一、鼻咽癌及癌旁上皮细胞的AgNORs定量分析及其生物学意义（论文文献综述）
赵爽[1]（2021）在《基于转录组测序分析的鼻咽癌相关EB病毒变异亚型及预后模型的研究》文中提出背景:EB病毒（Epstein-Barrvirus,EBV）广泛感染人类,引发多种疾病包括恶性肿瘤,其中与鼻咽癌发病密切相关——在约98%的鼻咽癌患者的肿瘤组织中,可以检测到EBV的核酸。目前,已有多种EBV毒株的基因序列发表,不同肿瘤来源的EBV毒株携带不同的基因变异。EBV的变异可能在其致瘤过程中发挥作用,从而影响特定类型肿瘤的生物学行为。然而,对与鼻咽癌相关的EBV基因变异尚缺乏系统性研究。鼻咽癌是一种具有高度侵袭性和转移性的恶性肿瘤,目前,TNM分期系统是鼻咽癌治疗决策和预后评估的主要依据。然而,该系统对于评估鼻咽癌预后的价值有限,已经不能完全满足临床需求。目的:这一博士学位课题的研究工作基于转录组测序数据分析,目的有二,①发现、鉴定与鼻咽癌相关的EBV基因变异,解析不同EBV亚型与鼻咽癌临床特征的关系,初步揭示鼻咽癌相关EBV基因变异的生物学功能。②筛选、构建鼻咽癌预后分子模型。方法:本项研究共纳入两组鼻咽癌患者;第一组67个病例,主要参加转录组测序及相关分析;第二组32个病例,主要参加EBV基因变异的验证分析。此两组鼻咽癌病例互为独立样本。针对第一组67例鼻咽癌患者的肿瘤和癌旁组织进行转录组测序。对测序数据进行生物信息学分析,从中发现鼻咽癌相关EBV的基因变异。采用RNA原位杂交技术BaseScope联合免疫组化共染色的方法,在第二组32例鼻咽癌组织样本中对测序发现的EBV基因变异进行验证。将上述在鼻咽癌中发现、鉴定的EBV变异位点,与公共数据中非鼻咽癌来源的EBV序列进行聚类分析;从中找出鼻咽癌相关的EBV亚型,并分析不同病毒亚型与鼻咽癌患者临床特征及预后的关系。另外,采用常规细胞分子生物学方法,建立稳定表达上述EBV变异基因的鼻咽癌细胞株,通过体外实验探索鼻咽癌相关EBV变异基因的基本生物学功能。构建鼻咽癌预后分子模型的工作,从第一组参加转录组测序的67例鼻咽癌患者之中选择随访信息完善的60例入组,分为“复发转移组”和“非复发转移组”两组。通过对测序数据的分析,采用随机森林和极限梯度提升的机器学习方法,筛选出宿主的与鼻咽癌预后相关的特征基因。基于这一组特征基因,进一步采用Cox 比例风险回归模型构建鼻咽癌预后模型。继而采用GSEA和相关性分析,评价该模型的医学生物学功能。结果:①转录组测序结果显示,入组的鼻咽癌组织中存在EBV基因变异。其中,EBER2和LMP2基因具有最高的变异频率,分别在65/66和64/66例鼻咽癌组织中被检测到。②采用BaseScope和免疫组化共染技术,在独立样本32个鼻咽癌病例中以单细胞原位的方式验证了测序检出的EBER2的变异;并且证明携带病毒变异的细胞为肿瘤（上皮）细胞,而不是肿瘤组织中的浸润免疫细胞,由此明确了 EBV变异活跃转录的组织细胞来源。③根据EBER2的变异位点,将测序获得的EBV序列与已发表的EBV序列进行聚类分析,可将EBV分为两种亚型:EB-1和EB-2。其中,根据EBER2 7123位点,可进一步将EB-2细分为A>T和A>G两种亚型。EB-1基因型EBV显着富集于鼻咽癌（卡方检验,p<0.0001）;而EB-2亚型富集于中国北方鼻咽癌患者,且与肿瘤T分期相关（卡方检验,p<0.05）。生存分析显示,相较于EB-1亚型和EB-2-A>G,感染EB-2-A>T亚型EBV的患者预后最差（Log-rank,p=0.026）。④结合宿主mRNA表达谱数据进行差异表达基因分析和富集分析发现,EB-1和EB-2亚型参与影响宿主细胞不同的生物学过程。其中,EB-1亚型主要激活“Epithelial mesenchymal transition”,而 EB-2 亚型则主要激活“MYC targets v1”等。⑤针对另一个发生高频率变异的病毒基因LMP2变异的体外实验分析发现,相较于对照组,变异的LMP2B有显着促进鼻咽癌细胞增殖、迁移,抑制凋亡的作用。构建鼻咽癌预后分子模型的工作,对于转录组测序数据重点关注宿主的基因表达。⑥采用机器学习方法筛选出“复发转移组”和“非复发转移组”之间的特征基因,共 13 个:CES4A、GIMAP1.GIMAP5、GLB1L、LGR5、LOC730098、MLF1、MTHFD1L、MYLPF、NUP160、SIRPB1、TCN2、TMEM265、U2AF1L5。⑦基于这些特征基因构建Cox风险比例模型,得到一个4-mRNA signature,包括U2AF1L5、TMEM265、GLB1L和MLF1基因。根据这一模型计算每个患者的风险评分,并将患者分为高风险组和低风险组。⑧Kapan-Meier生存曲线和ROC曲线分析显示,这一预后模型能较好地评估鼻咽癌患者的预后,高风险组患者预后显着差于低风险组（Log-Rank,总生存:p=0.00126,无病生存:p=0.000059）。这一 4-mRNA signature在评估患者总生存以及无病生存的效果（AUC分别为0.893和0.86,）优于T分期（AUC为0.619和0.538）及N分期（AUC:0.582和0.622）。⑨多因素Cox分析结果显示,风险评分是鼻咽癌的独立预后因素（总生存,HR=14.501,p=0.012,无病生存:HR=13.752,p<0.001）。⑩GSEA 富集分析发现 4-mRNA signature 与细胞增殖和宿主免疫应答密切相关。结论:鼻咽癌组织中存在EBV基因变异。其中EBER2和LMP2基因具有最高的变异频率。鼻咽癌组织内发生基因变异的EBV存在于肿瘤细胞而非浸润免疫细胞中。根据EBER2的变异模式,可将EBV分为两种亚型:EB-1和EB-2;它们与鼻咽癌患者的临床特征、预后相关,并可能与宿主发生不同的相互作用。通过对转录组数据的分析挖掘,构建了包含4个基因的4-mRNA signature模型,可用于鼻咽癌预后评估。
吕洁瑜[2]（2021）在《过表达HOXC11通过调控PPAE-γ和NF-κB通路促进头颈部鳞癌增殖和侵袭的研究》文中进行了进一步梳理研究背景同源盒（Homeobox,HOX）基因家族的异常表达常见于多种恶性肿瘤中,已有研究显示,HOXC11在多种肿瘤中异常高表达并参与了癌细胞的恶性生物学行为,被认为是一个具有潜在临床诊断价值的生物标志物。然而,HOXC11在头颈部鳞癌的表达及与临床的相关性依然不清,其是否参与头颈部鳞癌的恶性生物学行为以及具体的调控机制也有待研究。研究目的（1）观察HOXC11在头颈部鳞癌组织中的表达情况,分析HOXC11的表达与患者临床病理及预后的相关性。（2）探索HOXC11对头颈部鳞癌细胞体内与体外恶性生物学特征的影响。（3）阐明HOXC11参与头颈部鳞癌恶性生物学行为的相关分子机制。研究内容与方法（1）HOXC11在头颈部鳞癌的表达及其临床意义结合肿瘤基因组图谱（TCGA）的数据,利用实时荧光定量PCR、免疫蛋白印迹、免疫组织化学等方法,检测HOXC11在头颈部鳞癌组织中RNA和蛋白的表达情况,分析HOXC11的表达与患者临床病理及预后的相关性。（2）沉默HOXC11对头颈鳞癌细胞恶性生物学行为的影响利用shRNA技术在HOXC11高表达的头颈部鳞癌细胞（SCC15和SCC152）中,构建稳定沉默HOXC11的细胞模型。通过CCK-8实验、克隆形成实验、Transwell侵袭实验、软琼脂克隆形成实验和裸鼠皮下移植成瘤实验,观察HOXC11对头颈部鳞癌细胞的增殖、侵袭和成瘤性等恶性生物学特征的影响。（3）沉默HOXC11对头颈部鳞癌细胞信号通路的影响利用双荧光素酶报告基因实验、免疫印迹实验和实时荧光定量PCR等技术,观察在头颈肿瘤鳞癌细胞中,沉默HOXC11后对NF-κB通路和PPAR-γ通路的影响。同时,利用临床样本的免疫组化检测及分析,验证HOXC11、PPAR-y和NF-κB在临床组织中的表达情况及其相关性。研究结果（1）相对于良性病变或癌旁正常对照组织,头颈部鳞癌组织中HOXC11的mRNA和蛋白水平都显着高表达,且表达水平随T分期上升而上调;预后分析显示,HOXC11的高表达与患者预后差相关,癌组织中高表达HOXC11的患者更容易复发。（2）沉默HOXC11后,头颈部鳞癌细胞（SCC15和SCC152）体外的增殖、侵袭和非锚定生长能力都显着受到抑制;且体内实验显示,沉默SCC15细胞能显着抑制皮下瘤的生长和对周围组织的侵袭。（3）在头颈部鳞癌细胞中,沉默HOXC11能显着抑制NF-κB通路并激活PPAR-γ通路,并影响下游增殖和侵袭相关基因的表达;且头颈部鳞癌组织中,HOXC11的表达与PPAR-y的表达负相关而与p65的核定位水平正相关。研究结论HOXC11在头颈部鳞癌中高表达,并与患者复发及预后较差相关,是预判头颈部鳞癌患者预后的潜在生物标志物。沉默HOXC11能影响NF-κB通路和PPAR-γ通路,抑制头颈部鳞癌细胞增殖、侵袭和体内成瘤,是潜在的治疗靶点。
林琳[3]（2021）在《长链非编码RNA LINC00460/miR-503-5p轴影响宫颈癌增殖及凋亡的实验研究》文中指出目的:宫颈癌排全球妇科肿瘤第二位。近年来,亚洲地区宫颈癌的发病率正在迅速上升,尤其是在发展中国家。众所周知HPV的持续性感染和宫颈癌的肿瘤发展过程紧密相连,但同时也有研究认为癌基因的异常表达同样可作为独立因素影响宫颈癌的发生发展。当前早期宫颈癌可以得到较有效控制,然而转移性或复发性宫颈癌预后仍较差。因此,更进一步探讨宫颈癌的发病机制对于预防、治疗及预后监管宫颈癌均意义非凡。长链非编码RNA（long non-coding RNAs,LncRNAs）是非编码RNA的一类,研究发现LncRNAs与肿瘤发生发展密切相关,并能够参与细胞内多种生物学过程的调控。我们通过GEPIA网站（http://gepia.cancer-pku.cn/）分析发现长链非编码RNA LINC00460的高表达与宫颈癌的不良预后密切相关。LINC00460是一个长链基因间非编码RNA,研究显示其在胃癌、脑膜瘤、卵巢癌、肺癌等多种恶性肿瘤中均发挥促癌基因的作用,然而目前尚未见有确切报道LINC00460对宫颈癌的作用,因此我们推测其也能够促进宫颈癌的发生发展。基于竞争性内源RNA（Competing endogenous RNA,ceRNA）的基因调控理论,人们对微小RNA（Micro RNA,miRNA）与LncRNAs的调控机制又有了新的认识。我们通过网络在线生物信息学工具Star Base（http://Star Base.sysu.edu.cn/）预测看到LINC00460上存在有miR-503-5p的靶向结合位点。MiR-503-5p为一个抗肿瘤的miRNA,研究显示其能够抑制膀胱癌、肺癌以及卵巢癌等恶性肿瘤的进展。更为重要的是,有报道显示miR-503-5p与宫颈癌的不良预后相关,并且能够通过对其下游靶基因的调控抑制宫颈癌细胞的增殖。基于以上分析我们推测LINC00460可能通过调控miR-503-5p影响宫颈癌的发生发展进程。本研究拟探讨LINC00460在宫颈癌组织及癌旁组织中的表达水平差异,并进一步分析长链非编码LINC00460表达水平差异是否与宫颈癌患者临床病理参数及超声检查结果具有相关性。我们还将探讨LINC00460表达水平改变对宫颈癌细胞增殖及凋亡等生物学功能的影响作用。再依据ceRNA靶向吸附miRNA理论探讨LINC00460促进宫颈癌增殖及凋亡的分子调控机制。方法:1、我们通过GEPIA网站分析发现LINC00460的高表达与宫颈癌的不良预后密切相关。收集中国医科大学附属盛京医院（中国沈阳）妇科手术经病理证实的30对宫颈癌组织及癌旁组织,所有组织标本离体后在液氮中冷冻,后于-80℃保存。同时收集全部患者的相关临床病理资料。所有患者均于术前行三维能量多普勒超声检查,评估血管分级及血流参数等指标。通过使用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）技术检测临床样本组织中的LINC00460的表达水平,并分析其表达水平差异与宫颈癌患者临床病理特性及超声检查结果的相关性。2、采用RT-qPCR方法检测LINC00460在四种宫颈癌细胞株（Siha、C-33A、Hela、CaSki）的基础表达情况,并筛选出两株LINC00460高表达的细胞株（Siha和Hela细胞）。构建LINC00460干扰载体以及阴性对照干扰载体,分别转染Siha和Hela细胞,实验分组:对照组、NC shRNA组、LINC00460 shRNA1组、LINC00460 shRNA2组。转染48h后采用RT-qPCR方法验证LINC00460在Siha和Hela细胞中的转染效率。接下来我们通过流式细胞术检测各组Siha和Hela细胞的细胞周期改变,应用MTT法检测各组宫颈癌细胞增殖活力情况,应用Western blot检测Ki67和cyclin D1的表达,以验证沉默LINC00460对宫颈癌细胞增殖的影响。3、通过流式细胞术及Hoechst染色检测细胞凋亡情况,Western blot检测凋亡相关蛋白Cleaved-caspase-3和Cleaved-PARP的表达,验证沉默LINC00460对宫颈癌细胞凋亡能力的影响。4、通过Star Base数据库预测miR-503-5p作为LINC00460的下游miRNA分子,构建含有miR-503-5p结合位点的野生型LINC00460载体以及结合位点突变的LINC00460载体,分别与NC mimic或miR-503-5p mimic共转染工具细胞（HEK-293T）,实验分四组:WT-LINC00460+NC mimic组、MUT-LINC00460+NC mimic组、WT-LINC00460+miR-503-5p mimic组、MUT-LINC00460+miR-503-5p mimic组,之后采用双荧光素酶实验来验证LINC00460与miR-503-5p靶向结合情况。按照第二部分实验分组:对照组、NC shRNA组、LINC00460 shRNA1组、LINC00460shRNA2组,RT-qPCR方法检测各组Siha和Hela细胞中miR-503-5p的表达水平,应用Western blot检测法检测AKT2,HMGA2,SHOX2蛋白表达,以确认LINC00460对miR-503-5p及其下游靶基因的调控作用。5、设计挽救实验,分别采用LINC00460shRNA1以及miR-503-5p inhibitor、NC inhibitor共转染Siha细胞,实验分组:LINC00460 shRNA1+NC inhibitor组、LINC00460 shRNA1+miR-503-5p inhibitor组。通过MTT方法检测细胞增殖活力情况,通过流式细胞术技术检测细胞周期变化并检测细胞凋亡情况,应用Western blot检测miR-503-5p下游靶基因AKT2、HMGA2、SHOX2及cyclin D1和Cleaved-caspase-3的表达。6、体内裸鼠成瘤实验验证沉默LINC00460表达后对裸鼠成瘤能力影响,采用RT-qPCR检测瘤体组织中LINC000460和miR-503-5p的表达,免疫组化方法检测瘤体组织Ki67蛋白表达,通过TUNEL法观察细胞凋亡情况,Western blot检测AKT2,HMGA2,SHOX2蛋白表达,进一步在体内验证沉默LINC00460对miR-503-5p和其下游靶基因的影响,验证LINC00460对体内宫颈癌细胞增殖和凋亡的影响。结果:1、RT-qPCR结果显示LINC00460在宫颈癌患者肿瘤组织中的表达水平显着高于癌旁正常组织（P<0.01）;宫颈癌组织中LINC00460的差异表达与宫颈癌肿瘤组织分化程度有关（P<0.05）,与宫颈癌患者有无淋巴结转移相关（P<0.05）,却和患者的年龄、肿块的大小、患者FIGO分期以及病理类型无确切的相关性（P>0.05）;宫颈癌组织中LINC00460表达水平的高低与超声检查结果超声血管分级相关（P<0.05）。2、MTT检测显示沉默LINC00460显着减少宫颈癌细胞增殖活力;流式细胞仪细胞周期显示沉默LINC00460促进宫颈癌细胞周期阻滞在G1期,抑制宫颈癌细胞周期G1/S过渡（P<0.05）;沉默LINC00460抑制Ki67和cyclin D1的表达（P<0.05）,提示沉默LINC00460可抑制宫颈癌的增殖能力。3、流式细胞术检测细胞凋亡和Hoechst染色显示沉默LINC00460使宫颈癌细胞发生凋亡细胞明显增多,Cleaved-caspase-3和Cleaved-PARP的表达增高（P<0.05）,提示沉默LINC00460可促进宫颈癌细胞的凋亡。