M1型巨噬细胞极化,IL-4诱导RAW264.7巨噬细胞向M2型巨噬细胞极化。使用Transwell TM小室完成h UC-MSCs与诱导极化后的RAW264.7细胞共培养,观察h UC-MSCs对RAW264.7细胞极化分型（M1型巨噬细胞鉴定:CD68+CD86免疫荧光染色,M2型巨噬细胞鉴定:CD68+CD206免疫荧光染色）以及分泌炎症因子TNF-α、IL-10（ELISA）的影响。结果:（1）TAC术后第4周,与假手术组（左室质量/体重:3.06±0.21;心重/肺重:0.78±0.01）相比,模型组左室质量/体重（5.58±0.47）、心重/肺重（1.00±0.04）均明显增加（P<0.01）,提示小鼠心肌肥厚模型成功建立。术后11周时,TAC+MSCs-ip组生存率（83.33%）与同期TAC+PBS组（70.59%）相比呈上升趋势,但无显着差异（P>0.05）,TAC+MSCs-iv组生存率（70.59%）与同期TAC+PBS组相比无明显差异。超声心动图结果证实:术后第10周,与同期TAC+PBS组相比（LVEF:28.92±0.64%;LVFS:14.85±0.22%）,TAC+MSCs-ip组LVEF（45.59±1.43%）、LVFS（23.19±0.86%）及TAC+MSCs-iv组LVEF（45.23±1.18%）、LVFS（21.91±1.47%）均明显升高（P<0.05）;与同期TAC+PBS组（7.28±0.04 mm）相比,TAC+MSCs-ip组LVID,d（5.87±0.11 mm）及TAC+MSCs-iv组LVID,d（6.66±0.02 mm）均明显降低（P<0.05）。（2）将心重/体重比（HW/BW）、心重/肺重比（HW/LW）、心重/胫骨长比（HW/TL）、左室质量/体重比（LVM/BW）作为衡量心肌肥厚程度的指标,结果显示:TAC术后第10周,TAC+MSCs-ip组小鼠HW/BW（8.69±0.87）、HW/LW（0.83±0.07）、HW/TL（11.11±0.67）、LVM/BW（3.57±0.14）均明显低于同期TAC+PBS组（HW/BW:10.00±0.19;HW/LW:1.18±0.04;HW/TL:14.92±0.80;LVM/BW:5.56±1.86,P<0.05）;TAC+MSCs-iv组小鼠HW/LW（0.93±0.04）、LVM/BW（3.90±0.44）亦明显低于同期TAC+PBS组（P<0.05）。（3）心电图结果发现:术后第11周,TAC+MSCs-ip组（-37.76±4.66°）及TAC+MSCs-iv组（-55.68±1.76°）小鼠的心电轴左偏较TAC+PBS组（-89.11±0.32°）均明显减轻（P<0.05）。（4）术后第10周,HE染色结果显示:TAC+MSCs-ip及TAC+MSCs-iv组小鼠出现心肌细胞肥大、间质增加、纤维断裂等情况均明显弱于同期TAC+PBS组（P<0.05）;Massson染色结果显示:TAC+MSCs-ip及TAC+MSCs-iv组小鼠心肌纤维化面积分别为17.06±0.65μm2、18.64±0.76μm2,均小于PBS组（24.51±0.59μm2,P<0.01）;免疫组化染色结果显示:与TAC+PBS组（1.00±0.57个/10×视野）相比,TAC+MSCs-ip（5±0.57个/10×视野）及TAC+MSCs-iv（2.33±0.33个/10×视野）组小鼠心肌均出现明显的的毛细血管增生（P<0.05）;同时,小鼠心肌组织中CD45阳性细胞占比、巨噬细胞的数量在TAC+MSCs-ip组（23.48±0.44%,10.40±0.46%）及TAC+MSCs-iv组（26.28±0.57%,13.44±0.56%）明显低于同期TAC+PBS组（28.73±0.83%,19.47±0.60%,P<0.05）;Western blot结果显示:从第9周开始,与同期TAC+PBS组（ANP:2.50±0.06;BNP:2.99±0.07;β-MHC:1.46±0.03）比较,在TAC+MSCs-ip组（1.36±0.03,1.56±0.12,0.79±0.03）和TAC+MSCs-iv组（1.81±0.10,1.88±0.06,1.11±0.03）小鼠心肌组织中ANP、BNP及β-MHC蛋白含量均显着下降（P<0.01）。（5）流式细胞术结果提示:复苏后的人脐带间充质干细胞高表达MSCs相关的标记（CD90、CD73、CD105的标记表达均为阳性）,而CD45、CDl9、CD31、CD34和CD11b、HLA-DR等内皮细胞特异性抗原及移植排斥相关的细胞表面标记表达则为阴性。茜素红、油红O染色结果证实:复苏后的人脐带间充质干细胞具有多向分化潜能,可以成功分化为骨和脂肪组织。F-actin染色结果显示:与对照组（7151.10±33.53μm2）相比,与h UC-MSCs共培养48h后的H9c2细胞面积明显减小（4915.93±75.18μm2,P<0.01）;同时,q RT-PCR结果显示:H9c2细胞中ANP（1.07±0.02）、BNP（1.52±0.13）和β-MHC（1.31±0.06）m RNA水平明显少于对照组（ANP:1.26±0.05,BNP:1.66±0.04,β-MHC:1.44±0.03,P<0.05）。（6）CD68+CD86免疫荧光染色鉴定M1型巨噬细胞及CD68+CD206免疫荧光染色鉴定M2型巨噬细胞,免疫荧光染色结果显示:与未共培养的对照组（M1型:46.79±1.39%,M2型:51.16±1.43%）相比,与h UC-MSCs共培养48h后,诱导极化的RAW264.7巨噬细胞向M1型（CD68、CD86阳性）极化比例（37.18±0.85%）明显减少,而向M2型（CD68、CD206阳性）极化比例（66.15±1.15%）明显增多（P<0.05）。ELISA结果显示:相较于对照组上清液中炎性因子的含量（TNF-α:83.24±0.87 pg/m L;IL-10:51.63±0.64 pg/m L）,与h UC-MSCs共培养48小时之后,诱导极化的RAW264.7细胞上清液中M1型巨噬细胞相关因子TNF-α含量明显降低（71.43±0.70 pg/m L,P<0.05）,与M2型巨噬细胞相关的因子IL-10的含量明显增加（65.07±0.94 pg/m L,P<0.05）。结论:经腹腔和尾静脉移植人脐带间充质干细胞治疗小鼠心肌肥厚,可显着缓解压力负荷型心肌肥厚的发生,改善小鼠心功能,其机制可能与减少心肌细胞肥大相关基因表达、促进细胞因子分泌、微血管生成以及巨噬细胞向M2型分化增多有关。

