一、人白介素-6表达质粒的构建及在酿酒酵母中的表达（论文文献综述）
郭丹[1]（2020）在《人生长激素在毕赤酵母中的分泌表达》文中研究说明重组人生长激素（rhGH）是人类生长发育所必须的,对人体的生长发育非常重要,所以在临床上的需求量很大。因此,有必要开发出一种高效的发酵工艺来生产出高纯度的rhGH。为了能够实现在毕赤酵母中高表达rhGH的要求,本文根据人生长激素的氨基酸序列和酵母菌密码子的偏好性,对人生长激素基因的密码子进行全局优化,屏蔽所有的稀有密码子,在其上游添加了启动子和信号肽序列,拟合成序列全长1040 bp,共设计并利用化学方法合成了30条单链寡核苷酸。通过改进的两步法进行生物拼接成全基因,再克隆到pUC18载体中,经过篮白筛选,挑取阳性克隆测序,得到2个全正确的克隆。通过聚合酶链式反应技术来扩增得到了生长激素基因,然后将扩增得到的生长激素基因插入到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,该载体拥有AOX1启动子和α分泌信号肽序列,构建出pPIC9K/hGH重组酵母表达载体,然后再利用电击转化毕赤酵母GS115,利用G418筛选菌株,得到整合多拷贝人生长激素基因,该基因株通过进一步的摇瓶培养生长,再通过甲醇的诱导,成功实现了生长激素在毕赤酵母中的分泌表达。然后使用SDS-PAGE技术进行活性分析。经聚合酶链式反应技术扩增酵母基因组DNA的结果显示,目的基因已被成功的整合到了毕赤酵母的染色体当中。筛选出的菌株用甲醇来诱导表达重组目的蛋白,使用SDS-PAGE和Western Blotting技术对表达的产物进行鉴定,在22kD附近存在一条很明显的带,并且颜色随诱导时间的增加而越来越深。而对照组没有出现条带,Western blotting鉴定的结果表明该重组蛋白为重组人生长激素。利用Folin-酚法测定标准浓度的酪蛋白,测得上清中的总蛋白含量是1.21mg/ml。用ELISA法测定样品的hGH的OD490值为0.217,通过标准曲线的公式计算得出,上清中的hGH的含量是330μg/ml。由此计算得出hGH占上清总蛋白的27.2%。将3K超滤后的样品进行第一步层析时,选用Q-sepharose FF为层析介质,10mM PB,pH7.5为上样缓冲液,采用10%Solution B阶段洗脱目的蛋白;在第二步层析时,选用phenyl-sepharose FF为层析介质,10mM PB+1M（NH4）2SO4,pH7.5为上样缓冲液,并用10mM PB,pH7.5作为洗脱缓冲液,经过两步层析后rhGH的纯度达到98%以上。经过基质辅助的激光解吸电离飞行时间质谱法（MALDI TOF MS）测定,重组hGH的相对分子质量为22 113 Da,N-端氨基酸测序显示rhGH的N-端的7个氨基酸为PTIPLSR。重组hGH的生物学活性利用去脑垂体大鼠体重法测定,实验可靠性测验符合标准,同批rhGH样品的PT为4.29 IU/1.33 mg,代表试验误差的可信限率（FL）26.6%,比活为3.2 IU/mg。此外还优化了rhGH的发酵工艺,能够使rhGH蛋白质的表达水平得到很大的提高。总之,本实验为生产高纯度人生长激素rhGH提供了有效的发酵工艺,可以降低大规模生产人生长激素的生产成本,建立了能够高效表达人生长激素的毕赤酵母表达系统,为重组人生长激素的工业化大规模生产打下了坚实的基础。
梁涛[2]（2020）在《人源多肽：N-乙酰氨基半乳糖基转移酶ppGalNAc-Ts的原核表达及体外合成O-糖基化修饰的白介素-2》文中研究指明O-GalNAc糖基化修饰是一种重要的蛋白质翻译后修饰形式,不仅在蛋白质加工、细胞增殖分化、免疫炎症等过程中具有重要功能,还在重组蛋白类药物修饰中具有重要意义,如缺乏糖基化修饰会缩短重组蛋白药物的体内半衰期或降低药效。多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶（polypeptide N-acetylgalactosaminyl transferase,ppGalNAc-T,EC:2.4.1.41）是催化蛋白质O-GalNAc糖基化修饰的起始糖基转移酶,是调控人体蛋白质发生O-糖基化修饰及其糖蛋白生物功能的关键酶。体外高产量获得人源ppGalNAc-T酶对于重组治疗性O-糖蛋白药物的合成,疫苗生产及工具酶的开发都具有重要意义。由于ppGalNAc-T从进化上只存在于真核后生动物中,在细菌和酵母中不存在可以取代的同功酶。长期以来人们只能通过化学合成多肽的方式来取得O-GalNAc修饰糖肽,但对于大分子蛋白药物的O-糖链合成仍存在局限。利用昆虫细胞或人源HEK 293T细胞表达ppGalNAc-T酶存在表达量低、培养成本高等问题,无法适应日益增长的多肽蛋白类药物生产的需求。而过往在利用原核系统表达人源ppGalNAc-T酶时存在需要多个分子伴侣共表达帮助该酶折叠而导致表达效率低等问题。因此,本研究我们开发了一种可以获得产量达12 mg/L以上并具有稳定酶活的ppGalNAc-T酶的大肠杆菌表达系统。本研究使用了Rosetta-gamiTM2（DE3）pLysS作为表达菌株,通过在该菌株胞内共表达人源蛋白质二硫键异构酶（Protein disulfide-isomerase,PDI,EC:5.3.4.1）,成功从大肠杆菌中表达纯化了高酶活的ppGalNAc-T酶。本论文主要内容和研究结果如下:（1）建立了一种操作简便、表达量高以及酶活强的大肠杆菌表达ppGalNAc-T酶的方法。研究发现在Rosetta-gamiTM2（DE3）pLysS菌株胞内共表达人源重组PDI和ppGalNAc-T酶,可以帮助ppGalNAc-T酶二硫键形成并且正确折叠。以ppGalNAc-T2酶为例,经过表达条件优化后可以从1 L培养基中获得超过12 mg的有活性的ppGalNAc-T2酶。（2）利用基于HPLC的酶动力学实验、圆二色谱实验等实验,我们系统性比较了E.coli和HEK 293T细胞表达系统生产的ppGalNAc-T2酶之间的差异。发现E.coli-T2和293T-T2针对受体底物EA2多肽和供体底物UDP-GalNAc具有相似的Vmax,但是E.coli-T2相比293T-T2对EA2和UDP-GalNAc的亲和力更强。圆二色谱结果表明,E.coli-T2具有和293T-T2相似的热稳定性,但是二者的α螺旋结构存在轻微差异。（3）利用体外酶法合成及点突变技术,我们证实大肠杆菌表达的ppGalNAc-T2酶可以选择性的在白介素-2（Interleukin-2,IL-2）蛋白T23位点上进行O-GalNAc糖基化修饰。该结果一方面验证了大肠杆菌表达的ppGalNAc-T酶的活性,同时为理解ppGalNAc-T酶精密调控底物蛋白糖基化的机制提供实例。综上所述,本研究中我们通过PDI共表达等方法构建了一种新型的ppGalNAc-T酶的大肠杆菌表达系统,该系统操作简便,可以生产大量有活性的ppGalNAc-T酶。以IL-2为例,我们证实这种大肠杆菌表达的ppGalNAc-T酶能够用于体外催化蛋白上O-GalNAc糖链合成。本研究为体外合成均一化的O-糖蛋白药物提供了新的技术支持,同时相似的策略可以用来尝试表达其他的糖基转移酶。
连昭[3]（2015）在《乳酸克鲁维酵母表达异源木聚糖酶B工程菌改造及蛋白分泌机制研究》文中进行了进一步梳理乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）作为一种优秀的外源蛋白表达宿主菌,它在食品工业和制药工业里蛋白产物的大规模生产中有着重要的应用。实验室前期研究中,构建了海栖热袍菌耐热木聚糖酶工程菌K. lactis GKX31。当目的蛋白表达量提高时,细胞壁合成相关基因KIGAS1-1、分子伴侣蛋白基因KIER01和KIKAR2以及UPR反应相关基因KIGCN4的转录水平发生显着变化。在本研究中分别采用基因敲除和基因过表达的策略探讨宿主菌改变对异源蛋白合成、修饰及分泌过程产生的影响。通过氨基酸序列分析和三维结构预测表明,乳酸克鲁维酵母中的KIGAS1-1基因和KIGAS1-2基因产物与酿酒酵母中细胞壁合成相关的β-1,3-葡聚糖基转移酶基因GAS1的基因产物的相似性分别为67%和64%,它们都具有一个葡聚糖基转移酶结构域Glycohydro72以及一个与糖类结合功能相关的X8结构域。预测两基因编码的产物具有β-1,3-葡聚糖基转移酶功能,并在乳酸克鲁维酵母细胞壁合成中发挥作用。利用同源双交换的方法,成功构建了KIGAS1-1敲除突变株K. lactis Kl-1、KlGAS1-2敲除突变株K. lactis K1-2以及双敲除突变株K. lactis KD。