4、通过Star Base网站预测发现LINC00460和miR-503-5p有靶向结合位点,双荧光素酶实验显示当293T细胞转染WT-LINC00460时,miR-503-5p mimic能够明显减低其内荧光素酶的活性（P<0.01）,而对转染MUT-LINC00460的293T细胞的荧光素酶活性的影响不明显。RT-qPCR方法检测发现沉默LINC00460能够显着上调Siha和Hela细胞中miR-503-5p的表达水平（P<0.01）,Western blot检测发现沉默LINC00460能够使宫颈癌细胞内miR-503-5p靶基因AKT2,HMGA2,SHOX2的表达减低（P<0.01）。提示LINC00460可与miR-503-5p靶向结合,沉默LINC00460可增强miR-503-5p的表达并抑制其靶基因在宫颈癌细胞中的表达。5、挽救实验显示与共转染LINC00460 shRNA1+NC inhibitor组相比,共转染LINC00460 shRNA1+miR-503-5p inhibitor组细胞增殖能力明显提高,诱导宫颈癌细胞G1/S过渡（P<0.05）,凋亡细胞比例明显降低（P<0.05）,cyclin D1水平显着增加（P<0.05）,Cleaved-caspase-3水平显着下降（P<0.05）,miR-503-5p下游靶基因AKT2、HMGA2、SHOX2的表达显着上调（P<0.05）,验证了LINC00460靶向miR-503-5p并调控miR-503-5p在宫颈癌细胞中的下游靶基因AKT2,HMGA2,SHOX2,进而影响宫颈癌细胞的增殖和凋亡。证实了抑制miR-503-5p逆转了LINC00460沉默引起的宫颈癌细胞增殖抑制和miR-503-5p靶基因表达抑制及促进细胞凋亡的情况。6、体内裸鼠成瘤实验结果发现LINC00460 shRNA组移植瘤的生长速度、体积、重量均明显低于NC shRNA组（P<0.01）,沉默LINC00460可抑制裸鼠体内宫颈癌肿瘤生长能力。RT-qPCR结果显示LINC00460 shRNA组瘤体组织中LINC00460的表达水平明显低于NC shRNA组（P<0.01）,而miR-503-5p的表达水平明显高于NC shRNA组（P<0.01）。免疫组化结果ki67在LINC00460 shRNA组肿瘤组织中的表达水平明显低于NC shRNA组（P<0.01）。TUNEL法显示LINC00460 shRNA组瘤体组织中凋亡细胞较多。Western blot技术检测结果显示与NC shRNA组相比较LINC00460 shRNA组宫颈移植瘤肿瘤组织中的AKT2、HMGA2、SHOX2的蛋白表达水平明显降低（P<0.05）。可见体内沉默LINC00460可抑制宫颈癌移植瘤肿瘤生长,促进miR-503-5p表达水平上调,促进宫颈癌细胞凋亡的过程,同时抑制肿瘤组织中宫颈癌细胞增殖能力以及miR-503-5p下游靶基因的表达。结论:1、本研究证实了LINC00460在宫颈癌组织及细胞株中表达上调,提示LINC00460与宫颈癌的发生发展相关。2、沉默LINC00460表达,可抑制体外宫颈癌细胞增殖能力。3、沉默LINC00460表达,能够增强体外宫颈癌细胞的凋亡能力。4、LINC00460靶向miR-503-5p并调控miR-503-5p在宫颈癌细胞中的下游靶基因AKT2,HMGA2,SHOX2。5、LINC00460通过海绵吸附miR-503-5p调控宫颈癌细胞的增殖和凋亡。6、在体内LINC00460调控miR-503-5p的水平,沉默LINC00460可抑制裸鼠体内宫颈癌肿瘤生长能力和宫颈癌细胞的增殖,促进肿瘤中宫颈癌细胞的凋亡。提示LINC00460在宫颈癌发病过程中可能发挥着促癌基因的作用,有望成为宫颈癌治疗的新靶点。
王泽洋[4]（2021）在《EBV相关性胃癌多维度表型特征识别及其关联蛋白GBP5的作用机制研究》文中指出研究背景:胃癌（Gastric Cancer,GC）是全球范围内第五大高发肿瘤疾病,居肿瘤死亡原因第二位。胃癌病因包括遗传因素、理化因素及感染因素等。在感染因素中,幽门螺杆菌与胃癌有关已达成研究者共识。除此之外,近年来EB病毒（epstein barr virus,EBV）也已引起研究者高度重视。EBV是1964年Epstein和Barr从非洲儿童Burkitt’s淋巴瘤培养细胞中发现的病毒,属人类疱疹病毒4型,即γ-型疱疹病毒,特异性人类嗜淋巴细胞性病毒。目前已知,EBV感染与多种人类恶性肿瘤如Burkitt’s淋巴瘤、鼻咽癌、传染性单核细胞增多症、霍奇金病及非霍奇金淋巴瘤等密切相关。1993年,Tokunaga等通过原位杂交技术证实胃癌细胞内存在EBV编码的小RNA,将之定义为EBV相关性胃癌（EBV-associated gastric carcinoma,EBVaGC）。2014年癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）根据分子水平的差异将胃癌分为四种分子病理亚型,包括EB病毒感染型、基因组稳定型、染色体不稳定型及微卫星不稳定型。其中,EBVaGC以其区别于其他类型胃癌的多种特质引起了广泛关注。据统计,EBVaGC约占全世界胃癌发病率的10%,且在不同地域间存在差异（[6]）。全面认识EBVaGC对胃癌发生机制研究及临床诊治有重要指导意义。表型特征是生物体从宏观到微观（即分子组成）、从胚胎发育到出生、成长、衰老乃至死亡过程中,形态特征、功能、行为、分子组成规律等所有生物、物理和化学特征的集合。全景解析人类表型特征,建立宏观表型与微观表型间多维度关联,是解析生命科技的重要线索。目前,对EBVaGC分子表型及临床表型特征等已有所了解,比如,EBVaGC中显示出PIK3CA的反复突变、DNA甲基化以及JAK2,PD-L1和PDL2过表达扩增等。然而,EBVaGC的分子模式非常复杂,包含多种遗传学和表观遗传学变异、转录组学及蛋白组学变异等,对此,我们的认知还十分有限,尚需深入探索,EBVaGC主要临床表型特征及具体发病机制也需要进一步深入研究。全面阐释EBVaGC表型特征可提供潜在的新型胃癌治疗靶标和路线图,可为制定胃癌精准诊治策略提供参考。EBVaGC致癌原因与EB病毒感染有关。病原微生物感染的基因组学和蛋白质组学研究旨在找出在病原体感染和宿主防御整个过程中影响重要生物学活动的关键蛋白以及这些蛋白的功能机制。对重要微生物的基因组学和蛋白质组学差异的鉴定不仅有助于深入了解其发病机制,还可为相关疾病的治疗提供新靶点。然而对于EBV感染导致的胃癌,目前几乎所有基因和蛋白水平的研究均聚焦于单一因素或基于生物信息学数据库的大样本数据集,仍缺乏通过独立采集质谱技术检测蛋白质组学变化建立的对EBVaGC基因和蛋白表达谱的综合研究。血清学检测,作为一种方便、非侵入性和成本效益高的检测手段,在人群流行病学调查、疾病过程的动态监测和风险预测方面显示出显着的优势。到目前为止,EBV血清学检测已经广泛应用于Burkitt淋巴瘤,鼻咽癌,霍奇金或非霍奇金淋巴瘤,睾丸癌等疾病的风险预测及早期诊断。然而,很少有研究集中于EBV血清学与胃癌风险的关系。此外,目前尚不清楚EBV血清学检测是否具有GC预测和预后的潜能。综上,本研究试图从基因变异、蛋白表达、病理组织学形态、血清抗体表达等不同层面,多维度探讨EBVaGC表型特征并筛选鉴定EBVaGC关联蛋白。对于已鉴定出的EBVaGC关联蛋白,我们进一步探究了其在EBV相关性胃癌中的分子调控机制。本研究为进一步探讨EBVaGC关联蛋白的作用机制奠定基础。研究目的:1.明确EBVaGC的表型特征。2.EBVaGC关联蛋白的筛选鉴定。3.明确EBVaGC关联蛋白GBP5的作用机制。研究方法:第一部分:EBV相关性胃癌多维度表型特征识别（一）EBVaGC差异表达基因分析利用公共数据资源GEO数据库检索包含EBV相关性胃癌信息的基因表达谱芯片,确定GSE51575作为分析芯片。该芯片包含12例EBV-阳性和14例EBV阴性胃癌样本基因表达信息。采用GEO2R分析出该表达谱芯片的差异表达基因,|FC|>2.0,P<0.05为具有统计学意义。（二）EBVaGC差异表达蛋白筛选验证a)收集中国医科大学附属第一医院自2012年9月至2019年10月的胃癌手术患者癌组织共计132例。b)应用EBV编码RNA（EBER）原位杂交（ISH）技术对胃癌样本进行EBV原位检测。c)利用EBV阳性与阴性胃癌组织进行DIA-相对定量蛋白质组学分析,筛选具有差异表达水平的蛋白。（三）EBVaGC病理组织学特征分析1.收集中国医科大学附属第一医院自2012年9月至2019年10月的胃癌手术患者癌组织及其癌旁正常组织标本共计132例。通过患者病历收集性别、年龄、饮酒、吸烟、Lauren分型、浸润深度、癌周淋巴细胞浸润、脉管癌栓、淋巴结转移、周围神经侵犯、淋巴结外肿瘤种植等临床病理信息。2.通过原位杂交检测EBV原位感染情况,进行分析。（四）EBVaGC血清EBV抗体表达分析1.收集中国医科大学附属第一医院自2012年11月至2020年6月的胃癌手术患者以及庄河胃癌高发现场患者血样本,其中包括浅表性胃炎、萎缩性胃炎以及胃癌病例共计1790例。在患者病历中收集性别、年龄、饮酒、吸烟、Lauren分型、浸润深度、癌周淋巴细胞浸润、脉管癌栓、淋巴结转移、周围神经侵犯、节外种植等临床病理信息。本研究获得中国医科大学第一附属医院研究所医学伦理委员会的批准,所有受检者均提供书面知情同意书。2.利用血清定量检测不同EBV-VCA IgG抗体滴度,分析其表达水平与EBV相关性胃癌发病风险、预后及临床病理参数的相关性。第二部分:EBV相关性胃癌关联蛋白GBP5的作用机制研究（一）GBP5原位表达与胃癌发病风险、临床病理参数及预后关系利用免疫组化技术对255对胃癌组织以及癌旁正常对照组织进行免疫组化染色,分析其与胃癌之间的关系。（二）GBP5对不同EBV感染状态胃癌细胞活性的影响1.GBP5过表达和沉默质粒的构建:分别选取GV146和GV102为GBP5的过表达以及沉默质粒载体,并经过酶切确认。化学合成GBP5基因序列,用Kpn I/Bam HI酶切含有目的基因的质粒,将酶切产物连接入线性化表达载体,经PCR鉴定。2.根据文献报道,选取EBV阳性SNU719胃癌细胞系以及EBV阴性AGS胃癌细胞系,并经过Real-time PCR确认EBV的表达,进行后续实验。3.采用CCK-8进行细胞增殖效应的检测。（三）GBP5对不同EBV感染状态胃癌细胞免疫相关基因表达的影响1.EBVaGC差异表达免疫相关基因的确定本研究经查阅文献后共总结出47个免疫相关基因,进一步将GSE51575中差异表达基因与47个基因取交集后筛选出差异表达的免疫相关基因。P<0.05被认为具有统计学意义。2.确定EBVaGC与GBP5相关的免疫基因采用斯皮尔曼相关分析方法分析GBP5与EBVaGC差异表达相关的免疫相关基因的相关情况。|r|>0,P<0.05具有统计学意义。3.验证EBVaGC免疫相关基因差异表达本研究收集GBP5过表达和沉默的SNU719和AGS细胞系培养液上清进行酶联免疫吸附实验对预测的GBP5相关的免疫基因进行验证。利用SPSS Statistics 24和Graph Pad Prism 8进行统计分析。P<0.05为具有统计学意义。（四）GBP5表达调控网络分析1.EBV相关性胃癌中GBP5蛋白互作网络构建本研究利用STRING在线工具（v11.0,https://string-db.org）预测GBP5蛋白互作网络。将GSE51575中差异表达基因与预测出的GBP5互作蛋白取交集,筛选出差异表达的GBP5互作蛋白,P<0.05被认为具有统计学意义。2.EBVaGC中GBP5与互作蛋白间的关联分析本研究利用斯皮尔曼相关分析计算GSE51575数据集中GBP5与其差异表达互作蛋白间的相关性。|r|>0,P<0.05被认为具有统计学意义。3.EBVaGC中GBP5与互作蛋白的通路分析对GBP5及其具有显着相关性的互作蛋白进行GO（包括生物学过程、分子功能和细胞组成）和KEGG富集分析,P<0.05具有统计学意义。研究结果:第一部分:EBV相关性胃癌多维度表型特征识别1.EBVaGC关联基因表达特征（EBV+胃癌vs EBV-胃癌差异表达基因）对包含12例EBV-阳性和14例EBV阴性胃癌样本的基因表达谱芯片GSE51575进行差异分析,结果显示在EBVaGC中共有1088个基因上调,879个基因下调表达（|FC|>2.0,P<0.05）,其中排位前者包括CXCL17、GBP5、DMBT1、SLC6A8等。将EBVaGC表达的关联基因进行通路富集分析,结果表明统计学差异最显着的前10条通路均与机体免疫功能相关,例如抗原加工和呈递;辅助性T细胞1、辅助性T细胞2以及辅助性T细胞17分化、移植物抗宿主反应等。2.EBVaGC关联蛋白表达特征（EBV+胃癌vs EBV—胃癌差异表达蛋白）2.1基于EBV检测的金标准EBER-ISH,EBV感染细胞在遵照试剂盒说明书处理过后细胞核可以被显着棕染。结果显示132例胃癌样本中共有7例组织标本具有阳性EBER信号。2.2 EBVaGC的蛋白质组学研究采用上述7例EBV+胃癌样本及与之年龄性别临床病理参数匹配的7例EBV—胃癌样本进行DIA-相对定量蛋白质组学分析。结果显示与EBV-阴性胃癌组相比,在EBV-阳性胃癌组中共鉴定出137个差异表达蛋白。其中,GBP5、C5AR1、THRAP3、P3H3和MDK为47个上调蛋白中差异前五的蛋白。2.3本研究将GSE51575中差异表达的基因分别与鉴定出的差异表达蛋白取交集。结果发现共有25个基因在两组数据中均差异表达,其中GBP5在25个差异表达蛋白中差异表达倍数最高,其在EBV-阳性胃癌中相较EBV-阴性胃癌同样显着上调（P=1.19E-03,log2FC=3.21）,提示GBP5可能是一种与EBVaGC高度相关的蛋白。3.EBVaGC临床病理参数分析我们进一步对EBVaGC的组织病理学特征进行了分析。首先利用EBV原位杂交实验检测132例胃癌组织,结果显示7例具有阳性信号,EBVaGC检出率为5.3%。全部EBV+胃癌病例为中老年男性。其基本病理学特征为:全部病例为中晚期胃癌,多发于胃体部位（4/7,57.14%）;大体分型以溃疡/溃疡浸润型为主（6/7,85.71%）;组织学分型以中分化及低分化腺癌为主（6/7,85.71%）;绝大多数呈浸润性性生长（6/7,85.71%）;淋巴结转移多见（5/7,71.43%）;所有病例均存在癌周淋巴细胞浸润。免疫组化染色结果显示,Ki67指数较高,多伴有P53阳性表达（5/7,71.43%）以及EGFR与VEGF表达（4/7,57.14%）。EBV-阳性胃癌与EBV-阴性胃癌相比,临床病理参数未见显着差异（P>0.05）。4.EBV血清抗体表达与胃癌风险/预后的相关性在发病风险方面,分析1790例EBV-VCA IgG感染状态与不同胃疾病的组间比较发现,萎缩性胃炎组和胃癌组的EBV-VCA IgG阳性率均显着高于对照组（AG:40.0%vs.30.5%;GC:38.6%vs.30.5%）。经年龄和性别校正后,研究发现EBV-VCA IgG感染者罹患萎缩性胃炎和胃癌的风险分别提高到1.55倍和1.36倍（分别为P=0.001,95%CI=1.21-1.99;P=0.011,95%CI=1.07-1.72）。在胃癌预后方面,对临床病理资料齐全的234例胃癌患者进行了随访。结果发现,在肠型胃癌亚组,EBV-VCA IgG感染状态与总生存期有关,EBV-VCA IgG阳性者的预后较EBV-VCA IgG阴性者更差（Mean survival month:49.2 vs.61.3,P=0.009,HR=3.50,95%CI=1.37-8.94）。第二部分:EBV相关性胃癌关联蛋白GBP5的作用机制研究1.GBP5原位表达与胃癌病理参数/预后的相关性我们首先探讨了GBP5蛋白表达与胃癌组织病理学特征的关系,结果提示GBP5蛋白表达水平与浸润深度、脉管癌栓、淋巴结外肿瘤种植存在显着相关,在其他病理学参数的分组中未发现GBP5蛋白存在差异表达（P>0.05）。我们还分析了GBP5蛋白表达对胃癌预后的影响,单因素与多因素COX回归分析均未发现GBP5蛋白表达与胃癌预后具有相关性（P>0.05）。2.GBP5对不同EBV感染状态胃癌细胞活性的影响EBV+SNU719和EBV—AGS细胞系中转染GBP5过表达质粒和对照质粒以及沉默和沉默对照质粒,分别观察两组细胞在24h、48h、72h的细胞活性。结果发现SNU719细胞系中,GBP5过表达组72h时的细胞活性较阴性对照组升高（P=0.001）,GBP5沉默组细胞活性较沉默对照组降低（P<0.001）。3.GBP5对不同EBV感染状态胃癌细胞免疫相关基因表达的影响采用GSE51575芯片数据,利用GEO2R分析GBP5对不同EBV感染状态胃癌细胞免疫基因表达的影响,结果显示共有1088个基因上调,879个基因下调表达（|FC|>2.0,P<0.05）。进一步将47个免疫相关基因与GSE51575中差异表达基因取交集后发现23个基因在该芯片中存在差异表达,且均为上调表达,例如CXCL17等。4.GBP5表达与EBV相关性胃癌调控网络的关联分析本研究采用Sanger Box预测GBP5互作蛋白并确定其在EBVaGC中的差异表达情况,结果显示FCGR1B、TRIM22、GBP2、IRF1、OAS2和OASL可能为GBP5互作蛋白,且其在EBVaGC中均为上调表达,与GBP5存在显着的正相关关系。富集分析表明GBP5及其潜在的互作蛋白（OAS2、GBP2）可参与寡聚化核苷酸结合结构域样受体信号通路,提示EBVaGC中差异表达的GBP5、OAS2和GBP2可能通过影响此通路活性从而促进EBV相关性胃癌进展。研究结论:1.EBVaGC关联基因表达差异显着者有GBP5、CXCL17等,功能分析显示均与机体免疫功能相关。2.EBVaGC关联蛋白表达差异显着者有GBP5、C5AR1等,功能分析显示可能与乙醇降解Ⅱ类蛋白具有富集效应。3.EBV-阳性胃癌多见于中老年男性;胃体部位多发;溃疡/溃疡浸润型多见;中低分化腺癌多见,淋巴结转移多见。4.携带血清EBV-VCA IgG抗体者罹患胃癌发病风险升高;在肠型胃癌亚组中,EBV-VCA IgG阳性者的预后较EBV-VCA IgG阴性者更差。5.GBP5原位表达与胃癌不良临床病理参数正相关,尤其是与浸润深度、脉管癌栓以及结外肿瘤种植显着相关。6.GBP5可促进EBV阳性胃癌细胞增殖活性。7.在EBVaGC中,GBP5与23个免疫相关基因存在显着的相关性,其中CXCL17、IL-17、1L-8已经血清学表达实验证实。8.在EBVaGC中,GBP5表达调控通路生信分析结果提示,GBP5可与FCGR1B、TRIM22、GBP2、IRF1、OAS2、OASL互作。GBP5可能通过影响寡聚化域样受体信号通路活性从而促进肿瘤进展。