王擎擎^[2]（2021）在《活血温通方联合BMSCs移植改善心梗后缺血缺氧微环境的机制研究》文中研究指明背景:当代以干细胞技术为核心的再生医学的迅速发展,为心肌梗死的治疗带来新的希望,其中干细胞移植治疗心梗,有望修复坏死的心肌组织,改善受损的心功能,但是梗死区缺血、缺氧局部微环境使MSCs移植后存活率降低,极大地限制了 MSCs用于治疗MI的疗效。中药促进MSCs移植后存活的研究目前也显示出了很好的疗效,可以调控MSCs的归巢、定植,提高MSCs移植后存活率。导师姚魁武教授基于中医胸痹心痛“阳微阴弦”的基本病机,常用活血温通法治疗冠心病,临床疗效显着,并根据多年临床经验拟定了具有活血温通效果的经验方—活血温通方。我们前期研究也发现活血温通方可以显着改善心肌缺血模型组大鼠心功能,明显缩小心肌梗死面积,而且能够降低炎症反应、抑制心肌细胞凋亡、减少胶原纤维面积以及促进血管新生,同时发现活血温通方减轻心肌缺血损伤可能与Sirt1信号通路激活有关。而活血温通方联合MSCs移植治疗心梗,还没有相关的报道。目的:1.总结导师姚魁武教授活血温通法治疗冠心病阳虚证的用药规律、治疗思路,并进行系统的经验总结。2探索活血温通方对BMSCs移植治疗心梗疗效的影响以及可能的作用机制。方法:1.收集2016年1月—2020年12月就诊于中国中医科学院广安门医院姚魁武主任医师门诊,应用中药汤剂治疗且符合纳排标准的全部初诊原始病案。通过“中医传承计算平台（V3.0）”软件系统进行数据分析,根据分析得到到药物频次、常用药物组合、潜在处方等,分析探讨姚魁武教授活血温通法治疗冠心病的用药规律、诊疗思路,并做系统总结。2.提取大鼠BMSCs,培养至第三代时,用流氏细胞仪进行细胞鉴定。用活细胞染色剂CM-Dil进行荧光标记,以检测移植后细胞的存活情况。3.通过结扎左冠状动脉前降支制备心机梗死模型。SD大鼠随机分为5组：假手术组（Sham组）：冠状动脉只穿线不结扎，术后灌胃纯水，持续28天；心梗组（MI组）:按AMI造模方法进行造模,造模成功后于梗死区边缘心肌组织的2个位点直接注入共100μL的PBS。术后灌胃纯水,持续28天;BMSCs移植组（BMSCs组）:按AMI造模方法进行造模,造模成功后于梗死区边缘心肌组织的2个位点直接注入共100μL的MSCs单细胞悬液（细胞浓度3x106个/100μL）。术后灌胃纯水,连续28天;活血温通方组（HXWTF组）:造模方法同心梗组。术后灌胃活血温通方,连续28天;活血温通方+BMSCs移植组（BMSCs+HXWTF组）:造模方法同BMSCs移植组。术后灌胃活血温通方,连续28天。4.超声心动图检测大鼠心功能、TTC染色用于观察心肌梗死面积大小、HE染色观察心梗大鼠心肌组织形态的改变、荧光显微镜观察BMSCs移植后的存活情况。5.用WST-1法测定大鼠血清SOD活力和TBA法测定大鼠血清MDA水平,以评价各组氧化损伤程度;TUNEL染色观察心肌细胞凋亡;采用ELISA试剂盒检测大鼠血清中炎性因子TNF-a、IL-6、IL-10与生长因子VEGF、bFGF水平,评价炎症反应程度;天狼猩红染色检测各组大鼠心肌纤维化程度;免疫组织化学染色检测梗死边缘区α-SMA和CD31的表达情况,以评价血管新生情况;Western blotting检测心肌组织Sirt1、NF-κB、FoxO1和p53的蛋白的表达水平。结果:1.从用药频次分析,196张处方中,共137味中药,用药频次≥20的中药有39味,用药频次≥50的有22味,用药频次≥50按频次由高到低依次为丹参（193）,桂枝（164）,砂仁（123）,川芎（117）,瓜蒌（109）,白芍（105）,炙甘草（95）,鸡血藤（93）,茯苓（88）,柴胡（87）,炒枳壳（80）,当归（78）,干姜（77）,炒白术（76）,杜仲（64）,党参（61）,麦冬（59）,肉苁蓉（58）,炒酸枣仁（56）,薤白（54）,葛根（54）,五味子（50）。2.196张处方中的137味中药按功效共分为16类,根据药物功效使用频次由高到低排列前10位的依次为补虚类（769）,活血化瘀类（436）,温里类（339）,清热类（210）,化湿类（198）,解表类（184）,理气类（177）,化痰类（155）,利水渗湿类（119）,安神类（114）。3.从药物组合频次分析,药物组合频次≥90的由高到低依次是丹参-桂枝（162）,丹参-砂仁（123）,丹参-川芎（115）,丹参-瓜蒌（108）,丹参-白芍（104）,丹参-桂枝-砂仁（99）;桂枝-砂仁（99）。基于关联规则深入分析用药组合,导师活血温通法治疗冠心病常用的2味药的组合是丹参-瓜蒌,丹参-砂仁,丹参-桂枝,丹参-鸡血藤等;3味药的组合是丹参-砂仁-瓜蒌,丹参-桂枝-瓜蒌,丹参-桂枝-鸡血藤等。从用药关联规则网络拓扑图可以看出,关联性比较大的药物组合是丹参、桂枝、鸡血藤、瓜蒌、川芎、砂仁。4.基于复杂算法的聚类分析在深入挖掘可以得出导师活血温通法治疗冠心病常用的核心组合。3种药物聚类核心组合为丹参,桂枝,砂仁,瓜蒌,鸡血藤;丹参,桂枝,川芎,白芍,砂仁;丹参,桂枝,川芎,砂仁,茯苓。4种药物聚类核心组合为;丹参,桂枝,砂仁,瓜蒌,川芎,鸡血藤;丹参,桂枝,麦冬,炙甘草,川芎,生地黄;丹参,桂枝,砂仁,鸡血藤,川芎,降香;丹参,桂枝,砂仁,干姜,茯苓,瓜蒌。5种药物聚类核心组合为;丹参,桂枝,鸡血藤,瓜蒌,川芎,党参;桂枝,丹参,麦冬,川芎,炙甘草,炒白术;丹参,桂枝,干姜,砂仁,茯苓,黄连;丹参,桂枝,砂仁,瓜蒌,川芎,白芍;丹参,砂仁,桂枝,川芎,鸡血藤,降香。5.基于方剂频数分析,可以得出196例病案中共涉及方剂54个,方剂频数为2以上的药物有32个,方剂频数为5以上的方剂有24个,方剂频数为10以上的方剂有13个,方剂频数为20以上的药物有6个。可以看出导师活血温通法治疗冠心病常用的方剂有丹参饮（118）,四逆散（73）,桂枝甘草龙骨牡蛎汤（25）苓桂术甘汤（23）、瓜蒌薤白白酒汤（21）等。6.根据方剂配伍的使用频次,可以得出导师活血温通法治疗冠心病常用的方剂配伍是丹参饮-四逆散（47）,丹参饮-黄芪赤风汤（11）,丹参饮-交泰丸（11）,丹参饮-瓜蒌薤白白酒汤（11）,丹参饮-半夏泻心汤（11）,丹参饮-瓜蒌薤白半夏汤（11）等。基于关联规则深入分析用方组合,可以得出导师活血温通法治疗冠心病常用的方剂配伍是丹参饮-四逆散-瓜蒌薤白半夏汤,丹参饮-四逆散-黄芪赤风汤,丹参饮-四逆散-桂枝甘草龙骨牡蛎汤等。根据方剂组合规律关联规则网络拓扑图可以看出关联比较大的方剂是丹参饮、四逆散、生脉散、桂枝甘草龙骨牡蛎汤、瓜蒌薤白半夏汤、瓜蒌薤白白酒汤、交泰丸等。基于复杂算法的聚类分析在深入挖掘可以得出导师活血温通法治疗冠心病常用的核心方剂组合是生脉散,丹参饮,枳实薤白桂枝汤,补中益气汤,四君子汤;丹参饮,交泰丸,半夏泻心汤,苓桂术甘汤,越鞠丸;丹参饮,四逆散,黄芪赤风汤,瓜蒌薤白半夏汤,桂枝甘草龙骨牡蛎汤。7.BMSCs的鉴定:用流氏细胞仪检测第3代BMSCs表面标记物CD44、CD90、CD45的表达情况,结果显示CD44表达率为99.2%,CD90表达率为97.4%,CD45的表达率为6.7%。8.活血温通方联合MSCs移植对心梗大鼠心功能的影响:与MI组相比,BMSCs移植组、活血温通方组、活血温通方联合BMSCs移植组EF均有明显改善（**P<0.01,***P<0.001,***P<0.001）,活血温通方联合 BMSCs 移植组 EF比BMSCs移植组和活血温通方组改善明显（***P<0.001,**P<0.01）;与MI组相比,BMSCs移植组、活血温通方组、活血温通方联合BMSCs移植组FS均有明显改善（**P<0.01,***P<0.001,***P<0.001）,活血温通方联合BMSCs移植组FS 比 BMSCs移植组和活血温通方组改善明显（***P<0.001,***P<0.001）。9.活血温通方联合MSCs移植对心梗大鼠心肌梗死面积的影响:假手术组无梗死,完整心脏表面和心脏切片均呈现红色,无苍白色区域。心梗组完整心脏表面和心脏切片苍白色区域均最大,故心梗面积最大,且心梗处明显凹陷,心梗处心肌明显变薄。BMSCs移植组和活血温通方组较心梗组,完整心脏表面和心脏切片的苍白色区域均明显减少,说明BMSCs移植和活血温通方药物干预均能减少心梗面积。活血温通方联合BMSCs移植组心脏苍白色区域最小,心梗处轻微凹陷,说明活血温通方能提高BMSCs移植改善心梗大鼠心肌梗死面积的疗效。10.活血温通方联合MSCs移植对心梗大鼠心肌组织形态的影响:HE染色显示与假手术组相比,其余各组梗死区均有不同程度的炎性细胞浸润。心梗组细胞排列紊乱,细胞间隙增大,炎性细胞浸润最严重。BMSCs移植组、活血温通方组、活血温通方联合BMSCs移植组这些病变均有明显改善,炎性细胞浸润有不同程度的降低。与BMSCs移植组、活血温通方组相比较,活血温通方联合BMSCs移植组细胞排列更有序,炎性细胞浸润更少。11.活血温通方对BMSCs移植四周后存活的影响:在全景数字扫描显微镜下观察,可以看到活血温通方联合BMSCs移植组红色荧光分布更广。红色荧光与蓝色荧光重叠的数量明显更多。12.活血温通方联合BMSCs移植对心梗大鼠血清SOD、MDA的影响:与MI组相比,BMSCs移植组、活血温通方组、活血温通方联合BMSCs移植组SOD活力均有显着升高（**P<0.01,***P<0.001,***P<0.001）;与BMSCs移植组、活血温通方组相比,活血温通方联合BMSCs移植组SOD活力均有显着升高（***P<0.001,**P<0.01）;与心梗组相比,BMSCs移植组、活血温通方组、活血温通方联合BMSCs移植组MDA水平均有显着降低（**P<0.01,***P<0.001,***P<0.001）;与BMSCs移植组、活血温通方组相比,活血温通方联合BMSCs 移植组 MDA 均有显着降低（***P<0.001,**P<0.01）。13.活血温通方联合BMSCs移植对心梗大鼠心肌细胞凋亡的影响:与MI组相比,BMSCs移植组、活血温通方组、活血温通方联合BMSCs移植组细胞凋亡水平显着降低（***P<0.001,***P<0.001,***P<0.001）;与 BMSCs 移植组、活血温通方组相比,活血温通方联合BMSCs移植组细胞凋亡水平均有显着降低（***P<0.001,***P<0.001）。14.活血温通方联合BMSCs移植对心梗大鼠血清炎性因子TNF-α、IL-6、IL-10的影响:与假手术组相比,MI组TNF-α、IL-6和IL-10水平水平显着升高（***P<0.001）;与MI组相比,BMSCs移植组、活血温通方组、活血温通方联合 BMSCs 移植组 TNF-α 显着降低（**P<0.01,**P<0.01,***P<0.001）,IL-6 显着降低（***P<0.001,***P<0.001,***P<0.001）,IL-10 显着升高（***P<0.001,***P<0.001,***P<0.001）;与 BMSCs 移植组、活血温通方组相比,活血温通方联合BMSCs移植组TNF-α显着降低（**P<0.01,**P<0.01）,IL-6显着降低（***P<0.001,**P<0.01）,IL-10显着升高（***P<0.001,***P<0.001）。15.活血温通方联合BMSCs移植对心梗大鼠心肌纤维化的影响:与假手术组相比,MI组心肌纤维化明显（***P<0.001）;与MI组相比,BMSCs移植组、活血温通方组、活血温通方联合BMSCs移植组心肌纤维化面积明显减少（***P<0.001,***P<0.001,***P<0.001）;与BMSCs移植组、活血温通方组相比,活血温通方联合BMSCs移植组心肌纤维化面积明显减少（*P<0.05,**P<0.01）。16.活血温通方联合BMSCs移植对心梗大鼠梗死边缘区α-SMA、CD31表达的影响:与假手术组相比,MI组α-SMA、CD31的表达明显增多（***P<0.001,**P<0.01）;与MI组相比,BMSCs移植组、活血温通方组、活血温通方联合BMSCs 移植组 α-SMA、CD31 的表达均显着增多（***P<0.001,***P<0.001,***P<0.001）;与BMSCs移植组、活血温通方组相比,活血温通方联合BMSCs移植组 α-SMA、CD31 的表达显着增多（**P<0.01,*P<0.05;*P<0.05,***P<0.001）。17.活血温通方联合BMSCs移植对心梗大鼠血清生长因子VEGF、bFGF的影响:与假手术组相比,MI组VEGF、bFGF水平显着升高（***P<0.001）;与MI组相比,BMSCs移植组、活血温通方组、活血温通方联合BMSCs移植组VEGF、bFGF 显着升高（***P<0.001,***P<0.001,***P<0.001）;与 BMSCs移植组、活血温通方组相比,活血温通方联合BMSCs移植组VEGF、bFGF显着升高（***P<0.001,***P<0.001）。18.活血温通方联合BMSCs移植对心肌组织SIRT1、NF-kB、FoxO1和p53蛋白表达的影响:与假手术组相比,MI组Sirt1的表达明显降低（***P<0.001）,NF-kB、Foxo1、p53 的表达明显升高（**P<0.01,**P<0.01,**P<0.01）。与MI组相比,BMSCs移植组、活血温通方组、活血温通方联合BMSCs移植组Sirt1的表达显着升高（**P<0.01,***P<0.001,***P<0.001）,NF-κB的表达显着降低（*P<0.05,**P<0.01,**P<0.01）,FoxO1 的表达显着降低（*P<0.05,*P<0.05,*P<0.05）,p53 的表达显着降低（*P<0.05,**P<0.01,**P<0.01）;与BMSCs移植组、活血温通方组相比,活血温通方联合BMSCs移植组Sirt1的表达均显着升高（**P<0.01,*P<0.05）,NF-kB的表达显着降低（**P<0.01,*P<0.05）,FoxO1的表达显着降低（*P<0.05,*P<0.05）,p53的表达显着降低（*P<0.05,*P<0.05）。结论:1.导师活血温通法治疗冠心病常活血药与温阳药并重,且用药平和,配伍主次分明,以经方为主。在活血温通法治疗冠心病的组方用药中常含有活血温通方,治疗效果短期的显着,可能是因为改善了心肌缺血缺氧微环境,也初步说明了活血温通方的临床疗效比较显着。2.活血温通方可能是通过改善心梗后缺血缺氧微环境而提高了 BMSCs移植后的存活率,而进一步提高BMSCs移植治疗心梗在抗细胞氧化损伤、抗细胞凋亡、降低炎症反应、抗心肌纤维化和促进血管新生方面的疗效,以及促进移植后的BMSCs的旁分泌功能而进一步修复受损的心肌,缩小心肌梗死面积,改善心功能。3.活血温通方能促进BMSCs移植后Sirt1信号通路的激活,以协同恢复心功能。