KIGAS1-1、KIGAS1-2两基因的敲除不会影响细胞的生长和细胞形态,而双敲除会使菌株生长滞后并且细胞变为球形出现异常膨大现象。通过透射电子显微镜观察发现,敲除KIGAS1-1会使细胞壁厚度减小,而敲除KIGAS1-2产生了相反的表型变化使细胞壁厚度增大。荧光定量PCR技术分析,发现KIGAS1-1、KIGAS1-2和KIGAS3是乳酸克鲁维酵母在营养生长过程中主要表达的KIGAS家族基因。KIGAS1-1、KIGAS1-2以及其他KIGAS家族基因在转录水平上存在互补作用。KIGAS家族基因的整体表达水平决定了各菌株细胞在形态、生长和细胞壁厚度上的差异。KIGAS1-1和KIGAS1-2基因的敲除能够影响乳酸克鲁维酵母外源蛋白分泌。KIGAS1-1基因单敲除和两基因双敲除能够提高外源蛋白分泌量（分别提高17.7%和11.5%）,而KIGAS1-2基因单敲除则会降低外源蛋白分泌量（降低35.6%）。KIGAS1-1和KIGAS1-2基因的敲除能够改变菌株中多个与蛋白分泌和运输过程相关基因的转录水平。各菌株中外源蛋白分泌效率的差异与菌株内蛋白分泌和运输过程相关基因的转录水平变化之间存在相关性。推测转录水平提高的蛋白分泌和运输过程相关基因能够促进外源蛋白的分泌。综合考虑,K1-1是一种较好的外源蛋白“超分泌”型菌株,敲除KIGAS1-1基因是一种更有效的通过改造细胞壁提高外源蛋白分泌水平的方案。使用‘’DNA Multimer直接转化法”构建了过表达载体pRS426-Gk,进而分别构建了KlERO1, KIKAR2和KIGCN4过表达菌株K. lactis GKERO、K. lactis GKKAR和K. lactis GKGCN。通过比较细胞生长和耐热木聚糖酶B产量等方面的差异,发现KIERO1、KlKAR2及KIGCN4的过表达都会使菌株细胞的生长滞后,KIERO1和K1KAR2的过表达能够促进外源蛋白的分泌（分别提高33.6%和14.1%）,而KIGCN4的过表达则不能促进外源蛋白的分泌。发现在外源蛋白分泌水平相对较低的菌株中KICOG6、KlIMH1、KICUP5的表达量相对较高。推测分泌蛋白向液泡的运输及降解是制约外源蛋白产量提高的瓶颈因素,为进一步对乳酸克鲁维酵母工程菌进行改造提高外源蛋白分泌提供了实验依据。
刘悦[4]（2014）在《米黑霉脂肪酶在毕赤酵母中的表达及分子改造》文中进行了进一步梳理脂肪酶是重要的工业酶制剂,在食品、制药、洗涤、合成等领域应用广泛。米黑根毛霉脂肪酶（RML:Rhizomucor miehei lipase）已经在结构分析、催化反应、工业应用等多方面得到研究。研究者在上游通过定向进化、蛋白结构分析,在下游通过发酵条件和反应条件的优化提高RML在工业催化反应中的酶活。天然的RML包括信号肽（24个氨基酸）、前导肽（70个氨基酸）,以及成熟蛋白区（269个氨基酸）。成熟蛋白的理论相对分子质量为30KDaa左右。本课题的研究对象仅包括前导肽和成熟区。研究表明很多蛋白酶在真核生物中表达时,一些特异性的位点会被糖基化,这些长短不一的糖链会影响蛋白酶的结构和活性,影响大小与糖基化的位点和糖基化程度有关。本研究将野生型RML在毕赤酵母（Pichia pastoris GS115）中表达,其活性为1700U/mg蛋白,是该酶在大肠杆菌中表达的6.7倍。通过Glycomod （http://web.expasy.org/glycomod/）查询发现RML前导肽处有两个糖基化位点（第8位和第58位天冬酰胺）,为了探索RML在毕赤酵母中表达时前导肽处的糖链对酶结构的影响,设计了三个去除糖基化的突变株（M1, N8A;M2, N58A和M3, N8A和N58A）,结果证明去掉糖基化之后RML的比活是野生型的2倍,然而去掉RML前导肽位置处的糖基化却不利于前导肽被Kex2蛋白酶切除形成成熟的蛋白,而且发现糖基化有助于RML分泌到胞外。其次,将RML野生型（WT:Wild Type）和在大肠杆菌中定向进化产生的4株酶活依次提高的突变株（G1:L57V, G2:L57V/V67A/I111T,G3:L57V/V67A/I111T/S168P, G4: L57V/V67A/I111T/S168P/S65A）基因克隆至pPIC9K中,分别构建了质粒pPIC9K-WT、 pPIC9K-G1、pPIC9K-G2、pPIC9K-G3、pPIC9K-G4,经SalI线性化后转入甲醇诱导型毕赤酵母中进行分泌表达。与大肠杆菌宿主不同,RML的4个突变株在毕赤酵母中表达时,酶活性没有呈现依次提高的趋势。研究表明RML在大肠杆菌中定向进化的突变株不适合在真核生物中表达,这可能是因为原核生物和真核生物具有不同的蛋白翻译、修饰、折叠体系,因此原核生物定向进化的规律不适用于真核生物。然后,为了在酵母中进行RML的定向进化,首先利用a-factor和INU信号肽构建了四个菌株（a-factor+WT+pESC-URA+BY4741、NU+WT+pESC-URA+BY4741、 a-factor+WT+pESC-URA+EBY100、INU+WT+pESC-URA+EBY100）实现了RML在酿酒酵母中的分泌表达。但是由于在酿酒酵母中蛋白表达量和酶活力都比较低,因此以毕赤酵母为宿主,对野生型RML进行定向进化,并采用罗丹明平板法进行高通量筛选,筛选到两个突变株8-4和8-15-1,其突变位点分别为R41C、A115V/D313E,均使酶活提高了25%左右。最后,为了提高RML的发酵产量,本课题使用无机盐培养基采用5L发酵罐对RML进行表达。RML的生产过程分三个阶段：第一阶段,前40h菌体生长阶段,40h之后,发酵罐内甘油消耗完全,OD600达100；第二阶段,40-72h是甘油流加阶段,进一步提高菌体量,并为下一步诱导做准备,此阶段结束时OD600达320;第三阶段,蛋白诱导阶段,72h后菌体不再生长,达到稳定期,开始进行甲醇流加诱导蛋白产生,开始诱导时甲醇流加速度为1mL/min,流加10min,2-4h之后根据需要提高甲醇流加速度。132h之后测得菌OD600为300,蛋白浓度为0.375mg/mL,其活性达至233U/mL。本研究从上游分子改造到下游RML的发酵生产做了一系列的研究,为RML走向工业化生产奠定了坚实的基础。
吴敏[5]（2013）在《人血清白蛋白融合技术平台的共性与个性问题研究》文中进行了进一步梳理1、长效HSA/GH融合蛋白的优化设计目前临床使用的部分蛋白/多肽类药物由于分子量较小,在人体内的半衰期短,须频繁注射以维持药效,从而限制了其临床应用,如本文研究的人生长激素（human growth hormone, hGH）、人甲状旁腺激素PTH （1-34）（human parathyroid hormone1-34）。人血清白蛋白（HSA）融合技术是延长蛋白/多肽类药物半衰期的一种简便、灵活的技术,也是目前国内外生物制药研究的热点。在利用HSA融合目的蛋白实现长效的技术研究中,仍有一些基础问题需要解决。如目前所有报道的HSA融合蛋白的体外生物学活性均有不同程度的降低,说明了HSA对所融合的蛋白/多肽的活性位点的干扰。另外,有报道指出,HSA也有可能会影响所融合蛋白的正确折叠或者糖基化位点的暴露程度,导致重组表达的融合蛋白产物不均一。因此,在HSA融合蛋白的开发中有必要考察不同融合方向,连接肽的有无和长短对融合蛋白活性、稳定性的影响,综合考虑各种因素,从而选择一种最优选的融合方式。本文着重研究了连接肽的引入和长短对HSA/GH融合蛋白的体外生物学活性和稳定性影响,为HSA/GH融合蛋白的开发提供了一种优选设计,同时也为其他HSA融合蛋白的设计提供了参考。2、 HSA/GH融合蛋白免疫检测方法的建立目前市场上只有检测GH或者HSA的ELISA试剂盒,没有专门针对HSA/GH融合蛋白的ELISA试剂盒。而在药代动力学研究中,要检测到完整的HSA/GH分子才能准确反映HSA/GH在体内的代谢动力学过程。本文建立了一种能够检测HSA/GH融合蛋白完整分子的双抗夹心ELISA,其检测范围在2.156～69ng/ml,初步应用于大鼠体内的药代动力学研究,为HSA/GH融合蛋白进一步的临床前开发奠定了基础。3、HSA融合蛋白的高效毕赤酵母表达系统的建立酵母表达系统兼具了原核表达系统表达周期短、表达量较高、易于工业化高密度培养的优点以及真核表达系统对外源蛋白进行糖基化、磷酸化等翻译后修饰的特点,被公认为是一种表达大规模蛋白的强有力工具。研究也表明,酵母表达系统是目前用于HSA重组表达最高效、最经济的一种表达系统,利用毕赤酵母表达一系列HSA融合蛋白具有潜在优势,因此本课题组将毕赤酵母作为首选表达系统,应用于一系列HSA融合蛋白的研究。