韩艳艳[5]（2020）在《PIK3CA基因在鼻咽癌发生发展及放疗抵抗中的作用机制研究》文中研究表明目的:分析PIK3CA基因在鼻咽癌组织中表达差异及表观遗传学甲基化水平,阐述鼻咽癌组织中PIK3CA表达与鼻咽癌临床恶性表型、预后的关系;探讨PIK3CA表达模式对于鼻咽癌细胞增殖、迁移、侵袭等生物学行为的影响。在此基础上进一步探究PIK3CA上游调控PVT1/mi R-515-5p-PIK3CA轴对鼻咽癌细胞增殖、凋亡和放疗抵抗的作用及其内在调控机制,为揭示鼻咽癌发生发展及放疗抵抗分子机制和个体化治疗靶点的筛选奠定科学基础。方法:第一部分:（1）组织水平,利用免疫组织化学SP染色法检测鼻咽癌及鼻咽正常粘膜组织标本PIK3CA表达水平差异,并分析鼻咽癌组织内PIK3CA表达水平与临床病理参数间的相关性,采用Kaplan-Meier法分析PIK3CA表达水平对鼻咽癌预后的影响;（2）体外细胞水平通过特异性si RNA转染鼻咽癌细胞下调PIK3CA表达,检测PIK3CA表达水平对鼻咽癌细胞增殖、侵袭、迁移等细胞功能的影响;（3）利用焦磷酸盐测序法检测鼻咽癌及正常鼻咽粘膜组织中PIK3CA基因启动子区甲基化水平差异。第二部分:（1）利用star Base生物信息学分析预测PIK3CA和mi R-515-5p之间的潜在靶位点,构建载有mi R-515-5p结合位点PIK3CA 3’UTR的野生型序列插入p GL3载体,采用双荧光素酶报告基因验证mi R-515-5p调控PIK3CA基因表达结合位点,并通过抗Ago2进行RIP检测并分析mi R-515-5p与PIK3CA的相互作用。（2）组织水平利用q RT-PCR法检测鼻咽癌和正常鼻咽粘膜组织中PIK3CA的m RNA表达水平,并在细胞水平采用western blot法分析PIK3CA基因在鼻咽癌细胞系及正常鼻咽粘膜细胞系中蛋白表达差异;并采用western blot法分析mi R-515-5p敲减后的NPC细胞中PIK3CA蛋白表达调控。（3）用CCK8法检测转染PIK3CA+mi R-515-5p的NPC细胞监测细胞增殖趋势。采用细胞克隆形成实验及流式细胞仪分析不同辐照剂量（0、2、4、6、8 Gy）下转染PIK3CA+mi R-515-5p的NPC细胞相较PIK3CA的存活分数及凋亡情况,并通过western blot法检测不同辐照剂量（0和8Gy）下以上两种细胞的细胞周期蛋白D1和Bax的蛋白水平,从而揭示mi R-515-5p调控PIK3CA对鼻咽癌细胞放疗抵抗水平影响。第三部分:（1）组织水平采用q RT-PCR检测NPC和正常组织中PVT1的表达及不同TNM分期的PVT1表达差异,并分析其表达与预后相关性;细胞水平采用q RT-PCR检测正常粘膜细胞系和NPC细胞系中的PVT1水平差异。（2）采用携带sh RNA的慢病毒转染敲减PVT1,通过q RT-PCR验证PVT1的敲减效率;使用CCK8法评估PVT1表达对细胞增殖水平影响。进行细胞克隆形成能力检测、细胞周期蛋白检测、流式细胞仪检测及western blot法,分析鼻咽癌细胞在不同辐照剂量（0,2,4,6,8Gy）下的存活分数、凋亡情况及细胞周期蛋白水平。（3）用star Base预测了PVT1与mi R-515-5p结合位点;采用双荧光素酶报告基因和抗Ago2法进行混合靶点阳性候选基因的单靶点验证。构建慢病毒载体,采用q RT-PCR评估NPC组织和细胞中转染mi R-515-5p和PVT1表达调控关系。（4）采用CCK8法检测转染mi R-515-5p、mi R-515-5p+PVT1的鼻咽癌细胞增殖情况,采用细胞克隆形成实验及流式细胞仪分析不同辐照剂量下（0、2、4、6、8 Gy）转染PVT1+mi R-515-5p的NPC细胞相较PIK3CA的存活分数及凋亡情况,并通过western blot法检测不同辐照剂量下（0和8 Gy）,以上两种细胞的细胞周期蛋白D1和Bax的蛋白水平,从而揭示PVI1调控mi R-515-5p对鼻咽癌细胞放疗抵抗水平影响。（5）通过western blot检测转染sh-PVT1、sh-PVT1+Anti-mi R-515-5p的鼻咽癌中PIK3CA、AKT和p-AKT的蛋白质水平,确定PVT1/mi R-515-5p-PIK3CA轴调节关系。（6）为了验证PVT1在体内的功能,通过转染sh-PVT1或sh-Control的C666-1细胞建立异种移植小鼠模型,动态监测瘤体在裸鼠皮下成瘤及生长情况,验证PVT1对鼻咽癌细胞在体内生长的影响。结果:第一部分:（1）PIK3CA蛋白在71例鼻咽癌组织中的表达率为81.69%,高于正常鼻咽粘膜组织31.25%,差异具有统计学意义;PIK3CA在鼻咽癌中的表达与鼻咽癌患者的性别、年龄、病理类型、Ki-67等均无统计学相关性,与肿瘤T分期（P=0.000）、N分期（P=0.008）及临床分期（P=0.002）有相关性,经Kaplan-Meier生存曲线分析发现PIK3CA蛋白强表达的鼻咽癌患者的生存率低于低表达及中等表达的患者（Log Rank检验结果:?2=7.995,P<0.05）;（2）敲减PIK3CA的si RNA转染鼻咽癌细胞后,MTT实验显示鼻咽癌细胞的增殖活性受抑制;细胞划痕和transwell小室实验显示,CNE1细胞的迁移和侵袭能力在敲减PIK3CA后受到了的抑制（P<0.05）。（3）焦磷酸盐测序检测PIK3CA基因启动子甲基化水平,在启动子区发现4个甲基化位点,其中3个位点鼻咽癌组甲基化水平高于正常鼻咽粘膜组织组（P<0.05）。第二部分:（1）利用star Base预测mi R-515-5p和PIK3CA之间的潜在靶位点,双荧光素酶报告基因和RIP检测证实了mi R-515-5p是通过该结合位点调控鼻咽癌细胞中PIK3CA基因的表达;使用western blot法分析其调控关系,结果显示转染mi R-515-5p的鼻咽癌细胞较正常鼻咽粘膜细胞中PIK3CA的蛋白水平下调（P<0.05）,提示mi R-515-5p在体外负性调控PIK3CA的表达。（2）CCK8法检测结果提示,转染mi R-515-5p后鼻咽癌细胞较PIK3CA组增殖下降（P<0.05）,提示mi R-515-5p逆转了PIK3CA对细胞增殖的促进作用。（3）转染mi R-515-5p后,鼻咽癌细胞随辐射量的增加细胞存活分数降低,PIK3CA组较对照组存活分数下降幅度小,差异具有统计学意义（P<0.05）,PIK3CA促进鼻咽癌细胞的放疗抵抗,mi R-515-5p的上调逆转了PIK3CA诱导的对放疗抵抗的增强作用。流式细胞仪和western blot检测结果提示,PIK3CA过表达可抑制放疗导致的NPC细胞凋亡（P<0.05）,而转染mi R-515-5p后PIK3CA抑制放射线所致的凋亡作用被消除（P<0.05）。综上所述,PIK3CA促进NPC细胞的增殖和放疗抵抗,抑制NPC细胞的凋亡,而mi R-515-5p在调节NPC细胞增殖、凋亡和放疗抵抗中与PIK3CA起着相反的作用。第三部分:（1）组织水平,与配对正常对照组织相比,NPC组织中PVT1上调,晚期（III+IV）的PVT1表达水平高于早期（P<0.05）;而细胞水平,鼻咽癌中PVT1较鼻咽上皮细胞中上调,PVT1水平越高,细胞存活率越低（P<0.05）,以上结果提示PVT1可能是鼻咽癌的癌基因,其高表达导致了NPC的预后不良。（2）通过sh-PVT1瞬时转染鼻咽癌细胞,细胞增殖CCK8试验提示鼻咽癌细胞中PVT1下调抑制NPC癌细胞的增殖;细胞克隆形成实验显示,细胞随辐照剂量（0,2,4,6,8Gy）的增高sh-PVT1组较sh-Control组存活分数下降（P<0.05）,提示敲减PVT1后明显促进NPC细胞的辐射敏感性。流式细胞仪和western blot法检测发现,不同辐照剂量（0和8 Gy）下PVT1敲减后鼻咽癌细胞凋亡率升高,sh-Control组较sh-PVT1组细胞周期蛋白D1的增加、Bax水平的下降（P<0.05）,PVT1沉默降低了细胞周期蛋白D1的水平,增加了放疗后Bax在NPC细胞中的表达。综上所述,敲减PVT1在体外抑制NPC细胞的增殖和放疗抵抗,并诱导细胞凋亡。（3）通过star Base发现mi R-515-5p载有PVT1的靶位点,双荧光素酶报告基因和RIP检测证实mi R-515-5p是PVT1的靶点。经q RT-PCR证实mi R-515-5p在体外受到NPC细胞中PVT1的负调控。（4）CCK8法检测结果提示,鼻咽癌细胞转染mi R-515-5p后增殖水平下降（P<0.05）,但转染mi R-515-5p+PVT1后的鼻咽癌细胞较mi R-515-5p组增殖增加（P<0.05）,PVT1的表达逆转mi R-515-5p对细胞增殖抑制。克隆形成实验及流式细胞仪检测同样提示,PVT1通过反向调控mi R-515-5p的作用,促进NPC细胞的增殖和放疗抵抗,抑制NPC细胞的凋亡。（5）经western blot检测发现,在鼻咽癌细胞水平,sh-PVT1组较对照组PIK3CA和p-AKT的蛋白质表达水平低（P<0.05）,PVT1的下调降低了PIK3CA和p-AKT的水平;转染sh-PVT1+Anti-Control组较sh-PVT1+Anti-mi R-515-5p组逆转了这种作用（P<0.05）。结果表明,通过与NPC细胞中mi R-515-5p相互作用,PVT1在体外诱导了AKT通路。（6）裸鼠异种移植瘤模型实验证实,敲减PVT1在体内通过与PIK3CA发生作用,抑制了肿瘤的生长。结论:（1）PIK3CA蛋白在鼻咽癌组织中高表达,并与鼻咽癌的不良预后相关,PIK3CA基因表达下调能抑制鼻咽癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力;鼻咽癌中PIK3CA存在异常甲基化,且其甲基化水平高于鼻咽正常粘膜组织。（2）mi R-515-5p在体外靶向调控PIK3CA,并负性调节PIK3CA的表达。PIK3CA促进NPC细胞的增殖及放疗抵抗,抑制了NPC细胞的凋亡,而Mi R-515-5p逆转了PIK3CA的作用。（3）PVT1在NPC组织中高表达,并与NPC的不良预后相关。mi R-515-5p是PVT1的靶点,并且在体外受到NPC细胞中PVT1的负调控。PVT1通过与mi R-515-5p相互作用,促进NPC细胞的增殖和放疗抵抗,抑制NPC细胞的凋亡。在体外PVT1通过与NPC细胞中mi R-515-5p相互作用,诱导了AKT通路,促进鼻咽癌细胞增殖和放疗抵抗。敲减PVT1在体内通过与PIK3CA发生作用,抑制了肿瘤的生长。PVT1/mi R-515-5p-PIK3CA轴能够促进肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移,并诱导鼻咽癌细胞放疗抵抗,导致鼻咽癌预后不良,本研究为鼻咽癌的发病机制和个体化靶向治疗关键分子筛查提供了新的靶点和思路。
白桦[6]（2020）在《miR-451靶向MIF调控宫颈癌细胞生物学功能并通过外泌体释放影响其化疗敏感性》文中研究指明宫颈癌是严重影响女性健康的一大杀手,是妇科恶性肿瘤患者最常见的死亡原因。虽然宫颈癌疫苗的应用能够有效减少宫颈癌的发生,但每年仍有约80%的新发病例和85%的死亡病例发生在发展中国家,并且其中超过70%的病例在诊断时已处于局部晚期,称为局部晚期宫颈癌。虽然目前宫颈癌的治疗方式已很全面—手术、化疗、放疗及免疫治疗等,但并不是所有患者都能获得较好疗效,尤其对于局部晚期宫颈癌患者疗效仍较差。对于局部晚期宫颈癌,目前的治疗方式是新辅助化疗后对化疗敏感患者采取手术治疗,不敏感患者直接转为放疗,如果有能有效预测患者对化疗敏感性的指标,这部分对化疗不敏感患者就可以免去新辅助化疗的时间及花费,直接转去放疗,得到更好疗效。因此,继续深入研究宫颈癌的发病机制,寻找特异性的治疗靶点以及预测化疗敏感性的标志物对于宫颈癌的治疗仍极为重要。生物信息学是一门交叉学科,随着人类基因组计划的完成,测序数据的爆炸式增长,应用生物信息学技术分析基因组数据之间的关系成为目前一大趋势,用于揭示疾病发生发展及耐药的分子机制。GEO数据库,是美国国立卫生研究院NCBI于2000年创建的公共数据库,是目前最大、最全面的公共基因表达数据资源。外泌体是一种能被机体内大多数细胞分泌的直径大约为30-150nm的具有脂质双层膜的微小膜泡,富含miRNA等物质,通过内吞、外排等作用调节机体多种生理或病理反应,参与肿瘤微环境的调节,还可以作为载体靶向传递药物至器官发挥作用等。在本研究中,近年的研究发现miR-451不仅参与肿瘤的发生进展,还参与肿瘤化疗敏感性的调控,相较于其他miRNA,miR-451更易于在外泌体中富集。基于以上研究背景,在本研究中,先使用生物信息学方法筛选在宫颈癌中差异表达的miRNA,结合文献筛选确定miR-451为研究对象,进一步分析其下游靶标及涉及的机制通路后,通过体外实验验证miR-451的生物学功能。近几年的研究表明miR-451可通过包裹于外泌体中影响肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,因此我们试验性在的在宫颈癌亲代及其耐药细胞株中研究了miR-451在预测宫颈癌化疗敏感性中的作用。本研究为寻找预测宫颈癌患者特异性治疗靶点及预测宫颈癌患者化疗敏感性的标志物提供理论及实验室依据,并为以外泌体作为治疗载体治疗宫颈癌提供了新的治疗思路。第一部分宫颈癌相关差异miRNA生物信息学研究目的:研究整理分析GEO中公共数据库中储存的宫颈癌miRNA数据集,筛选差异表达的miRNA基因,并对差异表达基因进行靶基因预测,ce RNA网络构建,GO功能注释,KEGG功能富集分析及PPI网络分析。为后续实验探索宫颈癌的发生进展的分子机制提供理论基础。方法:本研究以宫颈癌的相关芯片数据集作为研究对象,其中以正常样本作为对照,从GEO数据库中筛选出miRNA数据集GSE30656为研究对象,通过limma和affy包对质控后的RNA表达谱进行差异表达分析。在Pubmed中对差异miRNA逐个筛选,经过通读文献,对宫颈癌相关文献中已被证实及研究过的miRNA予以去除,确定下一步研究的目标miRNA。