冀楠^[3]（2021）在《益气活血方联合骨髓间充质干细胞干预心肌梗死后心室重构的实验研究》文中提出背景:急性心肌梗死（Acute Myocardial infarction,AMI）发生后,左心室大小、结构、功能改变,造成心室重构。心室重构（Ventricμlar remodeling,VR）是AMI向心力衰竭发展的主要病程。骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）可通过旁分泌、归巢、转化等方式缓解AMI后心肌损伤,改善心室重构。但由于AMI后内环境改变,造成BMSCs迁移效率低下。团队前期研究发现,益气活血方可改善AMI后炎性环境,改善AMI大鼠心肌损伤。但益气活血方是否可以促进BMSCs向AMI大鼠梗死部位迁移,发挥更好的心肌保护作用,值得深入研究。目的:探讨益气活血方联合骨髓间充质干细胞对心肌梗死后心室重构的干预作用,以mi RNA-210/BNIP3为切入点,从自噬-凋亡途径研究益气活血方联合干细胞对心室重构的可能的作用机制。方法:1、从SD大鼠骨髓中提取BMSCs,显微镜下观察细胞形态,流式检测细胞表面标志物。采用LAD结扎的方法建立大鼠心肌梗死模型,分为假手术组、模型组、益气活血方组、骨髓间充质干细胞组、益气活血方联合骨髓间充质干细胞组。造模2小时,心电图检测心肌缺血情况。药物干预4周后,心脏超声评价大鼠心脏结构和功能,TTC染色评价大鼠心肌梗死面积,HE染色观察大鼠心肌炎性细胞浸润情况、Masson染色观察心肌纤维组织病理改变。2、使用CM-DIL染料对BMSCs细胞膜标记染色。造模后隔天尾静脉移植入大鼠体内。干预4周后取材,运用免疫荧光检测BMSCs向梗死部位富集情况,免疫组化检测心肌组织中SDF-1/CXCR4蛋白的表达水平。3、TUNEL检测大鼠心肌细胞凋亡情况。Western Blot检测造模后各组大鼠自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1、p62表达情况,凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3表达情况,目的蛋白BNIP3表达情况。RT-q PCR检测mi R-210、BNIP3 mRNA表达情况。结果:1、与假手术组相比,模型组大鼠的LVESD、LVEDD增加（P<0.01）,LVEF、LVFS降低（P<0.01）,提示模型组大鼠左室扩大,心功能下降,心脏结构改变;与模型组相比,益气活血方组、益气活血方联合骨髓间充质干细胞组的LVEDD、LVESD减小（P<0.05or P<0.01）,LVEF、LVFS升高（P<0.05 or P<0.01）,提示此两组可减轻心肌梗死所致的大鼠心脏损伤,减轻大鼠心脏结构改变;与模型组比较,骨髓间充质干细胞组的LVESD减小（P<0.01）,LVFS、LVEF升高,LVEDD减小,但差异无统计学意义（P>0.05）。与益气活血方联合骨髓间充质干细胞组相比,益气活血方组与骨髓间充质干细胞组LVESD、LVEDD增加（P<0.05 or P<0.01）,LVEF、LVFS降低（P<0.05 or P<0.01）。提示益气活血方联合骨髓间充质干细胞组对梗死心肌的保护作用最为显着。TTC染色结果显示:与假手术组相比,模型组梗死面积显着增加（P<0.01）。与模型组相比,各给药组梗死面积减少（P<0.05 or P<0.01）。与益气活血联合骨髓间充质干细胞组相比,其余两给药组梗死面积增大（P<0.05 or P<0.01）。HE染色结果显示:假手术组大鼠心肌细胞形态正常,细胞核结构清晰,居于中央,肌丝着色均匀,排列整齐规则,呈正常心肌细胞形态;与假手术组比较,模型组大鼠病变程度严重,心肌细胞形态不规则,排列紊乱,细胞核深染,炎性细胞浸润增多;与模型组比较,各给药组大鼠梗死范围缩小,心肌结构改变减轻,肌丝排列较规则,炎性细胞浸润和水肿减少。Masson染色结果显示:假手术组心肌细胞排列整齐,极少纤维组织沉积;模型组病变最为严重,染色显示在心肌梗死边缘区心肌细胞肥大,纤维组织沉积严重,排列紊乱,可见大面积蓝色纤维化;与模型组比较,各给药组显示胶原纤维沉积减少,心肌排列整齐。2、AMI大鼠造模后隔天经尾静脉移植BMSCs,荧光显微镜下观察其迁移情况,可见心肌组织中橙红色荧光,BMSCs向心肌梗死部位富集。免疫组化结果显示:与骨髓间充质干细胞组相比,益气活血方联合骨髓间充质干细胞组SDF-1蛋白表达增加（P<0.05）,CXCR4表达无统计学差异。3、TUNEL染色显示假手术组未见明显阳性细胞核染色,阳性细胞核染色多见于模型组。与模型组相比,给药组阳性细胞核染色数量明显减少。凋亡相关蛋白WB检测显示:与假手术组比较,模型组大鼠心肌Bax蛋白表达上调（P<0.01）,Bcl-2蛋白表达下调（P<0.01）,Caspase-3表达上调（P<0.01）,提示凋亡激活;与模型组比较,各给药组可下调Bax蛋白表达（P<0.01）,益气活血方组和益气活血方联合骨髓间充质干细胞组可下调Caspase-3蛋白表达（P<0.01）,上调Bcl-2蛋白表达（P<0.05）,骨髓间充质干细胞组Bcl-2蛋白表达有上调趋势,Caspase-3蛋白表达有下降趋势,但差异无统计学意义（P>0.05）;与益气活血方联合骨髓间充质干细胞组相比,益气活血方组和骨髓间充质干细胞组Bax、Caspase-3蛋白表达上调,（P<0.01 or P<0.05）,Bcl-2表达下调（P>0.05）,提示益气活血方联合骨髓间充质干细胞组抑制凋亡效应最显着。自噬相关蛋白WB检测显示:与假手术组比较,模型组大鼠心肌P62蛋白表达上调（P<0.05）,LC3B、Beclin-1蛋白表达下调,（P<0.01 or P<0.05）提示自噬激活;与模型组比较,各给药组可下调P62蛋白表达（P<0.01）,上调Beclin-1蛋白表达（P<0.01）,益气活血方组和益气活血方联合骨髓间充质干细胞组可上调LC3B蛋白表达（P<0.01 or P<0.05）,骨髓间充质干细胞组LC3B蛋白表达有上调趋势,但差异无统计学意义（P>0.05）;与益气活血方联合骨髓间充质干细胞组相比,益气活血方组和骨髓间充质干细胞组P62蛋白表达上调（P<0.01 or P<0.05）,LC3B、Beclin-1表达下调（P<0.01 or P<0.05）,提示益气活血方联合骨髓间充质干细胞组诱导自噬效应最显着。BNIP3蛋白WB检测显示:与假手术组比较,模型组大鼠心肌BNIP3蛋白表达上调（P<0.01）;与模型组比较,各给药组可下调BNIP3蛋白表达（P<0.01 or P<0.05）;与益气活血方联合骨髓间充质干细胞组相比,益气活血方组和骨髓间充质干细胞组BNIP3蛋白表达上调（P<0.01）。mi R-210与BNIP3 Mrna PCR检测结果显示,与假手术组比较:模型组大鼠心肌mi R-210表达下调（P<0.01）,BNIP3 mRNA表达水平上调（P<0.01）;与模型组比较:益气活血方组和益气活血方联合骨髓间充质干细胞组可上调mi R-210表达（P<0.01 or P<0.05）,骨髓间充质干细胞组mi R-210表达有下降趋势,但差异无统计学意义（P>0.05）,各给药组可下调BNIP3 mRNA表达情况（P<0.01）;与益气活血方联合骨髓间充质干细胞组相比:益气活血方组和骨髓间充质干细胞组mi R-210表达下降,（P<0.01）,骨髓间充质干细胞组BNIP3 mRNA表达水平上升（P>0.01）,益气活血方组BNIP3 mRNA有上升趋势,但差异无统计学意义（P>0.05）。提示益气活血方可能通过mi R-210/BNIP3通路发挥作用,且益气活血方联合骨髓间充质干细胞效用最为显着。结论:1、益气活血方联合骨髓间充质干细胞能够提高心梗后射血分数,改善大鼠的心脏结构,减轻心脏损伤。2、益气活血方通过干预SDF-1/CXCR4轴增加BMSCs向梗死区富集效率。3、益气活血方联合骨髓间充质干细胞可能通过调控mi RNA-210/BNIP3轴,影响心肌细胞自噬-凋亡,发挥抑制VR机制。