但在表达一系列HSA融合蛋白时发现,未经优化的毕赤酵母表达系统主要存在两大缺陷,影响了HSA融合蛋白的高效重组表达,严重制约了HSA融合蛋白的临床前研究进程：1)分泌表达过程中的降解问题；2)分泌表达效率普遍较低,使得发酵表达量的提升也非常有限。因此有必要对毕赤酵母表达系统进行优化,实现HSA融合蛋白的高效表达。3.1构建蛋白酶缺陷型宿主改善HSA融合蛋白的降解一系列HSA融合蛋白在毕赤酵母中表达时都存在不同程度的降解,若与HSA进行融合的蛋白/多肽对蛋白酶敏感,重组表达时的降解问题会更严重,更复杂。由于降解条带一般与完整的HSA融合蛋白性质相近,影响了后续重组蛋白的纯化制备。本文以其中一个典型的易降解蛋白——人血清白蛋白-人甲状旁腺激素（1-34）融合蛋白[HSA/PTH （1-34）]为研究对象,首先通过Western Blot、N端氨基酸测序以及质谱分析证明了表达产物中完整蛋白的存在,并对降解产物进行了表征。文献报道指出,PTH易被酵母中的一类yapsin蛋白酶降解,并且液泡蛋白酶也是导致外源蛋白在毕赤酵母中重组表达时发生降解的主要原因。毕赤酵母中的液泡蛋白酶已经研究的比较清晰,并且已经有敲除主要液泡蛋白酶的商品化蛋白酶缺陷型宿主（SMD1168宿主为proteinase A缺陷型,SMD1163为proteinase A和proteinase B双重缺陷型）。根据毕赤酵母基因组测序结果,毕赤酵母中的yapsin家族共存在7个成员（YPS1, YPS2, YPS3, YPS7, MKC7, YPS’, YPS"）,但针对这7个yapsin成员的研究目前相对较少。本文利用同源重组的方法,构建了7个单一YPS敲除的毕赤酵母宿主。通过分析7种单一YPS缺陷宿主和proteinase A, proteinase B缺陷宿主对HSA/PTH （1-34）融合蛋白降解的影响,发现YPS1敲除和proteinase A敲除都有助于改善HSA/PTH （1-34）融合蛋白的降解。通过将YPS1和proteinase A同时敲除,降解得到最大程度的改善,与野生型GS115相比,完整蛋白的产率从30%提高到了80%。3.2多拷贝HSA融合基因整合与分子伴侣共表达相结合,提高HSA融合蛋白的表达量在本课题的前期研究中,以pPIC9为表达载体,在野生型或者蛋白酶缺陷型毕赤酵母宿主中实现了多种HSA融合蛋白的分泌表达,包括：HSA/GH. HSA/PTH （1-34）、 HSA/IL1Ra、 HSA/Thymosin al等等。但同时也发现,这些表达菌株的表达水平普遍较低（25-50mg/L）,通过发酵条件优化对表达量的提升也较为有限。这一方面极大的限制了后期纯化蛋白的制备量与制备速度,制约了HSA融合蛋白的临床前研究进程；另一方面也增加了HSA融合蛋白前期开发投入以及后续产业化生产的成本。因此,构建HSA融合蛋白的高表达工程菌株显得尤为重要。本文考察了HSA融合基因拷贝数以及几种重要的分子伴侣共表达对HSA融合蛋白表达量的影响。结果表明,通过两种方式的结合可以使HSA融合蛋白在野生型毕赤酵母中的表达量大幅度提高,如HSA-G,-GH经过优化后的表达量在摇瓶水平从低于50mg/L提高到了364mg/L。该方法也可用于蛋白酶缺陷型宿主,如优化后的HSA/PTH （1-34）在GS115pep4△ypsl△中的表达量也有了显着提高,为一系列HSA融合蛋白的高表达工程菌株的构建奠定了基础。
赵鹤云[6]（2012）在《解脂耶氏酵母脂肪酶家族的研究及新型表达系统的构建》文中指出解脂耶氏酵母是一种非常规酵母,被认为是GRAS （generally regarded as safe）,其自身能利用众多廉价底物而分泌多种具有工业应用价值的代谢物,故从二十世纪六十年代后期就开始广泛应用于多种不同的工业领域。其蛋白表达系统具有以下优势：外源基因易于整合到酵母基因组、外源蛋白表达量高、所表达的蛋白质能进行翻译后加工、重组菌可进行高密度发酵,以及所表达蛋白质的低糖基化等。该酵母在分类学和分子生物学上的独特性质及其表达系统的优势使其成为最具研究价值和应用潜力的酵母之一,但其基础性研究的欠缺和现有蛋白表达系统的不完善性阻碍了其进一步应用。解脂耶氏酵母脂肪酶家族的特异性是它的众多独特性质之一,针对该家族的系统性研究为阐明其独特的分类学地位奠定基础。此外,对现有解脂耶氏酵母表达系统的改进能使其更广泛的应用于工业化生产。本实验室从中国科学院微生物研究所马延和研究员处获赠一株解脂耶氏酵母菌株CGMCC 2.1405,从其中克隆得到其脂肪酶Lip1, Lip3, Lip4及Lip5的cDNA序列,将它们进行表达后分别开展了酶学性质研究,并证实Lipl和Lip3为酯酶而非脂肪酶,修正了人们对该脂肪酶家族成员的认识。为寻找该酵母脂肪酶新基因,本文利用生物信息学分析了解脂耶氏酵母基因组中可能的脂肪酶基因,利用大肠杆菌表达系统构建小型基因库,最终采用功能筛选获得一个脂肪酶新基因（lip9）,进行表达后对其酶学性质进行了研究。同时成功建立了基因克隆新方法。本文构建了解脂耶氏酵母蛋白质定位载体用于研究其脂肪酶的定位,研究发现,除Lip8为细胞壁结合脂肪酶外（Lip2之前已证实为胞外酶）,其它均定位于胞内行使某种功能。本论文还构建了能利用蔗糖和酪氨酸酶作为筛选标记,且能直接应用于野生型解脂耶氏酵母株的两种新型蛋白表达系统,结果证实两种质粒稳定性好,且能用于高等真核生物蛋白质的表达。此外,上述两种表达系统为消除环境污染、扩展解脂耶氏酵母在工业上的应用范围奠定了技术基础。本论文的主要工作及创新点如下：（1）利用反转录PCR克隆了脂肪酶Lipl, Lip3, Lip4, Lip5的cDNA序列,将其在毕赤酵母中成功进行了活性表达,经Ni-NTA层析柱纯化后得到单一蛋白并研究了它们的酶学性质,首次从功能上证实Lip4, Lip5为脂肪酶,Lip1, Lip3为羧酸酯酶。（2）根据已经测得的解脂耶氏酵母基因组序列,利用生物信息学的方法,预测并扩增到18个可能的脂肪酶基因序列,用SignalP3.0对其基因结构进行分析后,在大肠杆菌表达载体pET-28a（+）中进行诱导表达,利用对硝基苯酚棕榈酸酯筛选得到一脂肪酶新基因,为更深入验证其脂肪酶功能并研究其酶学性质,将其克隆入毕赤酵母中表达,经过Ni-NTA柱纯化后研究表明,其偏好水解长链酯,具有水解橄榄油的活性,进一步证实其有脂肪酶活性,将其定名为Lip9。同时建立了基因克隆的新方法。（3）扩增得到酿酒酵母蔗糖基因suc2做为营养缺陷型筛选标记,构建得到解脂耶氏酵母新的胞内和胞外表达载体pINA1297-a-TS和pINA1297-TS,通过比较证实了同源启动子pTEF更适合于工业应用。同时利用该表达系统将人源基因rho进行了成功表达。（4）在构建的新表达载体pINA1297-a-TS的基础上,利用增强型荧光蛋白EGFP构建解脂耶氏酵母蛋白质定位载体,首次对解脂耶氏酵母脂肪酶成员进行定位研究。研究表明,除Lip8外其余均定位于细胞中,Lip8结合于细胞壁上,经缓冲液洗10次后荧光湮灭,证实Lip8是非共价结合于细胞壁。（5）本文首次将编码酪氨酸酶的基因mel应用于酵母表达系统构建。经组装PCR自主合成基因mel后,再利用重叠PCR将其置于启动子pTEF和信号肽XPR2pre的下游,终止区LIP2t的上游,构建得到利用黑色素效应进行筛选的新型解脂耶氏酵母胞内及胞外表达载体pINA1297-a-MS和pINA1297-MS,两者能稳定存在于重组酵母菌基因组中,证实该表达系统构建成功。