再针对目标miRNA进行靶基因预测,DAVID软件进行GO功能注释,KEGG功能富集分析,STRING在线数据库进行PPI网络分析。结果:1)本研究在宫颈癌中发现50个差异表达的miRNA,其中表达上调的21个,表达下调的29个。结合文献筛选,选取miR-451作为下一步实验验证的基因。2)针对于miR-451筛选到的m RNA基因进行功能富集分析,发现差异表达基因主要参与氮化合物代谢过程的调控、蛋白磷酸化过程的调控、RNA代谢过程的调控、细胞蛋白质代谢的调节等生物学功能。KEGG通路富集分析发现差异表达的基因主要集中在PI3K/AKT通路及m TOR等信号通路。结论:1)成功筛选出宫颈癌中差异表达的50个miRNA,包括21个上调的miRNA和29个下调的miRNA;结合文献检索筛选检出miR-451作为后续研究基因;2)对miR-451进行了lnc RNA-miRNA-m RNA ce RNA网络,并分析对其下游m RNA靶基因进行了GO功能富集分析与KEGG通路分析,以及对差异m RNA进行了PPI蛋白互作网络分析,为后续进行实验验证提供了基于宫颈癌组织测序数据分析的理论依据。第二部分:miR-451通过靶向MIF抑制宫颈癌细胞增殖迁移等功能目的:探讨miR-451通过靶向MIF对宫颈癌细胞增殖、凋亡、周期、侵袭及迁移能力的影响及其分子机制。方法:在Si Ha细胞中转染miR-451 NC/mimic,Ca Ski细胞中转染miR-451 NC/inhibitor后,CCK-8法检测miR-451对细胞增殖的影响;流式细胞术检测miR-451对细胞凋亡及周期的影响;细胞划痕实验检测miR-451对细胞迁移能力的影响;Transwell实验检测miR-451对细胞侵袭能力的影响;荧光素酶报告实验验证MIF是miR-451的下游靶标;Western Blot法检测miR-451靶向MIF对下游PI3K/AKT/m TOR信号通路的调节。结果:1)miR-451在人宫颈癌细胞系中差异表达;2)在Si Ha细胞中过表达miR-451可对细胞产生抑制增殖、促进凋亡、阻滞周期、降低细胞迁移及侵袭能力的作用;在Ca Ski细胞中抑制miR-451表达可对细胞产生促进增殖、抑制凋亡、促进周期进展、促进细胞迁移及侵袭能力的作用;3)MIF为miR-451的下游靶标;4)miR-451的生物学功能是通过影响PI3K/AKT/m TOR通路实现的。结论:过表达miR-451可抑制宫颈癌细胞增殖、促进凋亡、阻滞周期、降低细胞迁移及侵袭能力,抑制miR-451表达可促进宫颈癌细胞增殖、抑制凋亡、促进周期进展、促进细胞迁移及侵袭能力;其功能是通过靶向MIF及其下游PI3K/AKT/m TOR信号通路实现的。第三部分miR-451通过外泌体释放的形式维持宫颈癌细胞对顺铂的敏感性目的:研究miR-451在宫颈癌顺铂耐药中的作用,探索其功能是否是通过将miR-451包裹于外泌体中释放的形式实现的。方法:CCK-8法检测宫颈癌顺铂耐药株He La/DDP细胞及其亲代He La细胞的耐药指数;使用超高速离心法成功分离了两种细胞上清中的外泌体,通过电镜下观察形态、粒径大小检测、表面标记物检测鉴定外泌体;又定量分析了细胞及外泌体中miR-451的相对含量,进一步研究过表达或抑制miR-451后细胞IC50的变化及多药耐药基因MDR1的表达变化。结果:1)成功分离提取并鉴定了外泌体;2)miR-451在He La细胞中高表达,在其上清中低表达;miR-451在He La/DDP细胞中低表达,在其上清中高表达;3)在He La/DDP细胞中过表达miR-451后细胞对顺铂IC50明显下降,在He La细胞中抑制miR-451表达后细胞对顺铂IC50明显上调,提示miR-451可增强细胞对顺铂的敏感性;4)过表达miR-451后MDR1表达显着下调,提示He La/DDP细胞可能将抑癌基因miR-451包裹入外泌体中排出以维持细胞的耐药性。结论:miR-451可通过外泌体释放的形式影响宫颈癌耐药细胞对顺铂的敏感性。
亢晶[7]（2020）在《EGFL6在食管癌细胞发生发展中的作用及机制研究》文中研究说明目的:1.研究EGFL6在食管癌患者中的表达情况及与临床病理资料之间的联系;2.研究EGFL6沉默时对食管癌细胞的增殖、侵袭、迁移和凋亡的影响;3.研究EGFL6过表达时对食管癌细胞增殖、侵袭、迁移和凋亡的影响;4.探究EGFL6诱导食管癌细胞增殖、侵袭和迁移的机制。方法:1.收集山西医科大学第一医院2017-2019年食管癌患者的癌组织及癌旁组织,通过免疫组织化学染色的方法比较EGFL6在不同的组织中的表达情况,结合食管癌患者的临床病理资料,分析EGFL6表达水平与临床病理资料及生存率的相关性,并利用TCGA（The Cancer Genome Atlas）数据库检测EGFL6基因在人类食管癌组织中的表达水平;2.通过Real-time PCR和Western-blot法检测EGFL6在正常的食管上皮细胞系（Het-1A）和不同食管癌细胞系（EC9706、KYSE150、KYSE450）中的表达情况;3.以EGFL6基因表达量较高的KYSE450细胞系和表达量较低的KYSE150细胞系为研究对象,通过分别转染EGFL6小干扰RNA和过表达质粒,构建EGFL6基因沉默和过表达的食管癌细胞系,将KYSE450细胞分成3组:空白组（blank）、对照组（siNC）和小干扰组（siRNA）;将KYSE150细胞分成2组:空质粒组（PcDNA3.1）和EGFL6过表达组（PcDNA3.1+EGFL6）,通过Real-time PCR和Western-blot法检测转染效率;4.通过CCK8实验和平板克隆形成实验检测EGFL6沉默和过表达时对食管癌细胞增殖的影响;5.通过细胞划痕实验和transwell实验检测当EGFL6沉默和过表达时对食管癌细胞的侵袭迁移的影响;6.通过流式细胞术检测EGFL6对食管癌细胞凋亡影响,应用Real-time PCR和Western-blot法检测凋亡相关标志（Bcl-2、Bax和Casepase3）的变化;7.通过Real-time PCR和Western-blot法检测食管癌细胞中EGFL6沉默和过表达时对EMT相关标志物（E-cadherin、Vimentin、Snail、Fibronectin、Twist和N-cadherin）的影响;8.通过Real-time PCR检测食管癌细胞中EGFL6沉默和过表达时对食管癌相关干细胞标记物（Bmi1、OCT、SOX2、NANOG、CD44）影响;9.通过Western-blot法检测EGFL6对Wnt/β-catenin信号通路中关键蛋白（p-β-catenin、β-catenin、GSK3β、c-myc）表达水平的影响;10.动物实验:裸鼠皮下注射shEGFL6-KYSE450组和shNC-KYSE450组细胞,构建裸鼠食管癌移植瘤模型,测量移植瘤的体积和质量并进行统计学分析。结果:1.EGFL6蛋白在食管癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织;EGFL6蛋白的表达水平与食管癌患者肿瘤的大小（P=0.042）、T分类（P=0.014）、淋巴结的转移（P=0.002）、远处转移（P<0.001）、癌分化程度（P=0.01）有关,与患者年龄（P=0.541）、性别（P=0.496）无关;TCGA数据库显示EGFL6基因在人食管癌组织中的表达水平明显高于癌旁,EGFL6蛋白表达高的食管癌患者的总体生存率低于EGFL6蛋白表达低的患者（P<0.05）;2.EGFL6在食管上皮细胞（Het-1A）中的表达明显低于食管癌细胞（EC9706、KYSE150、KYSE450）,且EGFL6在KYSE450细胞系中表达最高,在KYSE150细胞系中表达相对较低;3.CCK-8实验显示,当EGFL6基因沉默时,相对于对照组,食管癌细胞活力明显降低;当EGFL6基因过表达时,相对于对照组,食管癌细胞活力明显增强;4.平板克隆形成实验显示,当EGFL6基因沉默时,相对于对照组,食管癌细胞形成的克隆团块明显少;当EGFL6基因过表达时,相对于对照组,食管癌细胞形成的克隆团块明显增多;5.细胞划痕实验和transwell实验显示,当EGFL6基因沉默时,相对于对照组,食管癌细胞的侵袭迁移能力明显降低;当EGFL6基因过表达时,相对于对照组,食管癌细胞的侵袭迁移能力明显增强;6.流式细胞术显示EGFL6沉默时食管癌细胞凋亡明显增加,EGFL6过表达时食管癌细胞的凋亡明显减少,Real-time PCR和Western-blot结果与流式一致;7.Real-time PCR和Western-blot检测EMT相关标志物发现:EGFL6沉默时抑制食管癌细胞向EMT方向转变,EMT相关标志物E-cadherin表达增高;Vimentin、Snail、Fibronectin、Twist和N-cadherin表达降低;EGFL6过表达时促进食管癌细胞向EMT方向转变,EMT相关标志物E-cadherin表达降低;Vimentin、Snail、Fibronectin、Twist和N-cadherin表达增高;8.Real-time PCR检测食管癌干细胞相关基因在EGFL6基因沉默和过表达时的表达情况,结果显示当EGFL6基因沉默时,食管癌干细胞基因表达较低;当EGFL6基因过表达时,食管癌干细胞基因表达增高,说明EGFL6可能参与维持食管癌干细胞样细胞群的表达;9.Western-blot检测Wnt/β-catenin信号的标记基因p-β-catenin、β-catenin、GSK3β和c-myc的表达。结果表明在KYSE450细胞中,相对于siNC组,siRNA组p-β-catenin、总β-catenin和c-myc蛋白表达下调,GSK3β蛋白表达上调;在KYSE150细胞中,相对于PcDNA3.1组,PcDNA3.1+EGFL6组中p-β-catenin、总β-catenin和c-myc蛋白表达上调,GSK3β蛋白表达下降;10.裸鼠皮下移植瘤模型构建成功,相对于shNC-KYSE450组,shEGFL6-KYSE450组裸鼠皮下形成的肿瘤体积明显减小,质量明显降低,这与我们在细胞实验上的结果一致。结论:1.EGFL6在食管癌组织的表达明显高于癌旁,且与患者的预后不良相关。2.EGFL6能够促进食管癌细胞的增殖、侵袭和迁移,抑制食管癌细胞凋亡。3.EGFL6可能通过Wnt/β-catenin信号通路促进食管癌细胞的EMT的发生和维持食管癌干细胞特性。4.食管癌细胞中敲除EGFL6能够抑制裸鼠皮下移植瘤生长。
周思颖[8]（2020）在《CircVAPA/miR-130a-5p调节轴对乳腺癌侵袭迁移的影响及紫草素干预作用的研究》文中研究指明本研究旨在初步探讨环状RNA circVAPA通过竞争性结合miR-130a-5p促进人乳腺癌细胞侵袭和迁移的作用,以及紫草素在此过程中的干预作用,并分析其可能的作用机制。以此为转移性乳腺癌的中西医结合诊断和治疗提供新的分子靶标,也为指导临床使用紫草素治疗乳腺癌提供理论依据。研究内容分为三部分:第一部分CircVAPA在乳腺癌中的表达及临床意义目的:研究环状RNA circVAPA在乳腺癌组织和细胞中的表达情况,探讨其在调控乳腺癌细胞迁移和侵袭中的作用。方法:（1）利用环状RNA高通量测序分析3例乳腺癌及邻近癌旁组织的冰冻标本中环状RNA的表达情况。（2）利用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）在29例乳腺癌及邻近癌旁组织的冰冻标本以及人乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB-231中检测circVAPA的表达情况,并通过Sanger测序判断circVAPA的接头序列。（3）构建circVAPA过表达质粒（p-circVAPA）,通过转染过表达质粒使低侵袭性的乳腺癌细胞株MCF-7过表达circVAPA后进行功能学实验,探索过表达circVAPA对MCF-7细胞的生物学特性的影响。同时,在高侵袭性的乳腺癌细胞株MDA-MB-231中转染siRNA（specific interfering RNA）敲低circVAPA的表达后进行功能学实验,探索circVAPA低表达对MDA-MB-231细胞的生物学特性的影响。结果:（1）与癌旁组织相比,circVAPA在乳腺癌组织中高表达;与淋巴结阴性组织相比,circVAPA在淋巴结阳性组织中高表达。（2）与低侵袭性的MCF-7细胞相比,circVAPA在高侵袭性的MDA-MB-231细胞中高表达。（3）过表达circVAPA的MCF-7细胞株的侵袭及迁移能力显着增强,而敲除circVAPA的MDA-MB-231细胞株的侵袭及迁移能力明显减弱。结论:环状RNA circVAPA表达水平与乳腺癌细胞侵袭转移能力呈正相关,异常表达的circVAPA能够影响乳腺癌细胞的侵袭和迁移能力。第二部分紫草素在体内外对乳腺癌发生发展的抑制作用目的:在体外细胞株中研究紫草素（shikonin）对乳腺癌增殖、侵袭和迁移的影响,并在体内动物模型中探讨紫草素对乳腺癌的抑瘤作用。方法:（1）选择不同浓度的紫草素（1,2,4,8,16,32,64 μM）分别处理人乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231,利用MTT法测定紫草素对乳腺癌细胞增殖的抑制率和半数致死量（IC50）。采用流式细胞术观察紫草素处理MCF-7和MDA-MB-231细胞24 h后的细胞凋亡率。确定紫草素在两株细胞中的无毒剂量。（2）利用EdU细胞增殖检测技术观察不同浓度紫草素对乳腺癌细胞增殖的抑制作用;利用细胞划痕及Transwell实验检测紫草素处理24 h后细胞侵袭和迁移的变化。（3）建立人乳腺癌细胞MDA-MB-231异种移植瘤裸鼠模型,使用不同剂量紫草素对裸鼠进行药物治疗,检测紫草素对裸鼠瘤体的生长抑制作用,并观察其毒副作用。结果:（1）紫草素对人乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231的增殖具有抑制作用,其作用效应呈一定的浓度和时间依赖性。（2）2,4 μM浓度的紫草素能够显着抑制MCF-7细胞的侵袭及迁移能力;8μM浓度的紫草素能够显着抑制MDA-MB-231细胞的侵袭及迁移能力。（3）高剂量紫草素（15 mg/kg/d）对人乳腺癌细胞荷瘤裸鼠的瘤体具有明显的生长抑制作用且无明显毒副作用。结论:中药单体紫草素不仅能够在体外有效抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移,在体内依然可以显着抑制乳腺癌移植瘤的生长,在乳腺癌的治疗中具有潜在应用价值。第三部分CircVAPA/miR-130a-5p调节轴促进乳腺癌侵袭迁移及紫草素的干预作用目的:研究环状RNA circVAPA对乳腺癌侵袭迁移发挥作用的具体机制,并探讨紫草素在circVAPA/miR-130a-5p调节轴中的干预作用。方法:（1）利用原位杂交技术（Fluorescence in situ hybridization,FISH）判断 circVAPA 在细胞中的定位。（2）利用miRNA高通量测序分析3例乳腺癌及邻近癌旁组织的冰冻标本中miRNA的表达;采用生物信息学软件预测circVAPA可能的下游miRNA,与miRNA高通量测序结果取交集。（3）利用RT-qPCR在29例乳腺癌及邻近癌旁组织的冰冻标本以及人乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB-231中检测miR-130a-5p的表达情况。（4）使用双荧光素酶报告基因检测circVAPA与miR-130a-5p是否存在吸附关系。对MDA-MB-231细胞进行miR-130a-5p模拟物（mimics）的转染,划痕实验及Transwell实验证实miR-130a-5p的功能。最后通过功能恢复实验,验证过表达circVAPA是否能抑制miR-130a-5p的生物学功能。（5）利用RT-qPCR在紫草素处理MDA-MB-231细胞前后检测miR-130a-5p的表达情况。对紫草素处理后的MDA-MB-231细胞进行miR-130a-5p抑制物（inhibitor）的转染,从反面证实紫草素在乳腺癌细胞中通过上调miR-130a-5p发挥功能。（6）利用RT-qPCR检测亲本基因VAPA在MCF-7和MDA-MB-231中的表达以及过表达和敲除circVAPA后VAPA的表达水平。用Kaplan-Meier生存分析方法分析1764位乳腺癌患者的生存数据。结果:（1）原位杂交技术证实circVAPA主要存在于乳腺癌细胞的细胞质中。（2）与癌旁组织相比,miR-130a-5p在乳腺癌组织中低表达;与淋巴结阴性组织相比,miR-130a-5p在淋巴结阳性组织中低表达。（3）与低侵袭性的MCF-7细胞相比,miR-130a-5p在高侵袭性的MDA-MB-231细胞中低表达。（4）生物信息学预测表明miR-130a-5p包含一个与circVAPA匹配的结合位点并且有很强的结合可能性。双荧光素酶报告系统结果提示circVAPA能够通过结合位点吸附miR-130a-5p。同时,划痕实验及transwell迁移实验均表明miR-130a-5p能降低MDA-MB-231细胞株的侵袭迁移能力。由circVAPA和miR-130a-5p的相反的生物学功能,提示circVAPA可以竞争性结合miR-130a-5p抑制其在MDA-MB-231细胞中的抗侵袭和迁移能力。（5）RT-qPCR结果发现经紫草素处理后,miR-130a-5p在MDA-MB-231细胞中的表达上调。同时,划痕实验及Transwell实验均证实紫草素在乳腺癌细胞中通过上调miR-130a-5p恢复其抗侵袭和迁移能力。（6）Kaplan-Meier生存分析结果表明VAPA基因的低表达与较差的无病生存率（DFS）密切相关。上调或者下调circVAPA的表达不会影响VAPA在乳腺癌细胞中的表达。结论:CircVAPA通过竞争性结合miR-130a-5p促进乳腺癌细胞的侵袭和迁移;紫草素在一定程度上能通过干预circVAPA/miR-130a-5p调节轴抑制乳腺癌细胞的侵袭和迁移。