罗雪^[4]（2021）在《HCN2和HCN4对骨髓间充质干细胞向具有起搏功能的心肌细胞分化的影响》文中研究说明第一部分猪骨髓间充质干细胞（BMSCs）的分离培养和诱导分化目的:通过在体外分离BMSCs,构建一套BMSCs特有的培养方法,并诱导及分化BMSCs,从而建立选择BMSCs最佳流程,从而来探讨BMSCs在生物学中的特性。方法:红细胞裂解法和密度梯度离心法分选是从猪骨髓分离单核细胞两种常用的分离方法,在体外的环境下,将分离获得的单核细胞进行培养,用流式细胞术检测骨髓间充质干细胞表面抗原,以收集的细胞分成BMSC诱导组和对照组,将骨髓间充质干细胞传递至第三代。BMSC诱导组采用不同的诱导方法,加入诱导液,持续7-14天。诱导完成后,观察各组细胞形态。结果:采用骨髓抽吸法采集猪骨髓,充质干细胞来自于猪骨髓中分离获得。采用流式细胞术检测MSCs中CD45、CD11B、CD90的表达情况,结果显示,前两者为阴性,第三个为阳性。由此可见,培养的猪骨髓干细胞符合干细胞的特性。结论:MSCs可以被诱导,分别分化为神经元样细胞、心肌样细胞和脂肪样细胞,由此可见,MSCs能够分化为三层胚胎细胞,为后续进一步诱导做了铺垫。第二部分HCN2和HCN4对骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的影响目的:构建能够使MSCs定向分化为心肌细胞的诱导体系,探讨让心肌细胞能够具有起搏样电流的操作方法,并通过检测起搏通道蛋白的表达情况及If电流动力学特性,探索探讨HCN2和HCN4对骨髓间充质基质细胞（BMSCs）向心肌细胞分化的影响。以获得能够稳定、持久的心肌细胞的诱导机制和方法。方法:以小型成猪为实验对象,提取并分离骨髓间充质干细胞。CD45、CD11B和CD90的细胞表面抗原的表达情况利用流式细胞术来进行检测。对骨髓间充质干细胞进行干预,HCN2+HCN4组:被HCN2和HCN4基因共转染;骨髓间充质干细胞诱导组:被心肌诱导液进行诱导分化。α-actin、cTnT和Desmin是常见的心肌标志物,采用免疫荧光染色和Western blot进行检测。选择全细胞膜片钳技术来检测细胞HCN2通道、HCN4通道电流激活曲线及CsCl对异源表达电流的抑制作用。结果:采用流式细胞术检测CD45、CD11B和CD90的表达情况,结果显示,前两个为阴性,第三个表达为阳性。转染后的HCN2和HCN4基因,免疫荧光染色和Western blot结果显示,HCN2+HCN4组HCN2、HCN4、α-actin和cTnT表达明显增加,可与BMSC诱导组比较。HCN2+HCN4组能够记录与If性质相似的细胞膜通道离子电流。结论:HCN2、HCN4过表达可显着增强MSCs体外向心肌细胞分化的能力,诱导的心肌细胞具有起搏样离子电流。第三部分BMSCs转染HCN1、HCN2和HCN4后诱导为具有起搏样电流细胞的研究目的:研究起搏样细胞的构建方法,并对转染细胞的起搏通道蛋白的表达及If电流动力学特性进行检测,期待能够获得稳定、持久的起搏样细胞。方法:用生物起搏的靶基因HCN1、HCN2、HCN4分别转染到猪MSCs细胞内,把转染后MSCS诱导为具有起博样电流的细胞。结果:用全细胞膜片钳对转染后细胞进行检测,能成功检测出If电流,为建立新型有效的细胞生物起搏技术奠定实验基础。结论:BMSCs转染HCN1、HCN2和HCN4基因后可提高向起搏样细胞诱导分化效率。

冯雨菲,何贵新,胡梦弦,郑国坤,肖婷,玉黎燕,申永艳,陈天宇,秦伟彬^[5]（2021）在《干细胞移植及中医药干预治疗心肌梗死的研究新进展》文中提出随着经济社会的快速发展,生活方式的改变以及人口老龄化的愈加严重,心肌梗死的发病率和病死率呈现明显的上升趋势,已然成为全世界范围内重大公共卫生问题。相较于其他治疗手段,干细胞移植作为修复梗死心肌的治疗思路越来越受到重视,其主要通过分化心肌细胞、促进血管新生和旁分泌功能三个方面来发挥修复作用,进而达到治疗效果。而中医药具有疗效确切、毒副作用小、多靶点、多环节、多通路的特点,在干细胞的增殖分化、迁移归巢等方面均起到积极作用。通过对干细胞移植治疗心肌梗死种类、机制、输注方式以及中医药干预等方面进行阐述,为相关研究提供参考。

孔艳^[6]（2020）在《负载BIO纳米胶束促进ADSCs对急性心肌梗死的治疗作用及其机制》文中指出急性心肌梗死（acute myocardial infarction,AMI）是一种常见的心血管疾病,发病率和死亡率都较高,严重危害人类生命健康。目前临床上主要采用药物和介入等方法治疗心肌梗死,但只能缓解症状,不能修复受损心肌组织。近年来,干细胞移植治疗受到广泛关注,其中脂肪来源干细胞（adipose-derived stem cells,ADSCs）是一种从脂肪组织中提取出来并具有多向分化潜能的成体干细胞,数量多、易获取、成本低、增殖快,而且自体可取,无免疫排斥反应之忧,是用于修复心肌梗死的理想干细胞之一。然而,由于心肌梗死后心肌组织缺血缺氧产生氧化应激,导致微环境恶劣,移植后干细胞的存留和存活率普遍较低,总体治疗效果不理想。因此,利用药物提高干细胞活力、增加其抗氧化能力,或者利用生物材料支架防止干细胞弥散、并为其提供良好的三维生长微环境,进而提高移植后干细胞的存活和存留率,是提高心肌梗死疗效的重要策略。（2’Z,3’E）-6-溴靛玉红-3’-肟（（2′Z,3′E）-6-Bromoindirubin-3′-oxime,BIO）是一种具有细胞渗透性的小分子物质,可以促进哺乳动物心肌细胞增殖、抑制心成纤维细胞增殖、调节梗死后微环境,进而提高心肌梗死的治疗效果,但相关机制尚未完全清楚。文献报道BIO对干细胞的分化具有重要作用,但对干细胞是否具有保护作用,进而提高干细胞移植治疗心肌梗死的效果,尚不清楚。Matrigel基质胶是一种可注射、温度敏感性的水凝胶,含有丰富的细胞外基质,已有研究表明心肌内注射Matrigel可以提高心肌梗死后的心功能,但其与干细胞的联合应用效果鲜有报道。因此,基于以上考虑,本研究利用过氧化氢（hydrogen peroxide,H2O2）诱导细胞氧化应激损伤,模拟心肌梗死后的微环境,探讨BIO对H2O2诱导的ADSCs和心肌细胞系H9c2细胞损伤的保护作用及其机制;应用纳米材料制备负载BIO温敏纳米胶束（BIO-N）,构建药物缓释系统,延长BIO对细胞的作用时间,以期提高药物的作用效果;通过结扎SD大鼠冠状动脉左前降支建立急性心肌梗死模型,观察ADSCs在体内的存留情况,以及BIO-N、Matrigel与ADSCs三者联合治疗对心肌梗死的治疗效果,探讨其可能机制。第一部分BIO对H2O2诱导ADSCs和H9c2细胞损伤的保护作用及其机制目的:探讨BIO对H2O2诱导ADSCs和H9c2细胞损伤的保护作用,并探讨其机制。方法:1.从SD大鼠双侧腹股沟区脂肪组织中提取ADSCs,流式细胞技术检测细胞表面标志物CD29、CD34、CD45和CD90;通过诱导分化液培养ADSCs,检测ADSCs成脂、成软骨和成骨的分化能力。2.不同浓度BIO预处理ADSCs 24h后,加入800μmol/L H2O2作用24h诱导细胞损伤,通过CCK-8试剂盒检测细胞活力,DCFH-DA染色流式细胞术检测细胞内活性氧水平（reactive oxygen species,ROS）,Rho123染色流式细胞术检测线粒体膜电位水平。3.在H2O2存在情况下,不同浓度BIO处理H9c2细胞24h,通过CCK-8试剂盒检测细胞活力,DCFH-DA染色流式细胞术检测细胞内活性氧水平。CCK-8试剂盒检测BIO对心成纤维细胞的作用。实时荧光定量PCR（q RT-RCR）检测细胞周期蛋白D1（cyclin D1）、细胞周期蛋白依赖性激酶1（cyclin-dependent kinases 1,CDK1）、细胞周期蛋白依赖性激酶2（CDK2）和细胞周期蛋白B（cyclin B）的m RNA水平。Western blot检测MAPK通路中ERK1/2、JNK和p38的蛋白表达水平,探讨在H2O2存在时,BIO对H9c2细胞作用的可能机制。结果:1.ADSCs表达间充质干细胞表面标志物CD29、CD90,不表达造血干细胞表面标志物CD34、CD45;ADSCs能够向脂肪细胞、软骨细胞和骨细胞分化,具有多向分化能力。2.BIO能够促进ADSCs增殖。BIO作用3天后,与对照组（0 group）比较,BIO（1、2.5、5、10μmol/L）组的细胞活力分别增长了（11.8±7.7）%、（39.9±4.2）%、（21.2±6.6）%、（8.3±13.2）%,其中2.5μmol/L和5μmol/L两组具有明显的统计学意义。不同浓度H2O2损伤ADSCs 24h后,细胞活力下降,在一定范围内呈浓度依赖性。根据实验结果,选用800μmol/L作为损伤浓度,建立氧化应激损伤模型。BIO预处理能够提高H2O2损伤后ADSCs的细胞活力。与H2O2组（0 group）比较,BIO（0.5、1、2.5、5μmol/L）组的细胞活力分别增长了（12.9±4.1）%、（18.2±2.6）%、（18.3±1.8）%、（6.8±5.4）%,其中1μmol/L和2.5μmol/L两组具有统计学意义。BIO抑制H2O2诱导ADSCs损伤产生的活性氧,降低细胞内活性氧水平。BIO改善H2O2诱导的线粒体膜电位的降低。与对照组（0 group）（100±3.1）%比较,BIO（1μmol/L和2.5μmol/L）组平均荧光强度分别为（120±9.6）%、（120±3.9）%。3.BIO能够促进H9c2细胞增殖。BIO作用3天后,与对照组（0 group）比较,BIO（1、2.5、5、10μmol/L）组细胞活力分别增长了（8.2±2.1）%、（26.2±8.7）%、（23.7±10.1）%、（0.4±1.8）%,其中2.5μmol/L和5μmol/L两组具有明显的统计学意义。BIO呈浓度依赖性抑制心成纤维细胞的增殖。BIO对H9c2细胞的保护作用:在H2O2存在的情况下,BIO处理H9c2细胞24h,与H2O2组（0 group）比较,BIO（0.5、1、2.5、5μmol/L）组细胞活力分别增长了（10.8±5.3）%、（17.6±5.8）%、（16.5±9.8）%、（1.2±2.1）%,其中1μmol/L和2.5μmol/L两种浓度的作用效果最明显。此外,BIO抑制H2O2诱导H9c2细胞损伤产生的活性氧,降低细胞内活性氧水平。H9c2细胞中cyclin D1、CDK1、CDK2和cyclin B的m RNA水平各组之间无明显统计学差异。在H2O2存在情况下,BIO能够促进H9c2细胞中p-ERK1/2和p-p38的表达、抑制p-JNK的表达。结论:1.BIO能够促进ADSCs增殖,预处理对H2O2诱导的ADSCs氧化应激损伤具有保护作用。2.BIO促进H9c2细胞增殖,对H2O2导致的H9c2细胞损伤具有保护作用,可能通过MAPK通路发挥作用。第二部分药物缓释系统的构建及生物相容性检测目的:制备负载BIO温敏纳米胶束（BIO-N）,检测BIO-N、Matrigel与ADSCs的生物相容性,为动物实验提供理论依据。方法:1.采用透析的方法,用聚乙二醇-聚已内酯（PEG-PCL）嵌段共聚物在水中自组装成空白温敏纳米胶束;PEG-PCL与BIO共混透析,制备负载BIO温敏纳米胶束（BIO-N）,构建药物缓释系统;通过紫外分光光度计检测BIO体外累积释放情况。2.通过动态/静态激光光散射仪（Dynamic/Static Light Scattering Instrument,DLS）检测空白纳米胶束粒径、BIO-N粒径;透射电镜（TEM）观察空白纳米胶束、BIO-N的形态;扫描电镜（SEM）观察BIO-N、ADSCs和Matrigel中的微观结构。3.将ADSCs种植在Matrigel基质胶（PBS:Matrigel=1:1稀释,蛋白量约4mg/ml）中,采用Live/Dead染色和激光共聚焦显微镜观察ADSCs在Matrigel中的三维生长和增殖情况;CCK-8试剂盒检测ADSCs在Matrigel中增殖及BIO-N对其增殖的影响。4.qRT-PCR检测ADSCs中血管内皮生长因子a（vascular endothelial growth factor a,VEGFa）、表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）、促血管生成素-1（angiopoietin-1,Ang-1）的m RNA表达情况。结果:1.PEG-PCL嵌段共聚物在水中自组装形成具有核-壳结构的空白温敏纳米胶束;共混透析后,疏水内核PCL将BIO包裹在内,亲水性壳PEG位于外侧,形成能够负载BIO的温敏纳米胶束（BIO-N）。PEG-PCL负载BIO后在水中形成稳定的悬浮液,BIO呈红色,收集的液体呈均匀红色,无沉淀,说明纳米胶束制备成功。BIO在BIO-N中持续释放时间长达5天,通过计算得出药物的包封率约为61.4%。2.DLS结果显示,空白纳米胶束粒径约为134nm,BIO-N胶束粒径约为270nm;透射电镜观察比较这两种胶束的形态,结果与DLS一致;扫描电镜结果显示,Matrigel成网状结构,可以将ADSCs包裹在内,而BIO-N散布在Matrigel中,粒径大小与DLS结果基本一致。3.Live/Dead染色后,激光共聚焦显微镜观察ADSCs在Matrigel三维环境中的生长情况。结果显示,不同时间点（1、3和7天）镜下只有少量细胞呈红色（死细胞）,大多数细胞呈绿色（活细胞）;CCK-8结果显示,与对照组相比,1天时,BIO-N能够促进ADSCs在Matrigel中的增殖,3天和7天时,这种促进增殖的效果更明显。4.qRT-PCR结果显示,BIO-N/Matrigel组能够促进ADSCs中VEGFa、EGF、Ang-1的m RNA表达,利于ADSCs在体内发挥治疗效果。结论:PEG-PCL、Matrigel两种材料与ADSCs具有良好的生物相容性,为BIO-N、Matrigel与ADSCs三者联合治疗急性心肌梗死提供重要的体外实验依据。第三部分BIO-N、Matrigel与ADSCs联合治疗急性心肌梗死的效果及其机制目的:观察BIO-N、Matrigel与ADSCs三者联合治疗急性心肌梗死的效果,并探讨其可能的作用机制。方法:1.建立急性心肌梗死模型:取体重200±15 g雄性SD大鼠,用7-0无损伤缝线结扎冠状动脉左前降支,可见梗死区域心肌组织由红色逐步发白,同时心电图（ECG）显示ST段抬高,说明急性心肌梗死损伤模型构建成功。2.心肌梗死模型建立成功后,进行分组治疗:实验分组（1）MI组,注射PBS;（2）ADSCs组,将ADSCs重悬在PBS中,注入心肌梗死周边区;（3）BIO-N+ADSCs组,ADSCs重悬在PBS中,并加入BIO-N;（4）BIO-N/Matrigel+ADSCs组,将ADSCs+BIO-N与Matrigel充分混匀后（冰上操作）,注入心肌梗死周边区。ADSCs-GFP+追踪:从转基因SD大鼠中提取ADSCs-GFP+;体内细胞追踪注射ADSCs-GFP+,治疗3、7和14天后,将后三组大鼠麻醉处死,取出心脏样本,4%多聚甲醛固定,蔗糖梯度脱水,OCT包埋,进行冰冻组织切片,观察ADSCs-GFP+在体内的存留情况。免疫荧光检测不同时间点（3、7和14天）心肌组织中EGF和VEGF的表达。3.组织学观察:治疗4周后,取出心脏组织,4%多聚甲醛固定,石蜡包埋后切片,然后采用HE染色和Masson染色观察心肌梗死面积和组织纤维化比例;采用免疫组织化学方法Anti-Von Willebrand Factor抗体（v WF）染色观察血管生成情况。4.利用超声心动图检测心功能,定量分析左心室舒张末期内径（LVIDd）、左心室收缩末期内径（LVIDs）、左心室射血分数（LVEF）和左心室短轴缩短率（LVFS）的变化。结果:1.ADSCs-GFP+体内追踪结果显示,ADSCs在体内的存留随着时间的推移不断减少,3天时,心肌内存留较多;7天时,细胞存留急剧减少;14天时,ADSCs-GFP+存留很低。通过定量分析绿色荧光区域面积比较各组ADSCs在体内的存留情况,结果显示,3天时,BIO-N+ADSCs组和BIO-N/Matrigel+ADSCs组绿色荧光区域面积分别是ADSCs组的1.6倍、2.4倍;7天时,两组分别是ADSCs组的1.8倍、2.4倍;14天时,ADSCs组荧光区域面积极低,两组分别是ADSCs组的4.1倍、6.5倍。与ADSCs组比较,三个不同时间点BIO-N+ADSCs组荧光区域面积较大,而BIO-N/Matrigel+ADSCs组荧光区域面积最大。治疗3天后,各组都无EGF表达;治疗7和14天,MI组无因子表达,但治疗组出现不同程度的EGF表达;MI组无VEGF表达;但在治疗3、7和14天后,治疗组出现不同程度的VEGF表达。2.HE染色和Masson染色结果显示,治疗4周后,与MI组比较,BIO-N+ADSCs组和BIO-N/Matrigel+ADSCs组心肌梗死面积分别降低了40%、55%;治疗后,胶原比例降低,心肌组织纤维化程度减轻,与MI组比较,BIO-N+ADSCs组和BIO-N/Matrigel+ADSCs联合治疗组胶原比例分别降低了39%、60%。3.治疗4周后,v WF染色结果显示,BIO-N+ADSCs组和BIO-N/Matrigel+ADSCs组血管生成数量分别是MI组的2.8倍、4.2倍。BIO-N/Matrigel+ADSCs组血管生成最多。4.超声心动图结果显示,治疗4周后,与MI组比较,BIO-N+ADSCs组射血分数提高了23%,改善了梗死后心功能,而BIO-N/Matrigel+ADSCs联合治疗组的射血分数提高了34%,心功能改善最明显。结论:通过制备负载BIO纳米胶束（BIO-N）构建药物缓释系统,在一定程度上能够提高心肌梗死的治疗效果,而BIO-N、Matrigel和ADSCs三者联合治疗修复急性心肌梗死的效果最明显。