刘钰山[7]（2011）在《人白介素25在毕赤酵母中的重组表达、纯化和活性研究》文中研究表明白介素25（Interleukin-25,简作IL-25或IL25）,曾命名为IL-17E,与IL-17的序列相似而被发现,是IL-17家族成员。同IL-17家族中其它五个成员相比,它的氨基酸序列同源性最低,只有16-20%,这提示它有不同于其它家族成员的功能。体外实验表明它可以诱导NF-κB激活,刺激IL-8和G-CSF的产生。小鼠体内研究表明它能作为一个促炎因子介导Th2型细胞因子IL-4、IL-5和IL-13的表达,还会引起嗜曙红细胞增多、脾肿大、血浆IgG1、IgE和IgA增加等Ⅱ型免疫反应。IL-25在Ⅱ型免疫反应中的作用还表现为对寄生虫感染的免疫,这在小鼠免疫模型中得到证明。一些固有免疫细胞能够分泌Ⅱ型细胞因子,后者启动获得性免疫反应,在这个过程中,IL-25发挥了启动的作用。也就是说IL-25是具有介导固有免疫和获得性免疫两个途径的双功能分子。它是调节肺部炎症和哮喘疾病中呼吸道高反应性的潜在靶分子。对IL-25进行重组表达,以获得具有生理活性的重组蛋白,不仅仅有助于进一步对IL-25的功能、分子结构、作用途径等的研究,也将为开发成一种新型生物技术药物打下基础。对IL-25蛋白活性研究所需蛋白的重组表达主要是利用哺乳动物细胞进行瞬时转染表达。还没有形成稳定的细胞株系进行表达,表达量低。本论文选择了真核表达体系——可以利用甲醇作为诱导剂和营养成份暨单一碳源的毕赤酵母（Pichia pastoris）表达体系。我们先后运用了两个表达载体,可以多拷贝整合入酵母基因组的pPIC9K,和方便转化后抗性筛选的pPICZaA。构建了含有IL-25的cDNA成熟肽编码序列的4种表达载体,分别电转化了3种毕赤酵母宿主菌株,野生型X-33,组氨酸利用缺陷型GS115,以及醇氧化酶1（AOX1）缺陷型KM71。分别对转化子进行了多重筛选,首先是营养缺陷型和抗性筛选,接着是PCR鉴定目的基因是否整合到酵母染色体,最后也是最关键的是用摇瓶培养经过前几个步骤确定整合了目的基因的转化子,甲醇诱导表达,SDS-PAGE鉴定在培养液上清中是否有目的蛋白表达。结果,在一系列转化菌株中,在使用pPICZaA构建的IL-25表达载体转化的X-33表达菌株的培养基中通过银染可以检测到rIL-25的表达产物。SDS-PAGE和Western-blot显示,重组蛋白有单体和二聚体两种形式的相应条带。通过裂解酵母菌体分析胞内蛋白的表达情况,发现使用pPICZαA-IL25转化的X-33菌体中目的蛋白IL-25的表达量也很低,这可能是人cDNA的密码子偏好性与毕赤酵母使用的密码子偏好性有差别造成了低水平表达。我们对人IL-25编码区cDNA编码子作了全序列的优化,使用了毕赤酵母的偏好密码子,同时兼顾序列的碱基组成、DNA及其转录后产物mRNA的稳定性和特殊结构的预防等,设计一系列引物进行了overlap PCR扩增,合成了经过密码子优化改造的cDNA序列。将上述cDNA序列与表达载体pPICZaA重组,转化表达菌株X-33,经过抗性筛选和诱导表达筛选。筛选到高表达菌株,实现了IL-25在毕赤酵母中的高效表达。利用高表达菌株,我们进行了高密度发酵。经过优化,我们确定培养液pH控制在5.0,培养温度为30℃,确定了诱导时甲醇的补加速率,氧气流量（溶氧）的控制的和其它一些参数。电泳检测显示从诱导后16小时开始在发酵上清中检测到了目的蛋白的表达,诱导44小时后,表达量不再增高时停止发酵,收集发酵上清。表达产物的初步纯化工艺,首先使用截留分子量为1000Da的超滤膜对上清进行浓缩,然后使用分子筛柱更换缓冲体系为50mMTris-HCl,1mMEDTA,pH8.8。经过过阴离子交换填料（Q Sepharose Fast Flow）吸附后,大部分杂蛋白都被Q柱吸附而目的蛋白在上样液中不被吸附。蛋白样品经过分子筛Sephacryl S-100进一步纯化,去除了大分子量的杂蛋白,并更换平衡液为PB溶液,精纯的rIL-25分装冻干保存。每升发酵上清最后得到39.6毫克rhIL-25。文献表明IL-25在体外实验中能刺激一些上皮细胞和成纤维细胞上调G-CSF等细胞因子的表达。据此我们对纯化的IL-25进行了体外细胞学活性检测,Real-time PCR分析揭示,rhIL-25能够刺激人胚肺成纤维细胞HFL-I和293细胞的G-CSF的mRNA转录上调。使用ELISA检测方法在细胞上清中也检测到了G-CSF蛋白的表达量上调。这表明我们设计表达的rhIL-25具有与野生型相同的生物学活性。用pull-down实验证明,rhIL-25能够与它的受体IL-17RB特异性结合。在体外细胞实验中,我们还发现rhIL-25蛋白可以诱导乳腺癌细胞凋亡,我们对它的机制做了初步研究。我们发现乳腺癌细胞的IL-25受体表达量比非诱导凋亡的细胞高,凋亡是通过促进下游Caspase8并最终由caspase3信号通路实施的。对于其机制和信号通路的进一步研究,以及在其它肿瘤细胞中的作用的研究将拓展IL-25的应用,具有重要的意义。人IL-25在毕赤酵母中的高效表达,为其生物学活性和生理功能研究、分子结构的研究以及药物开发奠定了基础。
李松[8]（2011）在《米根霉CICIM F0071α-淀粉酶：基因克隆、鉴定与异源表达》文中研究表明真菌α-淀粉酶可以水解淀粉或麦芽聚糖内部的α-1,4-糖苷键,水解产物中主要为麦芽糖,主要应用于淀粉糖浆、焙烤制品、啤酒酿制等领域,是重要的工业酶制剂之一。我国真菌α-淀粉酶的研究水平不高,几乎所有研究均没有涉及基因的克隆与表达,发酵生产方式也未从固态发酵向液体发酵转变,发酵生产水平与国际先进水平也存在较大差距。酶制剂产品为多种α-淀粉酶、糖化酶和葡萄糖苷酶的混合产品,往往无法有效的进行目的产物的生成。为此,本论文以研究和开发具有特定应用价值的新型真菌α-淀粉酶为目的,对两株米根霉（CICIM F0071和CICIM F0072）的α-淀粉酶基因进行了克隆和功能鉴定;并将其中一条基因导入多种真核细胞,实现了异源表达;纯化了重组米根霉α-淀粉酶,并对其进行了酶学性质研究。获得如下主要研究结果:（1）对2个米根霉α-淀粉酶基因进行了克隆、鉴定和功能性表达。2条米根霉α-淀粉酶编码基因大小均为1386 bp,2条基因之间的差异为3.02%,推衍得到的氨基酸序列之间的差异为1.95%;与已报道的其他真菌α-淀粉酶的相似度最高为42.8%。该基因编码产物属于淀粉酶家族13成员,具有淀粉酶家族所特有的4个典型的高度保守区域。以质粒载体pET-28a （+）为基础构建相关表达载体,实现了2条淀粉酶基因在大肠杆菌中的功能性表达。RoAmy1和RoAmy2在大肠杆菌中可表达1.3 U/mL和0.5 U/mL的酶活。（2）纯化了2个重组米根霉α-淀粉酶并对其酶学性质进行了研究。通过亲和层析获得了2个重组米根霉α-淀粉酶RoAmy1和RoAmy2的纯品,SDS-PAGE显示其分子量约为48 kDa。酶学性质研究结果显示,2个淀粉酶的性质非常相近,其最适作用pH范围为4.06.0,在pH 4.56.5之间较为稳定;其最适温度均为60℃,在50℃以下较为稳定。以可溶性淀粉为底物获得RoAmy1的Km和Vmax分别0.27 mg/mL和0.068 mg/min,比酶活为1123.4 U/mg;RoAmy2的Km和Vmax分别为0.27 mg/mL和0.064 mg/min,比酶活为1118.6 U/mg。浓度为5 mmol/L的Cu2+和Fe2+对该酶有明显的抑制作用,为非Ca2+依赖型。以马铃薯淀粉为底物时,使用RoAmy1作用后的终产物中最高含74% （w/w）的麦芽糖;该酶对麦芽三糖亲和力较强（Km=0.22 mmol/L）,当麦芽三糖初始浓度为40 mmol/L时,使用RoAmy1作用后终产物中葡萄糖与麦芽糖的浓度比值约为1:4。（3）研究建立了黑曲霉表达体系,建立并优化了其遗传转化方法,构建了多种分泌型表达载体,实现了米根霉α-淀粉酶在黑曲霉中的表达。以潮霉素B为抗性筛选标记,从孢子萌发时间、电场强度及质粒浓度等方面考察了电转化效率的影响因素。研究表明,使用黑曲霉菌株MGG029-ΔaamA,最优电转化条件为:孢子龄为4 d,孢子萌发时间为2 h,电场强度为5 kV/cm。研究中以潮霉素B为抗性筛选标记,使用三磷酸甘油醛脱氢酶启动子（PgpdA）和糖化酶启动子（PglaA）构建相关表达载体pPTH-RoAmy,pPglaA-RoAmy和pPglaAs-RoAmy,利用此表达载体实现了米根霉α-淀粉酶在黑曲霉菌株MGG029-ΔaamA中的表达,最高表达水平约1415 U/mL。对重组菌胞外和胞内淀粉酶活力的检测和比较发现,该淀粉酶利用自身信号肽及黑曲霉糖化酶信号肽均可在黑曲霉中实现分泌表达,且表达量没有明显差异。将该淀粉酶在黑曲霉菌株CICIM F0521中进行表达,其淀粉酶相对分泌量约45 U/mL。（4）研究了酵母表达系统对米根霉α-淀粉酶的表达,实现了其在毕赤氏酵母表达体系中的高效表达。对米根霉α-淀粉酶在酿酒酵母和克鲁维乳酸酵母中的表达进行了初步研究。摇瓶发酵条件下获得重组酿酒酵母W303-1A的酶最高表达量为1.3 U/ml,在克鲁维乳酸酵母中表达约22.4 U/mL的酶活。利用组成型三磷酸甘油醛脱氢酶启动子（GAP）和诱导型醇氧化酶启动子（AOX1）构建相关表达载体,分别实现了米根霉α-淀粉酶在巴斯德毕赤酵母中的表达。在摇瓶发酵条件下,甲醇快速利用型转化子（Mut+）对该淀粉酶的表达量（41 U/mL）约为甲醇慢速利用型转化子（MutS）的8倍,约为组成型表达的24倍。在诱导型或组成型表达方式下,分别考察了使用酿酒酵母α-因子信号肽和米根霉α-淀粉酶自身信号肽进行该淀粉酶的表达情况。使用自身信号肽时,酶的表达量比使用α-因子信号肽时约高7%10%。以摇瓶发酵数据为基础确定15 L发酵罐放大实验条件为:无机盐培养基,温度为30℃,pH值为6.0,接种量为10% （v/v）,甲醇流加方式采用DO-Start法控制。在此发酵条件下结合使用AOX1和GAP启动子时获得的淀粉酶表达量最高,约为462.8 U/mL （0.42 mg/mL）,约为摇瓶发酵方式获得的淀粉酶表达量的9倍。