乔冠恩[9]（2019）在《miR-106b-3p靶向ZNRF3调控食管鳞癌恶性生物学行为及分子机制研究》文中提出目的:本实验主要研究食管鳞癌（esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）组织中miR-106b-3p的表达情况,通过体外细胞实验和体内动物实验确认miR-106b-3p的差异表达能够影响ESCC细胞的增殖、迁移、侵袭、黏附和上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）进程。通过Target Scan以及双荧光素酶报告实验预测及验证miR-106b-3p在ESCC调控中的靶基因。最后,深入探讨miR-106b-3p调控ESCC恶性生物学功能的机制。方法:1、收集苏州大学附属第一医院和邯郸市第一医院的ESCC组织和癌旁样本3对,应用Agilent miRNAs表达谱芯片技术筛选出差异表达的miRNAs;2、RT-qPCR检测差异比较大的miR-106b-3p的表达水平;3、RT-qPCR检测miR-106b-3p在ESCC细胞株（KYSE150、ECA109和EC9706）和人正常食管上皮细胞（HET-1A）中的表达;MTT-8和克隆形成实验检测ESCC细胞株（KYSE150、ECA109和EC9706）和人正常食管上皮细胞（HET-1A）的增殖能力;4、将合成的miR-106b-3p mimics NC、miR-106b-3p mimics、miR-106b-3p inhibitors NC及miR-106b-3p inhibitors转染至ESCC细胞株（ECA109和KYSE150）中,RT-qPCR检测转染效率;MTT和克隆形成实验检测miR-106b-3p对ESCC细胞株（ECA109和KYSE150）增殖能力的影响,流式周期实验观察对周期分布的影响,Western blot实验观察对细胞周期、迁移、侵袭及EMT相关蛋白表达的影响,划痕实验观察对细胞非定向迁移能力的影响,Transwell迁移实验观察对细胞定向迁移能力的影响,Transwell侵袭移实验观察对细胞侵袭能力的影响,光镜观察细胞形态的变化,细胞黏附实验观察对细胞黏附能力的影响;5、构建ESCC细胞株（ECA109）裸鼠移植瘤模型,观察miR-106b-3p对ESCC细胞株移植瘤生长的作用;6、免疫荧光和Western blot实验检测ZNRF3在ESCC细胞株（KYSE150、ECA109和EC9706）和人正常食管上皮细胞（HET-1A）中的表达;RT-qPCR、Western blot和免疫荧光实验检测ESCC细胞株（ECA109和KYSE150）转染miR-106b-3p mimics NC、miR-106b-3p mimics、miR-106b-3p inhibitors NC及miR-106b-3p inhibitors后ZNRF3 m RNA和蛋白的表达;Target Scan预测miR-106b-3p的靶基因,双荧光素酶报告实验验证miR-106b-3p的靶基因;7、RT-qPCR和Western blot检测miR-106b-3p对ESCC细胞株（ECA109和KYSE150）中Wnt/β-catenin信号通路的影响。结果:1、利用Agilent miRNAs表达谱芯片筛选出62个ESCC差异表达的miRNAs,其中ESCC表达上调的miRNAs 41个,下调的miRNAs 21个;2、RT-qPCR实验结果显示miR-106b-3p在ESCC临床组织样本的表达水平要显着高于其在癌旁中的表达;3、RT-qPCR结果显示miR-106b-3p在ESCC细胞株（KYSE150、ECA109和EC9706）中的表达要显着高于其在人正常食管上皮细胞（HET-1A）的表达;MTT和克隆形成实验结果显示ESCC细胞株（KYSE150、ECA109和EC9706）的增殖能力要显着高于人正常食管上皮细胞（HET-1A）;4、转染miR-106b-3p inhibitors后,ESCC细胞株（ECA109和KYSE150）中miR-106b-3p的表达水平显着降低,转染miR-106b-3p mimics后,ESCC细胞株（ECA109和KYSE150）中miR-106b-3p的表达水平显着升高;MTT实验表明转染miR-106b-3p inhibitors后ESCC细胞株（ECA109和KYSE150）的增殖能力显着降低,而转染miR-106b-3p mimics后的增殖能力显着增强;克隆形成实验验表明转染miR-106b-3p inhibitors后ESCC细胞株的克隆形成能力显着降低,而转染miR-106b-3p mimics后的克隆能力显着增强;流式周期实验表明转染miR-106b-3p inhibitors后ESCC细胞株细胞阻滞在G1期,而转染miR-106b-3p mimics后的G1比例显着下调,且miR-106b-3p inhibitors能够显着抑制Cyclin D1蛋白的表达,促进p21和p27的表达,而miR-106b-3p mimics能够显着促进Cyclin D1蛋白的表达,抑制p21和p27的表达;划痕实验和Transwell迁移表明转染miR-106b-3p inhibitors后ESCC细胞株的迁移能力显着降低,而转染miR-106b-3p mimics后的迁移显着增强;Transwell侵袭实验表明转染miR-106b-3p inhibitors后ESCC细胞株的侵袭能力显着降低,而转染miR-106b-3p mimics后的侵袭显着增强;Western blot实验表明,miR-106b-3p inhibitors能够显着抑制MMP-2和MMP-9蛋白的表达,而miR-106b-3p mimics能够显着促进MMP-2和MMP-9蛋白的表达;细胞形态和黏附实验表明,miR-106b-3p inhibitors能够抑制ESCC细胞株对collagen I、collagen IV和fibronectin的黏附,而miR-106b-3p mimics能够增强对collagen I、collagen IV和fibronectin的黏附;Western blot实验表明,miR-106b-3p inhibitors能够显着抑制Snail、N-cadherin和Vimentin蛋白的表达,促进E-cadherin蛋白的表达,而miR-106b-3p mimics能够显着促进Snail、N-cadherin和Vimentin蛋白的表达,抑制E-cadherin蛋白的表达;5、裸鼠移植瘤实验表明,抑制miR-106b-3p的表达能够显着抑制移植瘤的生长,而促进miR-106b-3p的表达则显着促进移植瘤的生长;6、免疫荧光和Western blot实验表明ZNRF3在ESCC细胞株（KYSE150、ECA109和EC9706）的表达要显着低于其在人正常食管上皮细胞（HET-1A）中的表达;RT-qPCR、Western blot和免疫荧光实验结果表明,ESCC细胞株（ECA109和KYSE150）转染miR-106b-3p mimics后,ZNRF3 m RNA和蛋白的表达显着降低,转染miR-106b-3p inhibitors后,ZNRF3 m RNA和蛋白的表达显着升高;Target Scan预测ZNRF3是miR-106b-3p的潜在靶基因,且双荧光素酶报告实验验证ZNRF3是miR-106b-3p的靶基因;7、RT-qPCR结果显示抑制miR-106b-3p的表达可以显着抑制Wnt和β-catenin m RNA的表达,促进GSK3βm RNA的表达;促进miR-106b-3p的表达可以显着促进Wnt和β-catenin m RNA的表达,降低GSK3βm RNA的表达。Western blot实验示抑制miR-106b-3p的表达可以显着抑制Wnt和β-catenin蛋白的表达,上调p-GSK3β蛋白的表达;促进miR-106b-3p的表达可以显着促进Wnt和β-catenin蛋白的表达,降低p-GSK3β蛋白的表达。结论:1、miR-106b-3p在食管鳞癌临床样本中显着高表达;2、miR-106b-3p可以显着促进食管鳞癌细胞株的增殖、周期、迁移、侵袭、黏附及EMT进程;能够显着促进食管鳞癌细胞移植瘤的生长;3、miR-106b-3p能够靶向作用于ZNRF3;4、miR-106b-3p可以显着促进Wnt/β-catenin信号通路的表达。
张岩[10]（2019）在《EBV相关胃癌中NF-κB经典信号通路持续激活的机制研究》文中提出EB病毒（Epstein-Barr virus,EBV）属γ疱疹病毒亚科,全球成人的感染率高达90%以上,能够在宿主细胞内长期潜伏,与多种人类肿瘤的发生有关,是公认的DNA肿瘤病毒。EBV相关肿瘤中几乎所有的肿瘤细胞均可检测到EBV基因组的存在,EBV在宿主细胞中建立的潜伏感染是其重要的致癌基础,EBV通过其潜伏期基因产物影响受感染细胞的基因表达及生物学行为参与相关肿瘤的发生发展。EBV相关胃癌（EBV-associated gastric carcinoma,EBVaGC）是胃癌的一种独特亚型,是发病人数最高的EBV相关肿瘤,与EBV阴性胃癌（EBV-negative gastric carcinoma,EBVnGC）相比具有独特的临床病理特征,但其发病机制尚未完全明了。EBV编码的潜伏基因产物可参与多种细胞信号通路的传导,如NF-κB、JNK、STAT3和PI3K/AKT等,通过一系列级联反应参与宿主细胞基因和病毒基因的表达调控,诱导细胞转化、促进细胞增殖、抑制细胞的分化和凋亡,从而导致EBV相关肿瘤的发生。转录因子NF-κB是与细胞增殖、免疫反应、炎症反应和肿瘤密切相关的重要的调节因子,持续激活的NF-κB信号通路能够通过上调其下游分子的表达来诱导细胞增殖,抑制肿瘤细胞的凋亡。NF-κB信号通路在肿瘤发生发展中的重要作用在多种EBV相关肿瘤中已被阐述,但其在EBVaGC中的具体作用机制还不明确。目的:1通过检测胃癌细胞系及胃癌组织中NF-κB经典信号通路相关分子的表达及亚细胞定位,明确EBVaGC和EBVnGC中NF-κB经典信号通路的激活情况。2探讨EBV通过潜伏感染激活NF-κB经典信号通路的具体机制。3检测分析NF-κB信号通路对EBV阳性胃癌细胞增殖和凋亡等细胞生物学行为,以及EBV潜伏膜蛋白LMP1、LMP2A表达的影响。方法:1提取EBV阴性胃癌细胞系（SGC7901,BGC823,HGC27）、EBV阳性胃癌细胞系（GT38,GT39,SNU719）总RNA和总蛋白,采用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,qRT-PCR）对NF-κB信号通路相关分子（NFKBIA、TRAF1/2/3/6）的转录表达进行检测;Western blot检测并分析其蛋白表达水平;免疫荧光技术检测胃癌细胞系中p65蛋白的亚细胞定位;ELISA技术检测细胞系中NF-κB转录因子与DNA结合能力,综合判断NF-κB信号通路在胃癌细胞系中的激活情况。2免疫组化技术检测EBVaGC和EBVnGC肿瘤组织中IκBα及p65蛋白表达及亚细胞定位。3采用不同浓度的NF-κB信号通路抑制剂BAY11-7082作用EBV阳性胃癌细胞系SNU719及EBV阴性胃癌细胞系SGC7901,24h后CCK-8检测细胞存活情况。4采用流式细胞技术及Annexin-FITC试剂盒分别检测浓度为2.5μM、5μM和10μM的NF-κB信号通路抑制剂BAY11-7082作用12h后对EBV阳性胃癌细胞系GT38凋亡的影响。Western blot检测BAY11-7082、MG-132不同浓度及不同处理时间IκBα和磷酸化IκBα以及凋亡相关蛋白（Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3）的表达。5采用2.5μM,5μM,10μM浓度的BAY11-7082作用EBV阳性胃癌细胞系GT38,12h后收集细胞提取总蛋白,Western blot检测转录因子ZEB1蛋白的表达变化情况。6采用BGS特异性引物对NFKBIA基因启动子区进行扩增,该区域含有83个CpG位点,随机选取扩增条带进行TA克隆,每个样本挑选6个克隆,根据所测6个TA克隆总CpG位点中发生甲基化的比例计算甲基化率。7 PCR结合DNA测序技术检测胃癌细胞系IκBα基因突变情况。8 miRBase和rna22网站预测EBV编码的miR-BART16含有IκBα3’UTR结合位点,将IκBα3’UTR靶定序列或其突变序列分别克隆至双荧光素酶报告基因质粒,连同相应的模拟物共转染HEK293T细胞检测其荧光素酶的表达。9构建分别携带EBV潜伏膜蛋白LMP1和LMP2A编码基因的重组表达质粒,分别转染EBV阴性胃癌细胞系SGC7901,同时设置空载对照。收集转染2h、6h、24h、48h、72h的实验组细胞,并提取各组细胞总蛋白,Western blot检测相关蛋白表达的变化。设计并合成靶向LMP1编码基因的siRNA及对照序列（NC）,转染EBV阳性胃癌细胞系GT38,作用48h收集细胞,提取细胞总蛋白和总RNA,Western blot和qRT-PCR检测IκBα的表达变化。10分别转染LMP1和LMP2A重组质粒至EBV阴性胃癌细胞系SGC7901,同时设置空载对照质粒,G418筛选实验及流式细胞仪分选后建立稳定表达LMP1和LMP2A的SGC7901细胞克隆以及载体对照细胞系,Western blot检测稳定表达外源性LMP1和LMP2A的细胞克隆NF-κB信号通路相关基因的表达。11设计并合成靶向TRAF1编码基因的siRNA转染EBV阳性胃癌细胞系GT39,检测下调TRAF1表达对NF-κB信号通路相关蛋白表达的影响。12采用qRT-PCR和免疫组织化学技术检测EBV阳性胃癌细胞系GT38、GT39及EBVaGC组织中miR-BART16与LMP1的相对表达水平。13在GT38和GT39细胞系中分别转染miR-BART16的模拟物、抑制物及对照序列,浓度分别为10nM,30nM和50nM,作用48 h收集细胞,提取各组细胞总RNA和总蛋白检测LMP1的表达。选取50nM浓度miR-BART16模拟物、抑制物及对照序列,分别转染GT38和GT39细胞,采用CCK-8检测转染24h,48h,72h的细胞增殖情况。14 miR-BART16模拟物与抑制物作用GT38、GT39细胞48 h,采用流式细胞技术检测对细胞凋亡的影响,同时采用PI及BrdU染色分析miR-BART16模拟物与抑制物作用后对细胞周期的影响。结果:1 EBV阳性胃癌细胞系NF-κB信号通路抑制因子NFKBIA的转录表达水平明显低于EBV阴性胃癌细胞系（P<0.005）,EBV阳性胃癌细胞系中TRAF1、TRAF3、TRAF6转录水平均高于EBV阴性胃癌细胞系,TRAF2转录水平明显低于阴性胃癌细胞系;EBV阳性胃癌细胞系中IκBα蛋白表达均较EBV阴性胃癌细胞系明显降低;而两种细胞系中磷酸化IκBα蛋白的表达则无明显差异;p65及p-p65蛋白表达亦无明显差异。