韩刘君^[7]（2020）在《兔骨髓间充质干细胞体外构建血管化组织工程心肌的实验研究》文中提出目的利用兔骨髓间充质干细胞作为种子细胞,分别诱导为心肌样细胞和内皮细胞,于体外构建血管化组织工程心肌组织,为临床上通过组织工程与细胞移植技术治疗心肌梗死这一疾病提供理论基础和技术支持。方法1选取普通级日本大耳白兔,无菌分离双侧股骨及胫骨,采用Percoll分离液分离兔骨髓间充质干细胞并使用流式细胞仪鉴定其表面标志物CD90、CD105和CD45。使用内皮细胞条件培养基（Endothelial cell culture medium,ECM）对兔骨髓间充质干细胞诱导为内皮细胞,采用免疫细胞化学染色的方法对表面标志物CD34和CD31进行鉴定。显微镜下观察兔骨髓间充质干细胞和内皮细胞的形态学变化。2使用5-氮胞苷对兔骨髓间充质干细胞定向诱导为心肌样细胞,免疫细胞化学染色的方法对表面标志物心肌肌钙蛋白T（Cardiac troponin T,c TNT）进行鉴定,并于显微镜下观察诱导后细胞的形态学变化。3分别使用4,6-二氨基-2-苯基吲哚（4,6-diamino-2-phenylindole,DAPI）和氯甲基苯甲酰氨（Chloromethylbenzamidodialkylcarbocyanine,CM-DIL）标记心肌样细胞和内皮细胞。4将诱导后获得的心肌样细胞与内皮细胞按照不同比例进行共培养（1∶0、0∶1、1∶1、1∶2）。5将不同组的细胞接种至Matrigel基质胶和胶原海绵两种支架材料上,观察细胞-支架材料复合物的血管化形成能力。6采用SPSS 23.0统计软件对实验数据进行统计学分析,计量资料使用均数±标准差（sx±）的形式表示,多个样本的均数之间的比较采用单因素方差分析,以P<0.05表示具有显着性差异。采用Graph Pad Prism 8.0软件进行图形的绘制。结果1通过流式细胞仪技术检测可观察到使用Percoll分离液的方法可获得兔骨髓间充质干细胞,CD90和CD105表面标志物呈现为阳性表达,CD45为阴性表达,显微镜下可观察到48小时的兔骨髓间充质干细胞形态为透亮圆形、折光性较强,第1代的兔骨髓间充质干细胞,细胞长短伸展不一,形态多为短梭形,内含少量杂质细胞,第2代的兔骨髓间充质干细胞,细胞呈现为梭形,第3代的兔骨髓间充质干细胞,细胞体积较起始细胞体积大,形态变为长梭形,多边形。2使用内皮细胞条件培养基（ECM）对兔骨髓间充质干细胞诱导后可获得内皮细胞,经免疫细胞化学染色的方法进行鉴定,结果表明诱导后的细胞表达CD31和CD34,显微镜下可观察到内皮细胞在48小时后部分细胞开始贴壁,细胞形态大小不一致,呈现条索样变化;传至第1代时,细胞形态变为短小细条索状,有少许透亮点;待细胞进行第2次传代,可观察到细胞数量较前明显增多,排列为“铺路石样”改变;传至第3代,细胞为长梭形改变。3 DAPI荧光染料标记心肌样细胞,可观察到细胞核标记为蓝色,CM-DIL荧光染料标记内皮细胞,可观察到细胞膜标记为红色。4使用10umol/L的5-氮胞苷对兔骨髓间充质干细胞定向诱导为心肌样细胞,经免疫细胞化学染色的方法进行鉴定,观察到诱导后的细胞心肌标志物c TNT表达为阳性,经5-氮胞苷诱导24小时的细胞形态呈现为多角形,分布不均,生长缓慢,诱导3天后,细胞体积较前增大,诱导5天后,细胞开始伸出长短不一的伪足,诱导7天后细胞伸出明显伪足,偶有相互连接,细胞胞体呈现为高亮状态,诱导3周,细胞之间聚集数量逐渐减少,诱导1月可观察到细胞形态发生明显变化,细胞数量明显减少。5体外构建细胞-支架材料复合物,将不同组别的细胞接种至Matrigel基质胶上,可观察到心肌样细胞与兔骨髓源性内皮细胞以1∶2共培养条件下的血管网状结构的形成能力最强,而在胶原海绵支架材料上只观察到细胞在胶原海绵生长,无血管网状结构的形成。结论1使用内皮细胞条件培养基诱导兔骨髓间充质干细胞可获得内皮细胞。2 5-氮胞苷诱导兔骨髓间充质干细胞可获得心肌样细胞。3体外构建血管化细胞-支架材料复合物,支架材料的选择上Matrigel基质胶相比较胶原海绵更合适。4细胞-支架材料复合物形成血管化的能力上,心肌样细胞与内皮细胞以1∶2比例进行共培养条件下的血管网状结构的形成能力最强。图15幅;表2个;参118篇。