胡博[9]（2010）在《Asia 1型、O型FMDV复合多表位口服疫苗构建与实验免疫研究》文中指出本研究利用网络服务器对多株Asia 1型、O型FMDV结构蛋白VP1进行表位预测,同时参考已知的Asia 1型、O型FMDV抗原活性位点,设计并合成FMDV多表位盒。将分子佐剂CTB和FMDV辅助性T细胞表位连入多表位盒中,构建Asia 1型、O型FMDV复合多表位基因盒CTEAs和CTEO。将Asia 1型、O型FMDV衣壳蛋白前体P1/2A分别与复合多表位基因相连,利用毕赤酵母进行分泌表达,将纯化的表达产物P1/2A-CTEAs、P1/2A-CTEO、CTEO和CTEAs腹腔免疫小鼠,证明复合多表位均可刺激小鼠高水平的体液免疫和细胞免疫的产生,说明设计的FMDV复合多表位具有良好的免疫原性,其中尤以P1/2A-CTEAs（Asia 1型）和P1/2A-CTEO（O型）免疫组效果最佳。将Asia 1型FMDV复合多表位基因与其结构蛋白VP1-2A基因相连,利用枯草芽孢杆菌分泌型表达载体pBC38C,构建了可稳定表达目的蛋白的重组枯草芽孢杆菌1A751/CTB-VP1/2A-CTEAs、1A751/CTEAs和1A751/CTEO,并以口服的方式（1010/只）进行小鼠免疫实验,并检测特异性血清抗体、T淋巴细胞的增殖和IFN-γ的分泌、黏膜总sIgA和黏膜特异性sIgA。证实重组枯草芽孢杆菌既可刺激体液免疫和细胞免疫的产生,同时对机体黏膜免疫也有显着地诱导作用,其中以重组枯草芽孢杆菌1A751/CTB-VP1/2A-CTEAs口服免疫效果最佳。构建了稳定表达FMDV复合多表位的重组酿酒酵母INVSc1/P1/2A-CTEAs、INVSc1/P1/2A-CTEO、INVSc1/CTEAs和INVSc1/CTEO,并以口服的方式（108/只）进行小鼠免疫实验。说明重组酿酒酵母不仅可以刺激体液免疫和细胞免疫的产生,而且对机体黏膜免疫也有显着地诱导作用,其中以重组酿酒酵母INVSc1/P1/2A-CTEAs和INVSc1/ P1/2A-CTEO口服免疫效果最佳。利用prime-boost免疫策略对多种疫苗联合免疫效果进行研究。以本室构建的Asia 1型、O型FMDV核酸苗pVAX-P1-2A-3C（Asia 1型）和pIRES3CP1（O型）为首免,使用重组鸡痘病毒vUTAL-P1-2A-3C（Asia 1型）和vUTAL3CP1（O型）加强免疫,并于每次免疫的同时灌服本实验中效果较好的重组活菌载体疫苗。明确口服活菌载体疫苗能显着提高prime-boost免疫策略下疫苗联合免疫的效果,显着提高机体细胞免疫、体液免疫以及黏膜免疫水平,其中以重组枯草芽孢杆菌和重组酿酒酵母混合制剂口服免疫效果最佳。
战媛媛[10]（2010）在《植物乳杆菌中BSH基因的原核和酵母表达系统的建立》文中研究说明胆盐水解酶（Bile salt hydrolase,BSH）是一种由BSH基因编码的胞内酶,主要由乳酸菌产生,是微生物在生长和繁殖过程中所产生的代谢产物。BSH酶能够水解甘氨酸胆盐和结合态牛磺酸胆盐,将二者转变成游离胆酸和氨基酸。去结合型胆盐的重吸收效率比结合型胆盐低,这样致使大量的去结合型胆盐从粪便中排出,机体则需要消耗更多的胆固醇重新合成胆酸盐来弥补去结合胆盐的大量流失,从而降低血清胆固醇含量。本文为探讨BSH基因在原核、真核表达系统中的表达行为,分别构建BSH基因的原核和酵母表达载体,并在大肠杆菌和酵母表达系统中进行表达,为BSH基因在不同表达系统中的高效表达和表达调控的研究奠定基础。根据pET-30a（+）载体序列多克隆位点,参照GenBank报道的胆盐水解酶（BSH）基因序列（EU477374） ,利用Primer 5软件设计了一对扩增BSH基因序列的特异性引物。提取植物乳杆菌基因组DNA,通过聚合酶链式反应（PCR）扩增BSH基因,与pMD18-T载体连接,转化E.coli DH5α′,蓝白斑筛选构建的pMD18-BSH质粒,经PCR、酶切、测序鉴定后,以BamH I和Sal I双酶切pMD18-BSH和表达载体pET- 30a（+）,T4连接酶连接,转化大肠杆菌E.coli BL21（DE3） ,筛选构建pET30a（+）-BSH质粒,IPTG诱导表达,电洗脱法纯化表达蛋白,进行SDS-PAGE电泳并经Western bloting鉴定BSH融合蛋白的抗原性;参考pGAPZαA载体序列多克隆位点,根据BSH基因序列设计引物,以pMD18-BSH质粒为模板,PCR扩增目的BSH基因。PCR产物与pGAPZαA酵母表达载体经EcoR I、Xho I双酶切,T4连接酶连接,转化E.coli DH5α′,筛选重组子。将重组质粒经限制性内切酶AvrⅡ线性化,电转化至P. pastoris SMD1168中,高浓度的ZeocinTM抗性筛选高拷贝转化子,用BSH基因特异引物进行PCR鉴定,SDS-PAGE分析并经Western bloting鉴定BSH融合蛋白的免疫学活性。本研究克隆了植物乳杆菌中的胆盐水解酶（BSH）基因,成功构建了pET30a（+）-BSH重组质粒,获得了稳定表达pET30a（+）-BSH的大肠杆菌原核表达体系,在IPTG浓度为1.0mmoL/L、诱导3h表达水平最高,表达出的41kDa蛋白（含6个组氨酸标签）,初步纯化后,纯度达92%以上。Western bloting分析结果表明该蛋白可与植物乳杆菌多克隆抗体发生特异性反应,具有较好的抗原性;此外,以pGAPZαA为表达载体,SMD1168毕赤酵母为受体系统,构建了高效、分泌型的BSH毕赤酵母表达系统。经SDS-PAGE检测,在相对分子质量约35kDa左右处可见目的蛋白表达条带。Western bloting鉴定结果显示,表达蛋白具有良好的免疫学活性,这为进行BSH的结构与相关功能研究和基因工程生产奠定了基础。
二、人白介素-6表达质粒的构建及在酿酒酵母中的表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人白介素-6表达质粒的构建及在酿酒酵母中的表达（论文提纲范文）
（1）人生长激素在毕赤酵母中的分泌表达（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 1.1 重组人生长激素的研究进展 |
| 1.1.1 人生长激素的结构与性质 |
| 1.1.2 人生长激素的功能及生理作用 |
| 1.1.3 人生长激素的基因工程表达 |
| 1.1.4 重组人生长激素的分析检测 |
| 1.2 密码子 |
| 1.2.1 密码子种类及特点 |
| 1.2.2 密码子的偏爱性 |
| 1.2.3 密码子的优化 |
| 1.2.4 修饰宿主提高外源蛋白的表达 |
| 1.3 毕赤酵母表达外源基因的研究进展 |
| 1.3.1 宿主 |
| 1.3.2 表达载体 |
| 1.3.3 外源蛋白表达的优化 |
| 1.3.4 发酵条件的优化及分离纯化 |
| 1.3.5 展望 |
| 1.4 本研究的目的意义 |
| 第二章 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验中使用的试剂 |
| 2.1.2 实验中用到的仪器 |
| 2.1.3 主要培养基 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 单链寡核苷酸的化学合成 |
| 2.2.2 DA-PCR拼接及反应条件优化 |
| 2.2.3 T7 核酸内切酶Ⅰ处理 |
| 2.2.4 OE-PCR法拼接全基因 |
| 2.2.5 测序载体p UC-h GH的构建 |
| 2.2.6 质粒的抽提及鉴定 |
| 2.2.7 重组质粒的构建 |
| 2.2.8 表达质粒转化酵母宿主菌 |
| 2.2.9 G418 筛选整合有多拷贝子h GH基因的克隆 |
| 2.2.10 阳性菌落的筛选 |
| 2.2.11 酵母染色体中整合h GH基因的PCR鉴定 |
| 2.2.12 表达菌株的诱导表达 |
| 2.2.13 重组人生长素的纯化 |
| 2.2.14 纯化产物鉴定和分析 |
| 2.2.15 小量摇瓶表达条件的优化 |
| 第三章 结果与讨论 |
| 3.1 蛋白质序列的逆翻译与密码子优化 |
| 3.2 序列全长及单链寡核苷酸的拆分 |
| 3.3 DA-PCR结果 |
| 3.4 OE-PCR结果 |
| 3.5 测序载体PUC-HGH的构建 |
| 3.6 基因测序结果 |