EBV阳性胃癌细胞系中TRAF1蛋白表达明显高于EBV阴性胃癌细胞,而EBV阳性胃癌细胞系TRAF2、TRAF3和TRAF6蛋白的表达均低于EBV阴性胃癌细胞系。2 EBV阳性胃癌细胞系中p65蛋白的核内转位约占50%,而EBV阴性胃癌细胞系则较少检测到核内转位。EBV阳性胃癌细胞系GT38、GT39和SNU719的p65-DNA结合能力均高于EBV阴性胃癌细胞系。3 EBVaGC组织中IκBαmRNA的转录表达水平明显低于EBVnGC组织及癌旁组织,EBVaGC组织中IκBα蛋白表达较EBVnGC组织弱,而发生p65核转位的肿瘤细胞多于EBVnGC组织。4 EBV阳性胃癌细胞系SNU719对NF-κB信号通路抑制剂BAY11-7082作用的敏感性明显强于EBV阴性胃癌细胞系SGC7901。5与DMSO对照组比较,2.5μM BAY11-7082处理组SNU719细胞凋亡率无明显变化（P>0.5）,5μM和10μM处理组的细胞凋亡率明显升高,最高达51.5%,差异有显着性（P<0.001）。MG-132及BAY11-7082信号通路抑制剂作用后均能对凋亡相关蛋白的表达产生不同程度的影响。6 2.5μM浓度BAY11-7082作用细胞后ZEB1蛋白表达无明显变化（P>0.5）,5μM和10μM浓度作用后,ZEB1蛋白表达明显下调（P<0.01）。7 EBV阳性胃癌细胞系中NFKBIA基因启动子区甲基化率:GT38为0.80%,GT39为0.80%,SNU719为0.4%,均呈低甲基化状态。8 EBV阳性胃癌细胞系GT38、GT39和SNU719 NFKBIA基因第一外显子区均存在12bp的片段缺失（+615+626delCGCCCCCAGGAG）,造成4个氨基酸的丢失,而在EBV阴性胃癌细胞系未检测到该片段的缺失.9 EBV-miR-BART16不能直接影响带有h-NFKBIA-3’UTR的荧光素酶的表达,IκBα的表达不受miR-BART16的直接调控。10与载体对照组比较,转染LMP1重组表达质粒的SGC7901细胞IκBα各时间段均表达下调,72h表达量是对照组的40%,磷酸化p-IκBα表达上调,在7h表达水平最高（2.15倍）;p65总蛋白的表达较对照组降低,而磷酸化p-p65表达随作用时间上调。TRAF1表达上调,72h可达2.01倍,而TRAF2/3/6表达下调。干扰LMP1,其mRNA表达是对照组的26%,而IκBα的mRNA转录表达未见明显改变（P>0.05）,LMP1蛋白水平表达下调,IκBα蛋白表达水平则出现上调现象。11与空白对照比较,转染LMP2A重组表达质粒的SGC7901细胞IκBα各时间段均表达下调,48h下调最明显,表达量仅是对照组的29%,p-IκBα的表达上调,在72h达到最高（3.32倍）;p65总蛋白的表达较对照组降低,而p-p65表达随作用时间而上调。TRAF1表达上调,72h可达2.51倍,而TRAF2/3表达下调,TRAF6略有下调。12与空白对照比较,稳定转染LMP1/2A均能下调IκBα表达,表达量仅是对照组的67%和61%,p-IκBα的表达上调,为对照组的1.35倍和1.47倍,p65总蛋白和磷酸化蛋白的表达无明显差异,TRAF1分别上调2.15倍和1.46倍,而TRAF2/6表达下调,TRAF3表达无明显变化。13靶向TRAF1的siRNA作用EBV阳性胃癌细胞系GT39 48h和72h后,p65和IκBα总蛋白及磷酸化蛋白表达均未发生明显变化。14与GT38和GT39细胞系比较,EBVaGC组织中miRNA-BART16表达量明显高于2种EBV阳性胃癌细胞系,约为14-165倍。qRT-PCR及免疫组化技术在10例EBVaGC组织中均未检测到LMP1的表达。15与阴性对照组比较,GT38和GT39细胞系转染miR-BART16模拟物后,LMP1mRNA与蛋白表达水平均随转染浓度的增加而降低;而转染miRNA-BART16抑制物以后,LMP1 mRNA与蛋白表达水平均随转染浓度的增加而增加,呈明显的量效关系。16 miR-BART16转染GT38和GT39细胞48 h和72 h后,CCK-8检测显示其模拟物能够明显抑制细胞增殖（P<0.05）,而转染miR-BART16抑制物后,细胞增殖明显增强（P<0.05）。17在GT38和GT39细胞中转染miR-BART16模拟物及抑制物,细胞凋亡没有发生明显变化（P>0.05）;转染miR-BART16抑制物48h后,细胞周期阻滞在G2/M期,而转染模拟物后没有明显的变化。结论:1 EBV阳性胃癌的细胞系和EBVaGC组织均存在NF-κB经典信号通路的持续激活,LMP1和LMP2A的表达是该信号通路激活的重要原因。2 NF-κB信号通路的激活可促进上皮细胞间质转化相关分子及潜伏膜蛋白的表达,从而导致EBV阳性肿瘤细胞增殖,抑制其凋亡。3κBα基因第一外显子在EBV阳性胃癌细胞系存在一段12bp的缺失,造成4个氨基酸的丢失。4 EBVaGC中IκBα基因的低表达不受启动子区甲基化和miR-BART16的调控。5 miR-BART16能够在mRNA及蛋白水平下调LMP1的表达,抑制miR-BART16表达能够促进细胞增殖,诱导细胞G2/M期阻滞。
二、鼻咽癌及癌旁上皮细胞的AgNORs定量分析及其生物学意义（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、鼻咽癌及癌旁上皮细胞的AgNORs定量分析及其生物学意义（论文提纲范文）
（1）基于转录组测序分析的鼻咽癌相关EB病毒变异亚型及预后模型的研究（论文提纲范文）
| 英语缩略词 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 与鼻咽癌相关的EBV基因变异及其医学生物学功能 |
| 第一节 导论 |
| 1.EBV概述 |
| 1.1 EBV的基本生物学特征 |
| 1.2 EBV潜伏感染 |
| 1.3 EBV潜伏基因 |
| 2 鼻咽癌概述 |
| 3.鼻咽癌中EBV基因的变异 |
| 4.本项研究的目的和基本策略 |
| 第二节 结果 |
| 1.纳入转录组测序分析的鼻咽癌病例入组及其基本特征 |
| 2.入组样品的转录组测序分析 |
| 3.鼻咽癌组织中EBV基因变异的分析 |
| 3.1 鼻咽癌组织中EBER2和LMP2携带高频变异 |
| 3.2 EBER2变异与鼻咽癌 |
| 4.鼻咽癌中EBER2变异亚型及其临床意义 |
| 4.1 EBER2亚型与鼻咽癌患者临床特征的关系 |
| 4.2 EBER2亚型与鼻咽癌患者预后的关系 |
| 5.EBER变异在鼻咽癌独立样本中的实验验证 |
| 5.1 在EBV阳性细胞中验证EBER的变异 |
| 5.2 在鼻咽癌组织中验证EBER的变异 |
| 5.3 独立样本验证中EBER2亚型分布及与临床表型的关系 |
| 6.EBER2亚型对应宿主基因的表达分析 |
| 7.鼻咽癌组织中LMP2B的变异位点 |
| 8.LMP2B-C666和LMP2B-Raji在鼻咽癌细胞中的生物学功能 |
| 8.1 稳定表达外源性LMP2B-C666和LMP2B-Raji的鼻咽癌细胞的构建 |
| 8.2 LMP2B-C666和LMP2B-Raji对鼻咽癌细胞表型的影响 |
| 8.3 LMP2B-C666的蛋白稳定性 |
| 9.LMP2B变异与EBER2亚型的关联 |
| 第三节 讨论 |
| 1.临床相关研究的质量控制 |
| 2.以转录组测序数据分析EBV基因变异 |
| 3.EBER2的变异与鼻咽癌患者预后的关系 |
| 4.EBER变异的独立样本验证与细胞定位 |
| 5.LMP2B在鼻咽癌中的生物学功能 |
| 本章小结 |
| 第二章 鼻咽癌预后评估模型的建立 |
| 第一节 导论 |
| 1.鼻咽癌概述 |
| 2.与鼻咽癌预后相关的分子标志物 |
| 3.免疫微环境与鼻咽癌预后的关系 |
| 3.1 鼻咽癌与免疫治疗 |
| 3.2 浸润免疫细胞与鼻咽癌预后 |
| 4.本项研究的目的和基本策略 |
| 第二节 结果 |
| 1.鼻咽癌“复发转移组”和“非复发转移组”的特征性基因表达谱 |
| 1.1 入组的鼻咽癌病例及其临床信息 |
| 1.2 转录组测序数据的主成分分析(principal component analysis,PCA) |
| 1.3 机器学习方法筛选两组鼻咽癌病例肿瘤组织的特征基因 |
| 1.4 两组鼻咽癌患者肿瘤组织中的差异表达mRNA |
| 2.筛选出的13个特征基因与鼻咽癌预后的关系 |
| 2.1 13个特征基因与鼻咽癌患者无进展生存的关系 |
| 2.2 13个特征基因与鼻咽癌患者总生存的关系 |
| 3.鼻咽癌预后模型的建立 |
| 3.1 13个特征基因分别对于鼻咽癌预后的影响 |
| 3.2 多因素Cox比例风险回归模型 |
| 3.3 4-gene signature预后预测能力的评估 |
| 3.4 基于4-gene signature的风险评分与其预后能力的关联 |
| 3.5 基于4-gene signature的风险评分是否为预后的独立因素 |
| 4.4-gene signature的生物学功能 |
| 5.肿瘤免疫浸润和鼻咽癌预后的关系 |
| 5.1 本组鼻咽癌病例肿瘤组织中浸润免疫细胞与鼻咽癌预后的关系 |
| 5.2 GEO数据中浸润免疫细胞与鼻咽癌预后的关系 |
| 6.4-mRNA signature表达水平与肿瘤浸润免疫细胞的关系 |
| 第三节 讨论 |
| 1.筛选与鼻咽癌预后相关的基因 |
| 2.干扰素在鼻咽癌发生发展中的作用 |
| 3.鼻咽癌4-gene signature预后评估模型及其生物学功能 |
| 4.免疫微环境与鼻咽癌预后的关系 |
| 本章小结 |
| 第三章 材料与方法 |
| 第一节 研究对象和实验材料 |
| 1.鼻咽癌病例及其组织样品 |
| 2.细胞系 |
| 3.菌株和质粒载体 |
| 4.抗体 |
| 5.主要试剂与耗材 |
| 6.细胞培养的器皿 |
| 7.常用试剂的配制 |
| 8.主要仪器 |
| 9.主要分析软件及网站 |
| 第二节 实验方法 |
| 1.分子生物学实验方法 |
| 2.细胞生物学实验方法 |
| 3.生物学信息分析 |
| 4.统计学方法 |
| 参考文献 |
| 基金资助 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）过表达HOXC11通过调控PPAE-γ和NF-κB通路促进头颈部鳞癌增殖和侵袭的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 1.1 头颈部恶性肿瘤的临床治疗进展 |
| 1.1.1 头颈部恶性肿瘤的流行病学及病理学情况 |
| 1.1.2 头颈恶性肿瘤的诊断学上的研究进展 |
| 1.1.3 头颈部恶性肿瘤的临床治疗进展 |
| 1.1.4 头颈部恶性肿瘤发生的分子机制假说 |
| 1.2 HOXC基因家族在恶性肿瘤中的研究情况 |
| 1.2.1 HOX基因家族的结构及一般生物学功能 |
| 1.2.2 HOXC基因家族在恶性肿瘤中的研究进展 |
| 1.2.3 HOXC基因家族在头颈部恶性肿瘤中的研究进展 |
| 1.3 NF-κB信号通路在头颈部恶性肿瘤中的研究情况 |
| 1.3.1 NF-κB信号通路的组成和一般生物学功能 |
| 1.3.2 NF-κB信号通路在头颈部恶性肿瘤中的研究进展 |
| 1.4 PPAR-γ信号通路在头颈部恶性肿瘤中的研究情况 |
| 1.4.1 PPAR-γ信号通路的组成和一般生物学功能 |
| 1.4.2 PPAR-γ信号通路在头颈部恶性肿瘤中的研究进展 |
| 第二章 HOXC11在头颈部鳞癌的表达及其临床意义 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 HOXs家族成员在头颈部鳞癌中的mRNA表达 |
| 2.2.2 HOXC11的高表达与头颈部鳞癌患者差的生存预后相关 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 HOXC11对头颈鳞癌肿瘤细胞的特性的调控 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 稳定沉默HOXC11的头颈部鳞癌细胞模型构建 |
| 3.2.2 沉默HOXC11对头颈部鳞癌体外生物学特性的影响 |
| 3.2.3 沉默HOXC11对头颈部鳞癌体内生物学特性的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 头颈部鳞癌中HOXC11作用通路机制的初步探索 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 总结和展望 |
| 参考文献 |
| 附录1 中英文缩写对照 |
| 附录2 鼻咽拭子检测Septin9基因甲基化对鼻咽癌早期诊断的意义 |
| 1 研究背景与目的 |
| 2 研究的中文摘要 |
| 3 研究的英文摘要 |
| 4 正文 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间主要成果 |
| 致谢 |
（3）长链非编码RNA LINC00460/miR-503-5p轴影响宫颈癌增殖及凋亡的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分：LncRNA LINC00460在宫颈癌组织中的表达及临床意义 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 研究对象和材料 |
| 2.2.1 研究对象 |
| 2.2.2 RT-qPCR引物 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 数据库分析 |
| 2.3.2 临床资料收集及超声检查 |
| 2.3.3 RT-qPCR检测 |
| 2.4 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 数据库分析LINC00460在宫颈癌组织中异常表达 |
| 3.1.1 获取LINC00460在宫颈癌肿瘤组织与正常宫颈组织中的表达差异 |
| 3.1.2 分析宫颈癌临床分期与LINC00460表达的关系 |
| 3.1.3 分析LINC00460表达异常与宫颈癌患者生存的关系 |
| 3.2 RT-qPCR方法检测LINC00460在宫颈癌肿瘤组织中的表达情况 |
| 3.2.1 LINC00460的表达情况 |
| 3.2.2 比较LINC00460表达差异 |
| 3.3 LINC00460的表达水平差异与宫颈癌患者临床病理特征及超声检查结果的相关分析 |
| 3.3.1 LINC00460的表达水平与临床病理特征相关性 |
| 3.3.2 LINC00460的表达水平与超声检查结果的相关性 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分:LncRNA LINC00460对宫颈癌细胞增殖和凋亡的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 研究对象和材料 |
| 2.2.1 细胞株 |
| 2.2.2 LINC00460-shRNA质粒片段的构建 |
| 2.2.3 RT-qPCR引物 |
| 2.2.4 试剂的配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养及转染 |
| 2.3.2 MTT法检测细胞活力 |
| 2.3.3 流式细胞仪分析细胞周期分布 |
| 2.3.4 Western Blot检测 |
| 2.3.5 流式细胞仪检测细胞凋亡 |
| 2.3.6 Hoechst染色 |
| 2.4 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 RT-qPCR检测LINC00460在宫颈癌细胞中的表达 |
| 3.1.1 高表达LINC00460的宫颈癌细胞株筛选 |
| 3.1.2 稳转细胞株的筛选 |