赵乐^[8]（2020）在《重组Resilin蛋白源水凝胶的制备及其在心肌组织工程中的应用》文中指出心肌梗死在我国具有很高的发病率和死亡率。心梗后心肌细胞死亡,由于心脏再生能力极其有限,依靠其自身修复机制无法弥补损失的心肌细胞,梗死心肌组织纤维化及残存心肌的代偿性肥大进一步使患者发展为心力衰竭,进而导致死亡。现有治疗手段虽能在一定程度上缓解患者症状,但不能从根本上解决缺血后心肌损伤修复的难题,从而无法抑制心梗后负性心室重构,终将导致心衰。可注射性心肌组织工程策略,即以可注射性水凝胶材料为载体携带细胞和/或生长因子注射到心肌损伤部位进行损伤修复,有望成为除药物、血运重建术、心脏移植以外新的治疗手段。近年来,随着心肌组织工程可注射性水凝胶材料相关研究的不断深入,具有良好生物相容性的弹性材料逐渐受到研究人员的关注。研究表明,弹性水凝胶材料不仅可以作为携带细胞、生长因子等目标物质的载体,还因具备良好的弹性和可拉伸性,能够为心肌组织提供机械性辅助并改善梗死组织的力学微环境,从而改善梗死组织局部心肌运动障碍、降低室壁应力,有利于损伤部位的修复和心脏功能的改善。节肢弹性蛋白（Resilin）是一种在昆虫节肢中发现的弹性蛋白,因其表现出显着的弹性、回弹性以及抗疲劳性等特点而备受关注。自鉴定出第一个resilin蛋白的基因序列以来,人们已经设计出多种基于resilin序列的重组序列并构建出多种resilin样蛋白,已成功应用于组织工程与药物递送领域,尤其在血管、声带、软骨和肌肉等组织工程研究中进展迅速。在重组resilin蛋白源弹性材料研究中,基于RLP12蛋白的resilin水凝胶材料的因具有良好的力学性能和生物活性近年来备受关注。RLP12蛋白是在resilin核心弹性序列的基础上添加了细胞结合域,因此其交联形成的水凝胶能够表现出优异的细胞粘附性以及促细胞增殖的能力,并对声带损伤具有修复作用。然而,在可注射性心肌组织工程中,resilin样蛋白来源的水凝胶是否能够作为干细胞的可注射载体用于梗死心肌的损伤修复尚不明确。本研究首先通过基因工程方法构建不同的重组resilin蛋白表达载体,经诱导表达和纯化后分别获得resilin样蛋白rec1-resilin以及RLP12,并利用化学交联法制备基于RLP12蛋白的resilin水凝胶材料;在此基础上,以RLP12源resilin水凝胶为载体携带红色荧光蛋白标记的BADSCs进行大鼠心梗移植,对其心梗损伤修复能力进行深入研究,验证RLP12源resilin水凝胶携带BADSCs心梗注射进行心肌损伤修复的可行性与效果。本论文主要包含以下两部分研究内容:第一部分:Resilin样蛋白源水凝胶材料的制备目的:制备resilin样蛋白源水凝胶并对其力学性能进行测定。方法:构建两种重组resilin蛋白表达载体RLP12与rec1-resilin并对其进行诱导表达与纯化;利用化学交联法制备出基于RLP12蛋白的resilin水凝胶材料,并通过振荡剪切流变特性检测试验对其力学性能进行鉴定。结果:成功构建了重组resilin蛋白表达载体RLP12与rec1-resilin,诱导表达纯化后分别获得RLP12蛋白与rec1-resilin蛋白;利用THP交联获得了3种不同PEG含量的RLP12-resilin水凝胶,振荡剪切流变特性检测结果表明其剪切模量为10k Pa-15k Pa。结论:成功制备了RLP12蛋白与rec1-resilin蛋白并获得了基于RLP12蛋白的resilin水凝胶材料。第二部分:以Resilin水凝胶为载体携带棕色脂肪源干细胞（BADSCs）心梗移植的心肌损伤修复研究目的:验证resilin样蛋白水凝胶材料作为干细胞可注射性载体用于梗死心肌损伤修复的可行性与效果。方法:以RLP12蛋白源resilin水凝胶为载体携带红色荧光蛋白标记的BADSCs进行大鼠心梗移植,通过心脏超声对移植4周后心脏功能进行测定;通过组织学、免疫组织化学染色、免疫荧光染色等方法对心梗面积、胶原沉积、微血管密度、BADSCs体内存活与分化进行检测。结果:RLP12源resilin水凝胶作为BADSCs的载体,能显着提高BADSCs在心肌组织中存活;移植4周后可以显着改善心梗大鼠的心脏功能、减少心梗面积、降低纤维沉积水平并提高微血管密度;RLP12源resilin水凝胶能够提高Ⅲ型胶原在心梗区域与心梗边缘区域的分布水平。此外,RLP12源resilin水凝胶能够提高BADSCs在体内向c Tn T阳性细胞、α-SMA阳性细胞的分化能力。结论:RLP12源resilin水凝胶能够作为干细胞的可注射性载体用于心肌梗死的治疗,其可能通过改善心梗部位力学微环境增加Ⅲ型胶原的分布,进而提高心肌组织的顺应性。本研究首次以RLP12源resilin水凝胶为载体携带棕色脂肪源干细胞进行大鼠心梗移植,实现了抑制心梗后负性心室重塑、提高心脏功能的作用。本研究有望拓展resilin样蛋白作为弹性材料在心肌组织工程中的应用范围,也可为基于可注射水凝胶与干细胞的心梗治疗提供新的指导,对未来缺血性心脏病治疗具有重要意义。