| 3.7 酵母表达质粒的重组构建与鉴定 |
| 3.8 转化子的筛选及PCR检测 |
| 3.9 重组目的蛋白的表达与鉴定 |
| 3.9.1 SDS-PAGE电泳检测 |
| 3.9.2 Western Blotting检测 |
| 3.9.3 Folin-酚法测定总蛋白质含量 |
| 3.9.4 hGH的 ELISA检测 |
| 3.9.5 hGH的纯化 |
| 3.9.6 表达产物的相对分子质量测定及N-端序列分析 |
| 3.10 HGH生物学活性初步研究 |
| 3.10.1 去脑垂体幼龄大鼠的制备 |
| 3.10.2 试验分组与给药 |
| 3.10.3 检测指标 |
| 3.10.4 数据处理结果 |
| 3.11 HGH发酵条件的优化 |
| 3.11.1 工程菌株生长周期的观察 |
| 3.11.2 诱导时间对表达的影响 |
| 3.11.3 温度和pH对表达的影响 |
| 3.11.4 保护剂对表达的影响 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（2）人源多肽：N-乙酰氨基半乳糖基转移酶ppGalNAc-Ts的原核表达及体外合成O-糖基化修饰的白介素-2（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩写词 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 蛋白质糖基化修饰对重组蛋白药物的影响 |
| 1.2 蛋白质O-GalNAc糖基化修饰及ppGalNAc-T酶 |
| 1.3 重组治疗性蛋白药物表达系统综述 |
| 1.3.1 大肠杆菌表达系统 |
| 1.3.2 酵母表达系统 |
| 1.3.3 昆虫细胞表达系统 |
| 1.3.4 哺乳动物细胞表达系统 |
| 1.3.5 总结 |
| 1.4 本课题的研究内容以及研究意义 |
| 第二章 人源多肽N-乙酰氨基半乳糖转移酶ppGalNAc-T的大肠杆菌表达方法构建及条件优化 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 ppGalNAc-T酶家族序列结构、二硫键及糖基化修饰分析 |
| 2.3.2 在Rosetta大肠杆菌中表达ppGalNAc-T2酶 |
| 2.3.3 四种ppGalNAc-T2 酶表达方法筛选 |
| 2.3.4 PDI对大肠杆菌中ppGalNAc-T2 酶表达的影响 |
| 2.3.5 大肠杆菌表达ppGalNAc-T2 酶的条件优化 |
| 2.4 本章小结与讨论 |
| 第三章 大肠杆菌和HEK293T细胞表达的ppGalNAc-T酶结构及功能比较 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 E.coli-T2和293T-T2 酶活及酶动力学参数比较 |
| 3.3.2 E.coli-T2和293T-T2 二级结构比较 |
| 3.3.3 E.coli-T2和293T-T2 底物选择性比较 |
| 3.3.4 O-糖基化修饰对ppGalNAc-T2 酶活及二级结构影响 |
| 3.3.5 在大肠杆菌中表达ppGalNAc-T1和ppGalNAc-T13 |
| 3.3.6 E. coli-T1和E. coli-T13 二级结构检测 |
| 3.4 本章小结与讨论 |
| 第四章 体外酶法合成O-糖基化修饰的白介素-2 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 白介素-2 结构及ppGalNAc-T酶对白介素-2 糖基化偏好性分析 |
| 4.3.2 在大肠杆菌中表达白介素-2 |
| 4.3.3 使用E.coli-T2/T1 体外酶法合成O-GalNAc修饰的白介素-2 |
| 4.4 本章小结与讨论 |
| 第五章 全文总结与展望 |
| 5.1 全文总结 |
| 5.2 本论文的创新点 |
| 5.3 研究展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间的研究成果 |
（3）乳酸克鲁维酵母表达异源木聚糖酶B工程菌改造及蛋白分泌机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词一览表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 乳酸克鲁维酵母简介 |
| 1.2 乳酸克鲁维酵母可以作为一种新的蛋白分泌研究模式生物 |
| 1.3 乳酸克鲁维酵母在工业生产中的应用 |
| 1.4 乳酸克鲁维酵母外源蛋白表达系统 |
| 1.5 酵母外源蛋白表达系统的优化改造 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 菌株和质粒 |
| 2.2 培养基和抗生素 |
| 2.3 实验方法和相关试剂配制 |
| 第三章 KlGAS1-1和KlGAS1-2基因缺失突变株构建及表型变化 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.3 小结与讨论 |
| 第四章 KlGAS1-1和KlGAS1-2基因敲除对异源蛋白表达的影响 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.3 小结与讨论 |
| 第五章 KlERO1、KlKAR2和KlGCN4过表达对异源蛋白表达的影响 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.3 小结与讨论 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）米黑霉脂肪酶在毕赤酵母中的表达及分子改造（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 目录 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 脂肪酶 |
| 1.1.1 脂肪酶的定义和分类 |
| 1.1.2 脂肪酶的表达和催化特性 |
| 1.1.3 脂肪酶RML的工业应用 |
| 1.2 酶的糖基化和糖基化对酶的影响 |
| 1.2.1 糖基化定义 |
| 1.2.2 糖基化分类 |
| 1.2.3 糖基化对酶活和酶结构的影响 |
| 1.3 不同宿主菌的定向进化技术比较 |
| 1.4 RML的高密度发酵和酶制剂的制作 |
| 1.4.1 毕赤酵母的启动子介绍 |
| 1.4.2 毕赤酵母的发酵方法 |
| 1.4.3 发酵的培养基选择 |
| 1.4.4 发酵产物的纯化及浓缩 |
| 1.5 课题研究的内容和意义 |
| 2 脂肪酶RML的克隆表达和活性测定 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 目的基因的克隆及鉴定 |
| 2.2.2 重组载体的构建及鉴定 |
| 2.2.3 重组酵母的基因鉴定 |
| 2.2.4 RML的表达及活性测定 |
| 2.3 讨论 |
| 3 利用去糖基化技术提高脂肪酶RML的活性 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 RML的PNGase去糖基 |
| 3.2.2 糖基化对酶活的影响 |
| 3.2.3 糖基化对前导肽切除的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 4 米黑根毛霉脂肪酶在大肠杆菌和毕赤酵母中的定向进化比较 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 5 RML在酿酒酵母中表达 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 实验方法 |
| 5.2 结果和讨论 |
| 6 RML在毕赤酵母中的定向进化 |
| 6.1 材料和方法 |
| 6.1.1 材料 |
| 6.1.2 实验方法 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 高通量筛选方法的选择 |
| 6.2.2 定向进化的结果 |
| 6.3 讨论 |
| 7 RML的发酵优化 |
| 7.1 材料和方法 |
| 7.1.1 材料 |
| 7.1.2 方法 |
| 7.2 结果 |
| 7.2.1 高拷贝的筛选 |