| 3.2 沉默LINC00460对宫颈癌细胞的增殖能力的影响 |
| 3.2.1 MTT法检测细胞活力 |
| 3.2.2 流式细胞仪分析细胞周期分布 |
| 3.2.3 采用Western blot检测Ki67和cyclin D1的表达 |
| 3.3 沉默LINC00460对宫颈癌细胞凋亡的影响 |
| 3.3.1 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 3.3.2 Hoechst染色观察细胞凋亡 |
| 3.3.3 Western blot检测Cleaved-caspase-3和Cleaved-PARP的表达 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分：LINC00460/miR-503-3p轴促进宫颈癌进展的机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 研究对象和材料 |
| 2.2.1 细胞株 |
| 2.2.2 hsa-miR-503-5p inhibitor与hsa-miR-503-5p mimic片段的构建 |
| 2.2.3 RT-qPCR引物 |
| 2.2.4 实验动物 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 使用Star Base预测LINC00460与miRNA之间的结合 |
| 2.3.2 双荧光素酶报告基因实验 |
| 2.3.3 RT-qPCR检测 |
| 2.3.4 Western Blot检测 |
| 2.3.5 挽救试验 |
| 2.3.6 裸鼠成瘤实验 |
| 2.3.7 免疫组化检测瘤组织中Ki67表达情况 |
| 2.3.8 荧光TUNEL染色检测 |
| 2.3.9 Western Blot检测 |
| 2.4 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 LINC00460靶向miR-503-5p并调控其下游靶基因 |
| 3.1.1 使用Star Base预测LINC00460与miRNA之间的结合 |
| 3.1.2 使用双荧光素酶报告基因实验验证 |
| 3.1.3 通过RT-qPCR分析miR-503-5p表达水平 |
| 3.1.4 Western blot检测AKT2,HMGA2,SHOX2蛋白表达 |
| 3.2 挽救试验验证LINC00460通过海绵miR-503-5p调控宫颈癌细胞的增殖和凋亡 |
| 3.2.1 MTT法检测细胞活力 |
| 3.2.2 流式细胞术检测周期分布 |
| 3.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 3.2.4 Western Blot检测AKT2、HMGA2、SHOX2、cyclin D1、Cleaved-caspase-3的表达 |
| 3.3 LINC00460对宫颈癌细胞体内增殖及凋亡的影响 |
| 3.3.1 沉默LINC00460对裸鼠宫颈癌移植瘤的生长的影响 |
| 3.3.2 RT-qPCR结果 |
| 3.3.3 免疫组化检测Ki67的表达 |
| 3.3.4 采用TUNEL法检测肿瘤组织细胞凋亡 |
| 3.3.5 Western blot检测AKT2、HMGA2、SHOX2蛋白表达 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 长链非编码RNA LINC00460在恶性肿瘤中的表达及其作用机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）EBV相关性胃癌多维度表型特征识别及其关联蛋白GBP5的作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:EBV相关性胃癌多维度表型特征识别 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 EBV相关性胃癌差异表达基因分析 |
| 2.2 EBV相关性胃癌差异表达蛋白筛选分析 |
| 2.2.1 样品准备 |
| 2.2.2 胃癌组织EBV原位杂交检测 |
| 2.2.3 EBVaGC定量蛋白质组学检测 |
| 2.2.4 蛋白组学数据分析 |
| 2.2.5 免疫组化检测蛋白表达 |
| 2.3 EBV相关性胃癌临床病理参数分析 |
| 2.4 胃癌及癌前疾病血清EBV抗体表达分析 |
| 2.4.1 血清EBV抗体的筛选 |
| 2.4.2 胃癌及癌前疾病血清EBV-VCA IgG抗体表达分析 |
| 2.5 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 EBV相关性胃癌关联基因表达特征 |
| 3.2 EBV相关性胃癌关联蛋白表达特征 |
| 3.2.1 EBVaGC研究对象的确定 |
| 3.2.2 EBVaGC蛋白质谱特征 |
| 3.2.3 EBVaGC中转录组和蛋白组交集蛋白的筛选验证 |
| 3.3 EBV相关性胃癌临床病理特征 |
| 3.4 血清EBV抗体表达与胃癌风险/预后的相关性 |
| 3.4.1 研究对象的基本信息 |
| 3.4.2 血清EBV-VCA IgG抗体人群分布特征 |
| 3.4.3 血清EBV-VCA IgG与胃癌及萎缩性胃炎发病风险的关系 |
| 3.4.4 血清 EBV-VCA IgG与血清 HP-IgG的关系 |
| 3.4.5 血清EBV-VCA IgG与胃癌临床病理参数的关系 |
| 3.4.6 血清EBV-VCA IgG与胃癌预后的关系 |
| 4 讨论 |
| 4.1 EBVaGC关联基因表达特征及功能分析 |
| 4.2 EBVaGC关联蛋白表达特征及功能分析 |
| 4.3 EBVaGC临床病理特征 |
| 4.4 血清EBV-VCA IgG抗体与胃癌发病风险与预后的关系 |
| 4.4.1 血清EBV-VCA IgG抗体人群分布特征 |
| 4.4.2 血清EBV-VCA IgG与胃癌及萎缩性胃炎发病风险的关系 |
| 4.4.3 血清 EBV-VCA IgG与血清 HP-IgG的关系 |
| 4.4.4 血清EBV-VCA IgG与胃癌临床病理参数及预后的关系 |
| 5 结论 |
| 第二部分:EBV相关性胃癌关联蛋白GBP5的作用机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料和设备 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.2 GBP5原位表达与胃癌风险/病理参数/预后的相关性研究 |
| 2.2.1 免疫组化检测 |
| 2.3 GBP5对不同EBV感染状态胃癌细胞生物学行为的影响研究 |
| 2.3.1 质粒构建 |
| 2.3.2 摇菌和质粒提取 |
| 2.3.3 细胞培养 |
| 2.3.4 瞬时转染 |
| 2.3.5 细胞总RNA提取及反转录cDNA |
| 2.3.6 实时荧光定量PCR(Real-time PCR) |
| 2.3.7 细胞增殖活性检测 |
| 2.4 GBP5对不同EBV感染状态胃癌细胞免疫相关基因表达的影响研究 |
| 2.4.1 EBVaGC关联免疫相关基因的确定 |
| 2.4.2 EBVaGC与GBP5表达相关的免疫基因的确定 |
| 2.4.3 验证EBVaGC免疫相关基因差异表达 |
| 2.5 GBP5表达与EBVaGC调控网络的关联分析 |
| 2.5.1 EBVaGC中GBP5蛋白互作网络构建 |
| 2.5.2 EBVaGC中GBP5与互作蛋白的关联分析 |
| 2.5.3 EBVaGC中GBP5与互作蛋白的通路分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 GBP5原位表达与胃癌病理参数/预后的相关性 |
| 3.2 GBP5对不同EBV感染状态胃癌细胞生物学行为的影响 |
| 3.2.1 GBP5在胃癌细胞中的过表达和沉默效率 |
| 3.2.2 GBP5表达对EBVaGC细胞增殖活性的影响 |
| 3.3 GBP5影响不同EBV感染状态胃癌细胞免疫相关基因的表达 |
| 3.3.1 确定EBVaGC中差异表达免疫相关基因 |
| 3.3.2 EBVaGC中GBP5与免疫相关基因表达的相关性 |
| 3.3.3 EBVaGC中GBP5与免疫相关基因相关性验证 |
| 3.4 GBP5表达与EBVaGC调控网络的关联分析 |
| 3.4.1 EBVaGC中GBP5蛋白互作网络 |
| 3.4.2 EBVaGC中GBP5与互作蛋白的关联 |
| 3.4.3 EBVaGC中GBP5与互作蛋白的富集分析 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 EBV感染与肿瘤 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）PIK3CA基因在鼻咽癌发生发展及放疗抵抗中的作用机制研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 PIK3CA基因表达模式及其对鼻咽癌发生发展和细胞生物学行为的作用研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 质量控制 |
| 1.4 统计分析 |
| 1.5 技术路线图 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 miR-515-5p在 PIK3CA诱导的鼻咽癌细胞增殖、凋亡和放疗抵抗中作用研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 使用试剂与仪器 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 统计学分析 |
| 1.5 技术路线图 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 NPC细胞中PVT1/miR-515-5p-PIK3CA轴调控机制研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 试剂与仪器 |
| 1.3 研究方法 |
| 1.4 统计学处理 |
| 1.5 技术路线图 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 PIK3CA 基因与头颈部肿瘤发病相关性研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（6）miR-451靶向MIF调控宫颈癌细胞生物学功能并通过外泌体释放影响其化疗敏感性（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 常用缩写词中英文对照表 |
| 前言 |
| 第一部分 宫颈癌相关差异miRNA生物信息学研究 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 宫颈癌样本数据库的选择 |
| 1.2 差异表达分析 |
| 1.3 miRNA筛选 |
| 1.4 miRNA靶基因预测 |
| 1.5 ceRNA网络构建 |
| 1.6 GO功能注释 |
| 1.7 KEGG功能富集分析 |
| 1.8 PPI网络分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 基因差异表达分析 |
| 2.2 miRNA的筛选 |
| 2.3 hsa-miR-451miRNA靶基因预测 |
| 2.4 ceRNA网络构建 |
| 2.5 GO和KEGG功能富集结果分析 |
| 2.6 PPI网络分析 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二部分 miR-451通过靶向MIF参与调控宫颈癌细胞生物学功能 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 细胞株 |
| 1.2 主要试剂与仪器 |
| 1.3 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 miR-451在SiHa及CaSki细胞中的表达 |
| 2.2 CCK-8 法检测miR-451对细胞增殖的影响 |
| 2.3 流式细胞术检测miR-451对细胞凋亡的影响 |
| 2.4 流式细胞术检测miR-451对细胞周期的影响 |
| 2.5 细胞划痕实验检测miR-451对细胞迁移能力的影响 |
| 2.6 Transwell实验检测miR-451对细胞侵袭能力的影响 |
| 2.7 荧光素酶报告实验验证MIF是 miR-451的下游靶标 |
| 2.8 WesternBlot法检测miR-451靶向MIF对下游PI3K/AKT/mTOR信号通路的调节 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第三部分 miR-451通过外泌体释放的形式影响宫颈癌细胞对顺铂的敏感性 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 细胞株及细胞培养用品 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 HeLa及HeLa/DDP细胞形态学特征 |
| 2.2 CCK-8法检测细胞耐药指数 |
| 2.3 透射电镜下观察外泌体形态特征 |
| 2.4 外泌体粒径检测 |
| 2.5 流式细胞仪检测外泌体表面标记物 |
| 2.6 定量分析细胞及外泌体中miR-451表达 |
| 2.7 过表达或抑制miR-451后顺铂对细胞IC50 的变化 |
| 2.8 过表达或抑制miR-451后MDR1表达变化 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 创新性与不足 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（7）EGFL6在食管癌细胞发生发展中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 常用缩写词中英文对照表 |
| 前言 |
| 第一部分 EGFL6 在食管癌中的表达及其与临床病理的关系 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 临床标本 |
| 1.1.2 实验试剂 |
| 1.1.3 实验器材 |
| 1.1.4 抗体 |
| 1.1.5 试剂配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 免疫组化 |
| 1.2.2 免疫组化结果分析 |
| 1.2.3 临床病理资料统计及生物信息学分析 |
| 1.2.4 统计方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 EGFL6 蛋白在食管癌组织中的表达水平明显高于相应癌旁组织 |
| 2.2 食管癌患者组织中EGFL6 蛋白的表达水平与患者临床病理资料的关系 |
| 2.3 食管癌组织中EGFL6 的表达水平与预后的关系 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二部分 EGFL6 对食管癌生物学性状的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验细胞 |
| 1.1.2 菌株和质粒 |
| 1.1.3 小干扰RNA |
| 1.1.4 实验试剂 |
| 1.1.5 实验器材 |
| 1.1.6 实验用品 |
| 1.1.7 抗体 |
| 1.1.8 引物 |
| 1.1.9 试剂配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 细胞培养 |
| 1.2.2 细胞筛选 |
| 1.2.3 实验分组 |
| 1.2.4 质粒提取 |
| 1.2.5 细胞转染 |