周军^[9]（2020）在《多功能肽修饰的胺碘酮纳米脂质体的建立及心肌靶向性的研究》文中指出冠状动脉粥样硬化性心脏病简称冠心病,已成为目前全球导致死亡最多的疾病之一,临床治疗方法包括药物治疗、介入治疗和外科手术治疗。胺碘酮（Amiodarone,AMD）是Ⅲ类（钾通道阻滞剂）抗心律失常药物,同时具有扩张冠状动脉和改善心肌供血的作用,但是,该药长期使用很容易引起非靶器官部位的药物蓄积,导致一系列不良反应,从而制约了胺碘酮的临床应用。纳米脂质体（Nanoliposome,NLPs）具有类细胞结构,能够改变包封药物的体内分布,提高药物的治疗指数、减少药物的使用剂量和降低药物的毒性,目前,在心血管领域中应用的主要为普通胺碘酮脂质体（AMD-NLPs）或单靶头修饰的纳米脂质体载药系统,但仍存在一些不足,主要表现为:①药物包封率不够理想,缓释过快;②组织器官的特异选择性不强,其在提高药物心脏内导入的同时,也可能增加其他组织器官的药物分布;③药物导入心脏后,往往难以进一步导向至病灶部位,使治疗效果受到很大影响,不能长久维持有效的药物浓度。因此,更多的研究者致力于开发和研制新的药物载体,并对载体进行靶头修饰,从而使得药物的靶向性更强,疗效更好。本研究拟构建一个双重靶向的纳米脂质体系统,即将两种不同靶向作用的功能纳米材料PCM-1（W L S EAGPVVTVRA L R G T G S W,心肌细胞特异性靶向肽）和TAT（YGRKKRRQRRR,细胞穿膜肽）组合在普通纳米脂质体系统中构建成具有双重靶向效果的胺碘酮纳米脂质体（PCM-1/TAT AMD-NLPs,简称PTA-NLPs）系统,选用胺碘酮作为药物,通过高压均质法制备了PCM-1和TAT双重修饰的胺碘酮纳米脂质体,采用心肌细胞（Myocardial Cells,MCs）评价PTA-NLPs的细胞毒性和摄取能力,通过建立大鼠心肌梗死模型后将双重靶头的AMD纳米脂质体缓慢尾静脉注射,检测模型大鼠的心电图ST段数据,测定血清肌酸激酶（CK）、乳酸脱氢酶（LDH）、天冬氨酸转氨酶（AST）和丙二醛（MDA）的含量,观察大鼠心肌梗死面积等,评价双重靶头是否比单靶头修饰的胺碘酮脂质体具有更强的心肌靶向性,更易富集于心肌部位。第一部分 PCM-1和TAT共修饰胺碘酮纳米脂质体的制备和表征目的:构建PCM-1和TAT双重修饰的胺碘酮纳米脂质体（PTA-NLPs）并对PTA-NLPs进行表征分析。方法:1、称取大豆磷脂60mg、胆固醇30mg、DSPE-PEG2000-PCM-1 3mg和DSPE-PEG2000-TAT 2mg于烧瓶中,加入三氯甲烷5mL溶解;另称取处方量的胺碘酮2mg于烧瓶中,加入无水乙醇2mL溶解,于50℃恒温磁力搅拌条件下,将乙醇溶液以注射器缓慢滴加至三氯甲烷溶液中,得到粗纳米混悬液。再于冰浴条件下以一定功率（工作4s,间歇2s）进行超声分散,得均匀纳米脂质体溶液,后经旋转蒸发除去有机溶剂,得均匀薄膜,真空干燥2h后,加入2mLPBS（Phosphate Buffer Saline,磷酸缓冲盐）进行水化,后经冻干,得胺碘酮纳米脂质体。2、用激光散射粒度仪分别测定纳米脂质体的光散射粒径和Zeta电位,测定前样品用双蒸水3mL稀释。取纳米脂质体溶液0.5mL,应用2%磷钨酸1mL负染色制备样品,混匀后将铜网有Formavar支持膜的一面盖于染液液滴上,正染色15～30min,铜网自然晾干后于透射电镜下观察纳米脂质体的形态。3、将所制备的PTA-NLPs冻干粉放置于无菌西林瓶中,密闭保存于0～4℃冰箱冷藏,分别于放置后的1、2和3月后取样10mg,测定PTA-NLPs的粒径与包封率,并通过电子显微镜观察其稳定性。结果:1、所制备的 PTA-NLPs 粒径为（124.31±13.62）nm,PDI（Polydispersity Index,多分散指数）为 0.21,包封率为（88.61±4.23）%,Zeta 电位为（-17.53±1.91）mV。2、使用单因素考察方法筛选出优化的处方为:胺碘酮2mg、大豆磷脂60mg、胆固醇 30mg、DSPE-PEG2000-PCM-1 3mg、DSPE-PEG2000-TAT2mg 和水化介质 2mL。3、透射电子显微镜观察显示本品外观呈类球型,表面光滑,无相互聚集现象,分散均匀;将PTA-NLPs于冷藏条件下避光保存3个月后,粒径、zeta电位等基本特征不变,表明其稳定性良好。结论:1、通过高压均质法制备PCM-1和TAT双重修饰的胺碘酮纳米脂质体,并通过单因素观察方法筛选出优化的处方配比。2、根据优化的处方配比所制备的PTA-NLPs粒径为（124.31±13.62）nm,PDI为 0.21,包封率（88.61±4.23）%,Zeta 电位（-17.53±1.91）mV。3、根据优化的处方配比所制备的PTA-NLPs,透射电镜下观察到外观呈类球型,表面光滑,无相互聚集现象,在冷藏条件下保存3个月后基本特征不变,稳定性良好。第二部分 PCM-1和TAT共修饰胺碘酮纳米脂质体的体外评价目的:通过体外方法评价PCM-1和TAT双重修饰的胺碘酮纳米脂质体（PTA-NLPs）的体外释放度、对MCs生长抑制情况及MCs对PTA-NLPs的摄取能力。方法:1、采用透析袋方法评价PTA-NLPs的体外释放行为。称取PTA-NLPs 100mg置于截留分子量8000～12000的透析袋中,扎紧袋口,放入装有200mL PBS（pH=7.4）释放介质中,于37℃恒温水浴中、200转/分振荡下进行释放试验,在释放开始后的0.5、1、2、3、4、6、8、10和12h抽取介质1mL,用0.45μm微孔滤膜过滤;同时,用相同剂量的 free AMD、A-NLPs（AMD-NLPs）、PA-NLPs（PCM-1 AMD-NLPs）和 TA-NLPs（TAT AMD-NLPs）作为对照;用 HPLC（High Performance Liquid Chromatography,高效液相色谱）测定各样品在各时间点介质中药物的实际测定浓度C测,按公式c校=c测+1/200（?）c测 算得校正浓度,以校正浓度计算累积释放百分率。2、用96孔培养板将MCs在37℃和5%CO2的培养箱中培养24小时,丢弃培养液,用PBS仔细洗涤细胞两次,然后加入不同的AMD制剂（free AMD、A-NLPs、PA-NLPs（PCM-1 AMD-NLPs）、TA-NLPs 和 PTA-NLPs）,剂量从5μg/mL 到 50μg/mL,加入60μL噻唑蓝溶液（5mg/mL）和1mL的培养液,在培养箱中孵育4小时,检测胺碘酮纳米脂质体对MCs生长的抑制作用。将上清液吸出并丢弃,每个孔加入150μL的DMSO（Dimethyl Sulfoxide,二甲基亚砜）,置平坦摇床上震荡5分钟,在570nm处用酶标仪测定吸光度值（A）,计算细胞抑制率=[（A空白对照组-A给药组）/A空白对照组]×100%。3、采用绿色荧光的香豆素-6（C6,浓度为100mg/mL）为荧光探针,按AMD纳米脂质体的制备方法,结合薄膜水化法将C6包埋于纳米脂质体的亲脂性内核中,即可获得带绿色荧光的AMD相关纳米脂质体。在12孔培养板中接种MCs,培养液为含10%牛血清的DMEM（Dulbeccos Modified Eagle Medium,含各种氨基酸和葡萄糖的培养基）,控制细胞密度为4.0×105个/孔,培养时间为24小时,然后将各组AMD制剂（free AMD、A-NLPs、PA-NLPs、TA-NLPs 和 PTA-NLPs）,分别与 MCs 共同孵育2小时后,用PBS溶液（pH 7.4）洗涤细胞3次,尽可能清除细胞外残留的荧光物质,最后使用激光扫描共聚焦显微镜观察香豆素-6在细胞内的分布情况。同时,用胰酶消化MCs为单细胞悬液后采用流式细胞仪进行定量检测,测定荧光强度。结果:1、PTA-NLPs在pH=7.4的PBS溶液中进行体外释放12h,累积释放百分率仅为（53.3±0.3）%,具有较强的缓释性能,PTA-NLPs的缓慢释放特性有利于系统在体内的稳定性从而改变药物本身的体内分布行为。2、通过 MTT（3-（4,5）-dimethylthiahiazo（-z-y1）-3,5-di-phenytetrazoliumromide,噻唑蓝）实验,比较了 free AMD 组、A-NLPs 组、PA-NLPs 组、TA-NLPs 组和 PTA-NLPs组的细胞毒性,直至当浓度达到50μg/mL时,各组制剂都明显抑制了心肌细胞的生长,且与对照组相比有显着的统计学差异（p<0.05）,但当浓度小于50μg/mL时,各组制剂均对心肌细胞活性没有明显影响（p>0.05）。3、采用流式细胞仪检测心肌细胞对PTA-NLPs摄取的计数为102～103个,明显优于对PA-NLPs和TA-NLPs的摄取,表明PCM-1和TAT共同修饰后可以起到协同增效的作用,增加AMD药物进入心肌细胞的能力。结论:1、PTA-NLPs体外释放12h的累积释放百分率仅为（53.3±0.3）%,表明PTA-NLPs具有较强的缓释性能,有利于载药系统在体内的稳定性,从而改变药物本身的体内分布行为。2、PTA-NLPs浓度小于50 μg/mL时没有明显的细胞毒性。3、MCs对PTA-NLPs的摄取能力明显优于PA-NLPs和TA-NLPs,表明PCM-1和TAT共同修饰后可以起到协同增效的作用,增加AMD药物进入心肌细胞的能力。第三部分 PCM-1和TAT共修饰胺碘酮纳米脂质体的药动学及组织分布研究目的:探讨PTA-NLPs系统在实验动物中的药动学和组织分布。方法:1、采用HPLC检测方法检测AMD在体内的药物浓度。取空白血浆0.3mL分别加入不同量的AMD贮备液,制备成浓度为50 ng/mL、500ng/mL和2500ng/mL的标准血样,每种浓度重复3次,以药物峰面积比值（A）对药物浓度（C）进行线性回归,得标准曲线方程（A=7.276C-1.283）。大鼠尾静脉注射给药后进行HPLC测定药物峰面积,由标准曲线计算AMD在体内的药物浓度。2、将30只健康Sprague Dawley大鼠随机分为5组,每组6只。各组（AMD溶液剂、A-NLPs、PA-NLPs、TA-NLPs和PTA-NLPs）分别通过尾部静脉给予5mg/kg,分别在给药前和给药后的0.5、1、2、4、6、8、10、12和24 h通过眼部静脉采血0.6mL,收集于加有肝素的聚丙烯离心管内,12000r/min离心1 min,分离血浆并于-18℃冰箱中储存,待作血药浓度分析。3、将180只健康昆明种小鼠随机分为5组,每组36只,每组每个时间点重复6只小鼠。各组（AMD 溶液剂、A-NLPs、PA-NLPs、TA-NLPs 和 PTA-NLPs）分别通过尾部静脉给予5mg/kg,分别在给药后的0.5、1、2、4、8和12h摘眼球取血约0.6mL,置于事前加过肝素的离心管中,12000r/min离心10min后分离血浆,于-20℃保存待测药物浓度。同时,断颈处死小鼠,取出心、肝、脾、肺和肾,用适量生理盐水清洗,经滤纸吸干血浆,用于组织药物浓度的测定和应用苏木精-伊红（H&E）染色观察组织病理学变化。结果:1、HPLC测定显示AMD峰形对称,陡尖,分离度良好,主峰附近无杂质峰干扰。不同浓度（50ng/mL、500 ng/mL和2500ng/mL）血浆和组织样品的方法回收率在90～105%之间,提取回收率均>（70±3）%,日内及日间RSD（Relative standard deviation,相对标准偏差）差异有统计学意义（P<0.05）。2、AMD溶液剂组给药后的药物浓度是几组中最高的（313.3ng/mL）,但随后浓度迅速下降（消除半衰期为2.6h）,10h时已完全代谢。当AMD以NLPs形式进入体内后其达峰的血药浓度显着下降,维持在130～160ng/mL,但消除半衰期明显延长,双重修饰的AMD-NLPs消除半衰期可达到7.2h,10h时浓度为30.70ng/mL,24h时血药浓度为11.16ng/mL。3、在实验组（PTA-NLPs）药物在不同组织中分布有明显差异,特别是在心脏,PTA-NLPs组小鼠心脏1h时的胺碘酮浓度达到354ng/g,明显高于其他组织和血浆,有明显统计学差异（P<0.05）。病理切片观察发现PTA-NLPs组小鼠在给药12h后各个脏器未见明显组织学变化。结论:1、建立HPLC方法用于AMD浓度的测定,验证了血浆样品和组织样品的AMD测定方法,该测定方法符合生物样品分析要求,具有专属性好、灵敏度高和简单等特点。2、PTA-NLPs系统的药动学和组织学分布研究表明PTA-NLPs系统不仅能延缓药物在体内的释放起到长循环效应,而且更多地富集于心脏且无器官的组织学变化,为后续的临床疗效研究打下了基础。第四部分 PCM-1和TAT共修饰胺碘酮纳米脂质体的药效学研究目的:构建大鼠心肌梗死模型进行AMD纳米脂质体的药效学评价。方法:将90只SD大鼠随机分成9组,每组10只,分为假手术组、模型组、AMD组、A-NLPs 组、PA-NLPs 组、TA-NLPs 组、PTA-NLPs（低剂量）组、PTA-NLPs（中剂量）组和PTA-NLPs（高剂量）组。将SD大鼠用3%戊巴比妥钠（30mg/kg）行腹腔注射,麻醉后仰卧固定在动物手术台上,气管插管后连接动物呼吸机,采用标准Ⅱ导联记录大鼠心电图,沿胸骨左缘第2～4肋间隙开胸,暴露心脏,剪开心包膜,采用无创缝合丝线在左心耳下距主动脉根部2-3mm处用6-0线穿过一小束心肌并结扎冠状动脉前降支（假手术组仅穿线不结扎）,心电图Ⅱ导联ST段抬高作标志心肌梗死模型制备成功。根据分组,在冠状动脉结扎后5min缓慢尾静脉注射不同的制剂。采用大鼠心电图机监测心电图,记录各组给药后30、60、90和120min的ST段变化情况。注射给药120min后解剖大鼠,打开腹腔,用无菌注射器抽取腹主动脉血约5mL,静置5min后离心分离血清,测定大鼠血清中肌酸激酶（CK）、乳酸脱氢酶（LDH）、天冬氨酸转氨酶（AST）和丙二醛（MDA）的含量。抽取腹主动脉血液后迅速剪开胸腔摘取心脏,用PBS冲洗心脏去除血迹,沿冠状沟切除右心室,保留左心室,沿心尖到心基底部方向平行在结扎线以下将心室切成4-5 片,置 0.1%NBT（Nitro-Blue Tetrazolium,氮蓝四唑）染液中 37℃孵育10min 后取出,用滤纸吸尽水分,用Image ProPlus 6.0图像分析软件处理图像,求算心肌梗死区面积和左心室面积,按两者之比计算心肌梗死面积比（心肌梗死面积比=梗死区面积/左心室面积）。结果:1、ST段的变化:在120min的观察期内模型组大鼠ST段抬高维持在一个比较高的水平,没有下降趋势;接受不同AMD制剂大鼠的ST段均有不同程度的下降,双重靶头AMD纳米脂质体高剂量组的ST段下降最为显着,达到（0.09±0.07）mV,与其他几组相比差异具有统计学意义（p<0.05）。2、生化指标变化:与模型组比较,各AMD组急性心肌梗死模型大鼠血清中的CK、LDH、AST和MDA水平均下降,双重靶头修饰的纳米脂质体效果明显优于单靶头纳米脂质体,以PTA-NLPs在的下降幅度最大（CK:（3289.50±1102.90）U/L;LDH:（1854.60±191.30）U/L;AST:（583.50±142.70）U/L;MDA:（8.20±2.10）U/L;P<0.05）。3、心肌梗死面积:模型组大鼠的心肌梗死面积比在38%左右,给予不同AMD制剂后,各组的心肌梗死面积比均有不同程度的下降,高中低三个剂量的双靶头AMD纳米脂质体组均显着减小心肌梗死面积比,PTA-NLPs高剂量组（13%）的心肌梗死面积比下降最为显着。结论:1、大鼠急性心肌梗死模型各AMD组的ST段抬高均有不同程度的下降,以高剂量PTA-NLPs组下降幅度最显着,表明双重靶头胺碘酮脂质体（尤其高剂量）比单靶头胺碘酮脂质体更明显地降低模型大鼠的ST段。2、双重靶头胺碘酮脂质体AMD（尤其高剂量）比单靶头胺碘酮脂质体显着降低心肌梗死模型大鼠血清中的CK、LDH、AST和MDA水平。3、不同AMD制剂组的心肌梗死面积比均有不同程度的下降,以高剂量PTA-NLPs组的下降幅度最显着,表明双重靶头脂质体（尤其高剂量）比单靶头脂质体能使模型大鼠的心肌梗死面积减小更明显。