| 7.2.2 脂肪酶(M3)的发酵 |
| 7.2.3 酶的真空干燥和喷雾干燥 |
| 7.3 讨论 |
| 8 结论和展望 |
| 8.1 结论 |
| 8.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录部分 |
（5）人血清白蛋白融合技术平台的共性与个性问题研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩写、符号清单、术语表 |
| 绪论 |
| 连接肽的引入对HSA/GH融合蛋白体外生物学活性、稳定性的影响研究以及HSA/GH融合蛋白的双抗夹心ELISA检测方法的建立 |
| 前言 |
| 实验仪器及材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 实验讨论 |
| 实验小结 |
| HSA/PTH(1-34)融合蛋白在毕赤酵母中的表达不均一性研究 |
| 前言 |
| 实验仪器及材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 实验讨论 |
| 实验小结 |
| 利用目的基因多拷贝整合以及分子伴侣共表达提高HSA融合蛋白在毕赤酵母中的表达量研究 |
| 前言 |
| 实验仪器及材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 实验讨论 |
| 实验小结 |
| 本论文最主要创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在读期间主要研究成果 |
（6）解脂耶氏酵母脂肪酶家族的研究及新型表达系统的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 解脂耶氏酵母研究概述 |
| 1.2 解脂耶氏酵母表达系统研究进展 |
| 1.3 酵母脂肪酶基因家族 |
| 1.4 脂肪酶新基因克隆方法 |
| 1.5 脂肪酶全基因合成方法进展 |
| 1.6 蛋白质定位研究 |
| 1.7 本研究的意义和主要研究内容 |
| 2 解脂耶氏酵母脂肪酶基因的克隆、异源表达及酶学性质研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.3 小结与讨论 |
| 3 解脂耶氏酵母脂肪酶新基因的筛选、异源表达及酶学性质研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.3 讨论与小结 |
| 4 基于蛋白质定位研究的解脂耶氏酵母营养缺陷性表达载体的构建及启动子研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.3 讨论与小结 |
| 5 解脂耶氏酵母定位载体构建及其脂肪酶定位研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.3 讨论与小结 |
| 6 以mel为筛选标记构建新型酵母表达载体 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.3 讨论与小结 |
| 7 全文总结与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录1 攻读博士研究生期间发表的学术论文目录 |
| 附录2 基因序列 |
| 附录3 主要缩写词 |
（7）人白介素25在毕赤酵母中的重组表达、纯化和活性研究（论文提纲范文）
| 英文缩写 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 人白介素25基因在毕赤酵母中的表达载体和菌株的筛选 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果与分析 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 1.5 参考文献 |
| 第二部分 人IL-25基因基于毕赤酵母密码子偏好的优化与重组表达 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果和分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 2.5 参考文献 |
| 第三部分 人IL-25在毕赤饽母中的髙密度发酵表达和纯化 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 3.5 参考文献 |
| 第四部分 人重组IL-25的生物学活性测定及抗肿瘤活性的初步研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 4.5 参考文献 |
| 全文总结 |
| 附录 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 课题资助 |
| 已经撰写和发表的文章 |
| 获奖情况 |
| 参与课题 |
| 致谢 |
（8）米根霉CICIM F0071α-淀粉酶：基因克隆、鉴定与异源表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 淀粉及其主要衍生物 |
| 1.2 淀粉水解酶 |
| 1.2.1 淀粉酶及其分类 |
| 1.2.2 α-淀粉酶的结构及其催化机制 |
| 1.2.3 α-淀粉酶的来源及应用 |
| 1.3 真菌α-淀粉酶 |
| 1.3.1 真菌α-淀粉酶的来源及性质 |
| 1.3.2 真菌α-淀粉酶的种类 |
| 1.3.3 真菌α-淀粉酶的应用 |
| 1.3.4 真菌α-淀粉酶的异源表达 |
| 1.4 本课题的立题依据及研究内容 |
| 第二章 米根霉α-淀粉酶基因的克隆与功能鉴定 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 菌株和质粒 |
| 2.2.2 工具酶和试剂 |
| 2.2.3 培养基和培养条件 |
| 2.2.4 主要仪器 |
| 2.2.5 寡核苷酸引物 |
| 2.2.6 米根霉RNA 的提取 |
| 2.2.7 基因克隆、序列测定与分析 |
| 2.2.8 质粒DNA 制备及DNA 的酶切、纯化、连接、大肠杆菌转化等分子操作 |
| 2.2.9 RoAmy 在大肠杆菌中的表达及粗酶液的制备 |
| 2.2.10 酶活测定 |
| 2.2.11 SDS-PAGE |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 米根霉α-淀粉酶基因的扩增及序列测定 |
| 2.3.2 重组大肠杆菌的构建 |
| 2.3.3 RoAmy 的功能鉴定 |
| 2.3.4 RoAmy 及其推衍氨基酸比对分析 |
| 2.3.5 RoAmy 的结构分析 |
| 2.3.6 RoAmy 的遗传进化分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 重组米根霉α-淀粉酶的生化性质 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 菌株 |
| 3.2.2 试剂 |
| 3.2.3 培养基和培养条件 |
| 3.2.4 主要仪器 |
| 3.2.5 rRoAmy 的纯化 |
| 3.2.6 rRoAmy 基本酶学性质 |
| 3.2.7 寡糖的高压液相色谱分析 |
| 3.2.8 酶活测定 |
| 3.2.9 蛋白质浓度测定和SDS-PAGE |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 rRoAmy 的纯化 |
| 3.3.2 温度和pH 对rRoAmy 的影响 |
| 3.3.3 金属离子和EDTA 对rRoAmy 的影响 |
| 3.3.4 rRoAmy 的米氏常数测定 |
| 3.3.5 rRoAmy 对不同底物的水解效率 |
| 3.3.6 rRoAmy 作用麦芽三糖终产物分析 |
| 3.3.7 rRoAmy1 与商品真菌α-淀粉酶作用淀粉终产物比较 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 米根霉α-淀粉酶在酿酒酵母和克鲁维乳酸酵母中的表达 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 菌株和质粒 |
| 4.2.2 工具酶和试剂 |