| 1.2.6 总RNA的提取、反转录和Real-time PCR |
| 1.2.7 总蛋白的提取、蛋白浓度的测定及Western-blot实验 |
| 1.2.8 CCK-8 实验 |
| 1.2.9 平板克隆形成实验 |
| 1.2.10 细胞划痕实验 |
| 1.2.11 Transwell实验 |
| 1.2.12 流式细胞术检测细胞凋亡(Annexin V FITC-PI)实验 |
| 1.2.13 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 EGFL6 在不同食管癌细胞系中的表达情况 |
| 2.2 EGFL6 转染效率的检测 |
| 2.2.1 KYSE450 细胞进行EGFL6 小干扰RNA的转染 |
| 2.2.2 KYSE150 细胞进行过表达质粒的转染 |
| 2.3 CCK-8 实验结果 |
| 2.4 平板克隆形成实验结果 |
| 2.5 细胞划痕实验结果 |
| 2.5.1 EGFL6 基因沉默时对食管癌细胞迁移的影响 |
| 2.5.2 EGFL6 基因过表达时对食管癌细胞迁移的影响 |
| 2.6 Transwell侵袭迁移实验结果 |
| 2.6.1 EGFL6 基因沉默对食管癌细胞侵袭迁移的影响 |
| 2.6.2 EGFL6 基因过表达对食管癌细胞侵袭迁移的影响 |
| 2.7 EGFL6 表达对食管癌细胞凋亡的影响 |
| 2.7.1 流式细胞术检测细胞凋亡结果 |
| 2.7.2 EGFL6 沉默时凋亡相关标志物在基因和蛋白水平的表达情况 |
| 2.7.3 EGFL6 过表达时凋亡相关标志物在基因和蛋白水平的表达情况 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第三部分 EGFL6 通过 Wnt/β-catenin 信号通路促进 EMT 转变和维持食管癌干细胞特性 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 实验试剂 |
| 1.1.3 实验器材 |
| 1.1.4 实验用品 |
| 1.1.5 抗体 |
| 1.1.6 引物 |
| 1.1.7 试剂配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 细胞培养 |
| 1.2.2 细胞系的构建 |
| 1.2.3 Real-time PCR |
| 1.2.4 Western-blot |
| 1.2.5 裸鼠成瘤实验 |
| 1.2.6 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 EGFL6 能够促进食管癌细胞的EMT |
| 2.1.1 EGFL6 沉默时抑制食管癌细胞的EMT |
| 2.1.2 EGFL6 过表达时促进食管癌细胞的EMT |
| 2.2 EGFL6 参与维持食管癌干细胞样细胞群 |
| 2.3 EGFL6 通过Wnt/β-catenin信号通路调节EMT和维持癌症干细胞 |
| 2.4 EGFL6 敲低抑制裸鼠食管癌细胞移植瘤的生长 |
| 2.4.1 稳定的EGFL6 敲低的KYSE450 细胞株的鉴定 |
| 2.4.2 EGFL6 敲低抑制裸鼠食管癌移植瘤的生长 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（8）CircVAPA/miR-130a-5p调节轴对乳腺癌侵袭迁移的影响及紫草素干预作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 研究进展 |
| (一) 环状RNA在乳腺癌中的研究进展 |
| 1.1 环状RNA的发展历史和生物起源 |
| 1.2 环状RNA的生物学功能 |
| 1.3 环状RNA与乳腺癌 |
| 1.4 问题与展望 |
| 参考文献 |
| (二) 紫草素抗肿瘤作用的临床及机制研究进展 |
| 2.1 紫草素抗肿瘤作用的理论依据 |
| 2.2 紫草素抗肿瘤的研究进展 |
| 2.3 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 第二部分 CircVAPA在乳腺癌中的表达及临床意义 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 组织标本 |
| 2.2 细胞株 |
| 2.3 材料 |
| 2.4 实验方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 乳腺癌组织环状RNA-seq中差异表达的环状RNA |
| 3.2 环状RNA circVAPA在乳腺癌中的特性 |
| 3.3 环状RNA circVAPA对乳腺癌细胞侵袭和迁移能力的影响 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 紫草素在体内外对乳腺癌发生发展的抑制作用 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 细胞株和实验动物来源 |
| 2.2 材料 |
| 2.3 实验方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 紫草素对人乳腺癌细胞的体外实验研究 |
| 3.2 紫草素对人乳腺癌细胞的体内实验研究 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分 CircVAPA/miR-130a-5p调节轴促进乳腺癌侵袭转移及紫草素的干预作用 |
| 1.前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 组织标本 |
| 2.2 细胞株 |
| 2.3 材料 |
| 2.4 实验方法 |
| 3. 结果 |
| 3.1 乳腺癌组织miRNA-seq中差异表达的miRNA |
| 3.2 环状RNA circVAPA靶向吸附miR-130a-5p |
| 3.3 环状RNA circVAPA可竞争性结合miR-130a-5p抑制其功能 |
| 3.4 紫草素通过上调miR-130a-5p的表达恢复其对乳腺癌侵袭迁移的抑制功能 |
| 3.5 环状RNA circVAPA对其亲本基因的影响 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 参考文献 |
| 第五部分 研究结论 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间取得的学术成果 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（9）miR-106b-3p靶向ZNRF3调控食管鳞癌恶性生物学行为及分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一章 食管鳞癌组织中microRNAs差异表达谱的筛选及研究 |
| 1.1 差异表达谱的筛选 |
| 1.1.1 材料 |
| 1.1.2 方法 |
| 1.1.3 结果 |
| 1.1.4 讨论 |
| 1.1.5 结论 |
| 1.2 食管鳞癌组织miR-106b-3p的研究 |
| 1.2.1 材料 |
| 1.2.2 方法 |
| 1.2.3 结果 |
| 1.2.4 讨论 |
| 1.2.5 结论 |
| 参考文献 |
| 第二章 miR-106b-3p对食管鳞癌细胞生物学功能的影响 |
| 2.1 对体外细胞生物学功能的影响 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.1.3 结果 |
| 2.1.4 讨论 |
| 2.1.5 结论 |
| 2.2 对裸鼠移植瘤的影响 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 方法 |
| 2.2.3 结果 |
| 2.2.4 讨论 |
| 2.2.5 结论 |
| 参考文献 |
| 第三章 miR-106b-3p调控食管鳞癌分子机制研究 |
| 3.1 miR-106b-3p的靶基因验证及二者关系 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.1.3 结果 |
| 3.1.4 讨论 |
| 3.1.5 结论 |
| 3.2 miR-106b-3p对 Wnt/β-catenin信号通路的影响 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 方法 |
| 3.2.3 结果 |
| 3.2.4 讨论 |
| 3.2.5 结论 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 综述:食管癌相关研究进展 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 攻读学位期间公开发表的文章 |
| 致谢 |
（10）EBV相关胃癌中NF-κB经典信号通路持续激活的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一部分 NF-κB经典信号通路在EBV相关胃癌中持续激活的机制研究 |
| 材料与方法 |
| 1 仪器、试剂和耗材 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂和耗材 |
| 1.3 常用试剂配制 |
| 2 胃癌细胞系及组织标本的选择 |
| 2.1 细胞系选择 |
| 2.2 胃癌组织标本选择 |
| 3 细胞处理 |
| 3.1 实验前准备 |
| 3.2 细胞复苏 |
| 3.3 培养液的更换 |
| 3.4 细胞传代 |
| 4 NFKBIA基因启动子区甲基化状态检测 |
| 4.1 细胞系DNA的提取 |
| 4.2 DNA样本焦亚硫酸盐修饰 |
| 4.3 亚硫酸盐基因组测序 |
| 5 NFKBIA及相关基因mRNA检测 |
| 5.1 细胞系RNA提取 |
| 5.2 新鲜组织标本RNA的提取 |
| 5.3 cDNA的合成 |
| 5.4 实时荧光定量PCR |
| 5.5 qRT-PCR结果数据分析 |
| 6 IκBα及相关蛋白检测 |
| 6.1 细胞系总蛋白的提取及浓度测量 |
| 6.2 Western blot检测细胞系蛋白表达情况 |
| 6.3 免疫荧光技术检测胃癌细胞系中蛋白亚定位 |
| 6.4 石蜡切片免疫组织化学染色(SP法)检测胃癌组织中蛋白的表达 |
| 6.5 免疫组织化学染色结果分析 |
| 6.6 通路抑制剂作用后检测蛋白表达及核定位变化 |
| 7 细胞增殖能力检测(CCK8 试剂盒) |
| 8 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 9 LMP1和LMP2A过表达细胞系的建立 |
| 9.1 载体构建 |
| 9.2 菌液培养 |
| 9.3 质粒提取 |
| 9.4 重组质粒pcDNA3.1-LMP1和pcDNA3.1-LMP2A 转染胃癌细胞系SGC7901细胞 |
| 10 siRNA及 miRNA转染 |
| 11 双荧光素酶报告基因检测 |
| 11.1 h-NFKBIA载体构建 |
| 11.2 细胞转染操作步骤 |
| 11.3 检测实验操作步骤 |
| 12 细胞核蛋白与浆蛋白提取 |
| 13 NF-κB p65 转录因子试剂盒p65-DNA结合能力检测 |
| 14 EBV-DNA拷贝数相对及绝对定量 |
| 14.1 EBV DNA相对拷贝数检测 |
| 14.2 EBV DNA绝对拷贝数检测 |
| 15 统计学和图像分析 |
| 结果 |
| 1 qRT-PCR检测胃癌细胞系中NF-κB经典信号通路相关基因的转录表达 |
| 2 胃癌细胞系中NFKBIA(IκBα)及相关基因的蛋白表达 |
| 3 胃癌细胞系TRAF1/2/3/6 蛋白表达 |
| 4 NFKBIA甲基化状态检测结果 |
| 5 p65 蛋白在胃癌细胞系中的亚定位 |
| 6 ELISA检测胃癌细胞系NF-κB转录因子活性 |
| 7 IκBα及相关基因在胃癌组织中的表达 |
| 8 NF-κB经典信号通路对EBV阳性胃癌细胞增殖、凋亡的影响 |
| 8.1 抑制NF-κB信号通路对胃癌细胞增殖的影响 |
| 8.2 抑制NF-κB信号通路对EBVaGC凋亡的影响 |
| 9 抑制NF-κB信号通路对ZEB1 表达的影响 |
| 9.1 EBV阳性和阴性胃癌细胞系细胞系ZEB1的表达 |
| 9.2 BAY11-7082对ZEB1 表达的影响 |
| 10 抑制NF-κB信号通路对EBVaGC潜伏膜蛋白LMP1、LMP2A的影响 |
| 11 胃癌细胞系NFKBIA基因变异检测 |
| 12 EBV编码的miRNA-BART16对IκBα表达的影响 |
| 13 LMP1对NF-κB信号通路的调控作用 |
| 14 LMP2A对 NF-κB信号通路的调控作用 |
| 15 稳定转染LMP1及LMP2A对 NF-κB信号通路的调控作用 |
| 16 干扰TRAF1对NF-κB信号通路的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 EBV编码miR-BART16 通过靶定LMP1调节肿瘤细胞增殖 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1 仪器、试剂和耗材 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂和耗材 |
| 1.3 常用试剂配制 |
| 2 细胞培养 |
| 3 RNA的提取 |
| 4 miRNA的实时荧光定量检测 |
| 5 细胞增殖能力检测 |
| 6 细胞周期检测 |
| 6.1 碘化丙啶染色分析 |
| 6.2 溴脱氧尿苷(BrdU)细胞周期检测 |
| 7 统计学分析 |
| 结果 |
| 1 EBVaGC细胞系及胃癌组织中miRNA-BART16与LMP1 的相对表达量 |
| 2 miRNA-BART16 能够调控LMP1 的表达 |
| 3 miR-BART16 对细胞增殖的影响 |
| 4 miRNA-BART16 对细胞凋亡的影响 |
| 5 miR-BART16 对细胞周期的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的学术成果 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
四、鼻咽癌及癌旁上皮细胞的AgNORs定量分析及其生物学意义（论文参考文献）
- [1]基于转录组测序分析的鼻咽癌相关EB病毒变异亚型及预后模型的研究[D]. 赵爽. 北京协和医学院, 2021
- [2]过表达HOXC11通过调控PPAE-γ和NF-κB通路促进头颈部鳞癌增殖和侵袭的研究[D]. 吕洁瑜. 南方医科大学, 2021(02)
- [3]长链非编码RNA LINC00460/miR-503-5p轴影响宫颈癌增殖及凋亡的实验研究[D]. 林琳. 中国医科大学, 2021(02)
- [4]EBV相关性胃癌多维度表型特征识别及其关联蛋白GBP5的作用机制研究[D]. 王泽洋. 中国医科大学, 2021(02)
- [5]PIK3CA基因在鼻咽癌发生发展及放疗抵抗中的作用机制研究[D]. 韩艳艳. 新疆医科大学, 2020(03)
- [6]miR-451靶向MIF调控宫颈癌细胞生物学功能并通过外泌体释放影响其化疗敏感性[D]. 白桦. 山西医科大学, 2020(11)
- [7]EGFL6在食管癌细胞发生发展中的作用及机制研究[D]. 亢晶. 山西医科大学, 2020(12)
- [8]CircVAPA/miR-130a-5p调节轴对乳腺癌侵袭迁移的影响及紫草素干预作用的研究[D]. 周思颖. 南京中医药大学, 2020(08)
- [9]miR-106b-3p靶向ZNRF3调控食管鳞癌恶性生物学行为及分子机制研究[D]. 乔冠恩. 苏州大学, 2019(06)
- [10]EBV相关胃癌中NF-κB经典信号通路持续激活的机制研究[D]. 张岩. 青岛大学, 2019(07)