荆宇澄^[10]（2020）在《人脐带间充质干细胞移植治疗冠心病患者临床疗效观察》文中研究表明背景:冠心病（coronary heart disease,CHD）的传统治疗方法虽可暂时缓解病痛和改善生活质量,却无法使梗死的心肌修复再生,而干细胞具备的组织再生和多向分化潜能为IHD的治疗带来新的契机。人脐带间充质干细胞（human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells,UC-MSCs）因具备极易分离提取、无免疫排斥、无伦理学争议以及较强的免疫调节作用等优势而成为治疗CHD的理想候选种子细胞之一。目的:探讨UC-MSCs移植治疗CHD患者3年后心功能的影响。方法:2013年1月-2016年6月,收治河北医科大学第一医院冠心病患者8例,随机分为干细胞移植组和对照组,其中移植组4例行常规治疗并静脉输注UC-MSCs,对照组4例仅行常规治疗,3年后评估两组患者心功能、生化指标、心电图导联ST段的变化。结果:治疗3年后,2组患者均存活。试验组左室射血分数（Left Ventricular Ejection Fraction,LVEF）（55.75±10.69）%和短轴缩短率（Left Ventricular Fraction Shortening,LVFS）（30.00±6.78）%分别较对照组的（52.25±12.95）和（27.50±7.77）均有升高趋势（P>0.05）,但干细胞组治疗组的LVEF（6.50±3.42）和LVFS（4.25±2.22）的差值分别较对照组相比（-2.25±4.57）和（-1.5±2.87）显着升高（P<0.05）,但两组间心功能分级（New York Heart Association,NYHA）无显着变化。进一步比较两组患者生化指标和心电图导联ST段变化,均无显着差异（P>0.05）。结论:CHD患者中经UC-MSCs治疗后患者部分心脏超声测量指标较对照组患者相应指标比较呈改善趋势,其中试验组LVEF和LVFS的差值较对照组升高有统计学差异,而2组间心功能分级、生化指标、心电图ST段变化无统计学差异,故这一新的治疗方法的意义有待进一步研究,及UC-MSCs治疗的风险和带来的益处的大小也值得进一步研究。目的:探究SD大鼠心肌梗死后移植人脐带间充质干细胞（human Umbilical Cord Mesenchymal Stem cells,h UC-MSCs）和黄芪甲苷（astragaloside,AST）对心功能修复的影响,并探究人脐带间充质干细胞联合黄芪甲苷治疗心肌梗死（Myocardial infarction,MI）的疗效。方法:1.选择雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠20只,随机分为5组:假手术组（Sham）4只,心梗组（MI）4只,心梗后移植人脐带间充质干细胞（MI+h UC-MSCs）4只,心梗组后移植黄芪甲苷组（MI+AST）4只,心梗后移植脐带间充质干细胞及黄芪甲苷组（MI+h UC-MSCs+AST）4只。通过开胸结扎心脏左前降支建立心梗模型,单纯MI组只开胸结扎大鼠前降支不行其他处理,Sham组只开胸不接扎,所有需注射h UC-MSCs大鼠均于心梗手术2天后移植h UC-MSCs;所有需AST干预的大鼠均于心梗手术当天开始黄芪甲苷灌胃,连续灌胃7天。所有组大鼠均于开胸手术及心梗手术后4周时行超声心动图检查并采集相关数据。结果:1.MI组术后较Sham组相比左室射血分数（Left Ventricular Ejection Fraction,LVEF）、左室短轴缩短率（Left Ventricular Fractional Shortening,LVFS）下降明显,且具有统计学意义（P<0.05）,提示心功能下降明显。MI组与Sham组相比较左室收缩末前后径（Left Ventricular End-Systolic Diameter,LVESD）、左室舒张末前后径（Left Ventricular End-Diastolic Diameter,LVEDD）、左室收缩末容积（Left Ventricular End-Systolic Volume,LVESV）、左室舒张末容积（Left Ventricular End-Diastolic Volume,LVEDV）增大,提示左室重塑明显。2.而MI+h UC-MSCs+AST组与MI组相比较LVEF、LVFS提高,有统计学意义（P<0.05）,且LVESD、LVEDD、LVESV、LVEDV均明显缩小,且有统计学意义（P<0.05）。MI+h UC-MSCs及MI+AST组较MI组比较部分心功能指标同样有改善趋势。3.大鼠心梗后经h UC-MSCs治疗的SD大鼠的LVEF和LVFS较心梗后经AST治疗的SD大鼠的LVEF及LVFS有所提高,结果具有统计学意义（P<0.05）。与MI+UC-MSCs组相比,心梗后UC-MSCs联合AST治疗在改善左室重构方面可取的更显着的疗效,心功能指标分析显示:MI+AST+UC-MSCs组的LVESD缩小,LVEDD缩小;LVEDD缩小具有统计学意义（P<0.05）;LVESV缩小,LVEDV缩小;LVESV缩小统计学意义（P<0.05）。结论:1.SD大鼠心肌梗死后尾静脉移植UC-MSCs,AST灌胃能一定程度改善其心脏收缩功能;2.UC-MSCs联合AST治疗心梗后SD大鼠较单独用AST或UC-MSCs治疗在改善左室重构方面更为有效;3.UC-MSCs在改善LVEF和LVFS方面较AST相比更明显。

二、心肌细胞移植的现状与发展前景（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、心肌细胞移植的现状与发展前景（论文提纲范文）

（1）人脐带间充质干细胞通过调节巨噬细胞极化参与小鼠心肌肥厚的修复过程（论文提纲范文）

（2）活血温通方联合BMSCs移植改善心梗后缺血缺氧微环境的机制研究（论文提纲范文）

（3）益气活血方联合骨髓间充质干细胞干预心肌梗死后心室重构的实验研究（论文提纲范文）

（4）HCN2和HCN4对骨髓间充质干细胞向具有起搏功能的心肌细胞分化的影响（论文提纲范文）

（5）干细胞移植及中医药干预治疗心肌梗死的研究新进展（论文提纲范文）

（6）负载BIO纳米胶束促进ADSCs对急性心肌梗死的治疗作用及其机制（论文提纲范文）

（7）兔骨髓间充质干细胞体外构建血管化组织工程心肌的实验研究（论文提纲范文）

（8）重组Resilin蛋白源水凝胶的制备及其在心肌组织工程中的应用（论文提纲范文）

（9）多功能肽修饰的胺碘酮纳米脂质体的建立及心肌靶向性的研究（论文提纲范文）

（10）人脐带间充质干细胞移植治疗冠心病患者临床疗效观察（论文提纲范文）

四、心肌细胞移植的现状与发展前景（论文参考文献）

• [1]人脐带间充质干细胞通过调节巨噬细胞极化参与小鼠心肌肥厚的修复过程[D]. 颉丽英. 山西医科大学, 2021(01)
• [2]活血温通方联合BMSCs移植改善心梗后缺血缺氧微环境的机制研究[D]. 王擎擎. 中国中医科学院, 2021(02)
• [3]益气活血方联合骨髓间充质干细胞干预心肌梗死后心室重构的实验研究[D]. 冀楠. 天津中医药大学, 2021(01)
• [4]HCN2和HCN4对骨髓间充质干细胞向具有起搏功能的心肌细胞分化的影响[D]. 罗雪. 扬州大学, 2021(08)
• [5]干细胞移植及中医药干预治疗心肌梗死的研究新进展[J]. 冯雨菲,何贵新,胡梦弦,郑国坤,肖婷,玉黎燕,申永艳,陈天宇,秦伟彬. 中华中医药学刊, 2021(03)
• [6]负载BIO纳米胶束促进ADSCs对急性心肌梗死的治疗作用及其机制[D]. 孔艳. 中国人民解放军海军军医大学, 2020(02)
• [7]兔骨髓间充质干细胞体外构建血管化组织工程心肌的实验研究[D]. 韩刘君. 华北理工大学, 2020(02)
• [8]重组Resilin蛋白源水凝胶的制备及其在心肌组织工程中的应用[D]. 赵乐. 北京交通大学, 2020(03)
• [9]多功能肽修饰的胺碘酮纳米脂质体的建立及心肌靶向性的研究[D]. 周军. 苏州大学, 2020(06)
• [10]人脐带间充质干细胞移植治疗冠心病患者临床疗效观察[D]. 荆宇澄. 河北医科大学, 2020(02)

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