| 4.2.3 培养基和培养条件 |
| 4.2.4 主要仪器 |
| 4.2.5 酵母的转化 |
| 4.2.6 重组酵母的筛选 |
| 4.2.7 摇瓶发酵试验 |
| 4.2.8 酶活测定 |
| 4.2.9 SDS-PAGE |
| 4.2.10 淀粉浓度的测定 |
| 4.2.11 乙醇浓度的测定 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 酿酒酵母表达质粒的构建及转化 |
| 4.3.2 克鲁维乳酸酵母表达质粒的构建及转化 |
| 4.3.3 具有α-淀粉酶分泌能力的重组酵母的检测与筛选 |
| 4.3.4 RoAmy 在酿酒酵母中的分泌表达 |
| 4.3.5 重组酿酒酵母利用淀粉的生长情况 |
| 4.3.6 RoAmy 在克鲁维乳酸酵母中的分泌表达 |
| 4.3.7 重组酵母克鲁维乳酸酵母利用淀粉的生长情况 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 黑曲霉表达系统表达米根霉α-淀粉酶 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 菌株和质粒 |
| 5.2.2 工具酶和试剂 |
| 5.2.3 培养基和培养条件 |
| 5.2.4 主要仪器 |
| 5.2.5 寡核苷酸引物 |
| 5.2.6 黑曲霉电转化方法 |
| 5.2.7 转化子的纯化 |
| 5.2.8 基因拷贝数的测定 |
| 5.2.9 RoAmy 在黑曲霉中的表达 |
| 5.2.10 酶活测定 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 使用gpdA 启动子构建表达载体 |
| 5.3.2 使用glaA 启动子构建表达载体 |
| 5.3.3 电转化条件的建立 |
| 5.3.4 重组菌株的遗传稳定性检测 |
| 5.3.5 重组菌株的淀粉酶分泌能力检测 |
| 5.3.6 RoAmy 基因拷贝数的测定 |
| 5.3.7 淀粉酶利用不同启动子进行表达 |
| 5.3.8 不同信号肽引导淀粉酶的分泌表达比较 |
| 5.3.9 添加潮霉素B 对重组菌产淀粉酶的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 米根霉α-淀粉酶在巴斯德毕赤酵母中的高效表达 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 菌株和质粒 |
| 6.2.2 工具酶和试剂 |
| 6.2.3 培养基和培养条件 |
| 6.2.4 主要仪器 |
| 6.2.5 寡核苷酸引物 |
| 6.2.6 毕赤酵母的转化 |
| 6.2.7 重组毕赤酵母的二次转化 |
| 6.2.8 转化子的筛选 |
| 6.2.9 基因拷贝数的测定 |
| 6.2.10 RoAmy 在毕赤酵母中的分泌表达 |
| 6.2.11 重组酵母胞内酶活的检测 |
| 6.2.12 酶活测定 |
| 6.2.13 SDS-PAGE 和Native-PAGE |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 诱导型表达质粒的构建 |
| 6.3.2 组成型表达质粒的构建 |
| 6.3.3 重组酵母的筛选与鉴定 |
| 6.3.4 RoAmy 基因拷贝数的测定 |
| 6.3.5 利用甲醇快速利用型重组酵母实现RoAmy 的过量表达 |
| 6.3.6 组成型表达的研究 |
| 6.3.7 利用混合型表达进一步提高RoAmy 的异源表达量 |
| 6.3.8 利用自身信号肽实现RoAmy 在毕赤酵母中表达 |
| 6.3.9 15 L 发酵罐放大试验 |
| 6.4 讨论 |
| 主要结论 |
| 论文创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录：读博期间发表的论文 (含待发表) |
（9）Asia 1型、O型FMDV复合多表位口服疫苗构建与实验免疫研究（论文提纲范文）
| 内容提要 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 绪论 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 口蹄疫的研究进展 |
| 1.1 FMD 的历史和影响 |
| 1.2 FMD 的病原 |
| 1.3 FMD 的临床症状 |
| 1.4 FMD 的感染途径 |
| 1.5 FMD 的亚临床症状和持续感染 |
| 1.6 FMD 的分子流行病学 |
| 1.7 FMDV 的疫苗研究 |
| 1.8 FMD 的防控 |
| 第2章 口蹄疫疫苗研究进展 |
| 2.1 口蹄疫传统疫苗研究 |
| 2.2 口蹄疫新型疫苗的研究 |
| 2.3 展望 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 Asia1 型、O 型 FMDV 复合多表位基因盒的设计与分析 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 Asia1 型、O 型 FMDV 复合多表位基因在毕赤酵母中的表达及小鼠免疫实验研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 Asia1 型、O 型 FMDV 复合多表位基因在枯草芽孢杆菌中的表达及小鼠免疫实验研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 Asia1 型、O 型 FMDV 复合多表位基因在酿酒酵母中的表达及小鼠免疫实验研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 FMDV 复合多表位口服疫苗与多种FMDV 基因工程疫苗联合免疫实验研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文及取得的科研成果 |
| 导师简介 |
| 致谢 |
（10）植物乳杆菌中BSH基因的原核和酵母表达系统的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 胆盐水解酶BSH 的研究进展 |
| 1.2 大肠杆菌表达系统的研究进展 |
| 1.3 巴斯德毕赤酵母表达系统的研究进展 |
| 第二章 BSH 基因的人工合成及原核表达系统的构建 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果和分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 pGAPZαA-BSH 表达载体的构建及在毕赤酵母中的表达 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果和分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 作者简历 |
四、人白介素-6表达质粒的构建及在酿酒酵母中的表达（论文参考文献）
- [1]人生长激素在毕赤酵母中的分泌表达[D]. 郭丹. 吉林大学, 2020(08)
- [2]人源多肽：N-乙酰氨基半乳糖基转移酶ppGalNAc-Ts的原核表达及体外合成O-糖基化修饰的白介素-2[D]. 梁涛. 上海交通大学, 2020(01)
- [3]乳酸克鲁维酵母表达异源木聚糖酶B工程菌改造及蛋白分泌机制研究[D]. 连昭. 中国农业大学, 2015(03)
- [4]米黑霉脂肪酶在毕赤酵母中的表达及分子改造[D]. 刘悦. 浙江大学, 2014(06)
- [5]人血清白蛋白融合技术平台的共性与个性问题研究[D]. 吴敏. 浙江大学, 2013(11)
- [6]解脂耶氏酵母脂肪酶家族的研究及新型表达系统的构建[D]. 赵鹤云. 华中科技大学, 2012(09)
- [7]人白介素25在毕赤酵母中的重组表达、纯化和活性研究[D]. 刘钰山. 复旦大学, 2011(03)
- [8]米根霉CICIM F0071α-淀粉酶：基因克隆、鉴定与异源表达[D]. 李松. 江南大学, 2011(12)
- [9]Asia 1型、O型FMDV复合多表位口服疫苗构建与实验免疫研究[D]. 胡博. 吉林大学, 2010(05)
- [10]植物乳杆菌中BSH基因的原核和酵母表达系统的建立[D]. 战媛媛. 黑龙江八一农垦大学, 2010(09)