一、颌下腺缺血再灌注后细胞凋亡与增殖的研究中国医科大学第一临床学院整形外科（论文文献综述）
田军[1]（2021）在《降钙素基因相关肽（CGRP）通过调控Akt/mTOR信号通路介导的凋亡和自噬减轻创伤性颅脑损伤的实验研究》文中研究说明创伤性颅脑损伤（Traumatic Brain Injury TBI）的定义是由于外部机械力造成的脑损伤,并导致大量的死亡和残疾,许多受害者有功能障碍,如运动和感觉功能障碍,甚至认知功能缺陷。据估计,全世界每年约有5000万人被诊断为TBI。颅脑损伤根据发生的不同过程和阶段,可分为原发性和继发性脑损伤,都是由脑外伤引起的复杂疾病。组织丢失和细胞死亡是主要的损伤,TBI后由于原发性颅脑损伤导致的继发性脑损伤,导致激活的小胶质细胞、募集的中性粒细胞和巨噬细胞以及血液代谢物中引起的炎症反应均可导致继发性脑损伤,进而导致进一步的功能性和器质性的脑损伤。炎症反应被认为是TBI继发性损伤的重要机制。从理论上讲,减少炎症改善受损脑组织能量及代谢可以减轻TBI引起的继发性脑损伤。降钙素基因相关肽（Calcitonin gene-related peptide CGRP）是由37个氨基酸组成的多肽,广泛表达于中枢和外周神经系统。目前,CGRP被认为是最有效的血管舒张药。CGRP在脑组织中起保护作用。当脑组织受到损伤并出现缺血时,小鼠脑TBI后产生大量自我保护物质,CGRP是其中最重要的保护物质之一。研究表明,在TBI后的病理过程中,CGRP的分泌在TBI后增多。增加的目的是使脑血管扩张,尽快为损伤后缺血缺氧的脑组织提供血液供应。然而,当脑组织损伤缺血较严重时,脑组织产生的CGRP不能完全防御这种损伤。因此出现了严重的脑组织继发性和永久性损伤。考虑到CGRP具有保护脑损伤的潜力,而自噬和凋亡在TBI诱导的继发性损伤中发挥重要作用,我们检测了CGRP是否能抑制TBI小鼠的自噬和凋亡的表达。结果表明,CGRP通过减轻脑水肿、调节神经元自噬和凋亡,减低TBI后神经炎症反应来保护大脑。第一部分创伤性颅脑损伤患者血清CGRP水平及与预后的关系目的:临床工作中,观察不同TBI患者CGRP表达变化、判断伤情程度,进一步探讨CGRP与TBI患者病情程度及预后的关系,并探讨CGRP是否可以作为判断TBI预后的可靠指标。方法:选取138例TBI患者进行分组:健康体检者54例（对照组）,重度TBI组73例,轻度TBI组65例。采用酶联免疫分析试剂法（ELISA）,测定TBI患者特定时间的血清CGRP水平。采用格拉斯哥昏迷量表（GCS）判定TBI严重程度。统计分析:各组不同时间CGRP比较采用重复测量资料的方差分析,同一时间组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD法。采用wilicoxon秩和检验分析患者血清CGRP水平与临床变量的关系。结果:1.TBI后患者血清CGRP的变化对照组随时间变化呈现平稳状态,TBI（轻度组）和TBI（重度组）先下降后逐渐上升。两组血清CGRP水平均低于对照组。入院时、1天、3天、7天和14天时间点,TBI（重度组）低于TBI（轻度组）,差异显着,有统计学意义;入院时、1天、3天时间点,TBI（轻度组）低于对照组,差异显着,有统计学意义;入院时间点7天和14天,TBI（轻度组）低于对照组,但差异不显着。2.入院时TBI患者血清CGRP水平与临床病理特征关系相对于GCS评分<5分的患者,GCS评分≥5分的患者血清CGRP水平较高（Z=-2.277,P=0.023）。存活患者的CGRP水平高于死亡患者（Z=-3.571,P<0.001）。3.入院血清CGRP预测TBI患者伤后死亡的价值评估血清CGRP水平预测TBI患者伤后死亡的特异度为88.24%,灵敏度为68.82%,CGRP预测最佳临界值为13.255pg/ml。4.TBI患者预后与血清CGRP的相关性CGRP高水平组患者生存情况优于低水平组患者,差异显着;单因素Cox分析发现,年龄,中线结构移位,GCS分数,CGRP水平与TBI患者预后相关;多因素Cox分析发现,中线结构移位,CGRP水平是TBI患者独立预后因素。小结:1.TBI后患者血清中的CGRP变化趋势为随伤后时间变化先降低,然后逐渐升高。约至24小时到达最低点,大约在14天前后达高峰。2.血清CGRP水平可以预测TBI患者的预后不良及死亡,而且该预测效能较高。第二部分降钙素基因相关肽（CGRP）对小鼠创伤性颅脑损伤神经功能的保护作用目的:通过重物打击法（Feeney重物下降挫伤法）,建立开放性创伤性颅脑损伤（Traumatic Brain Injury TBI）动物模型,并予以脑室注射联合尾静脉注射外源性降钙素基因相关肽（CGRP）干预TBI模型小鼠;通过旷场实验、水迷宫实验、巴恩斯迷宫实验、跳台实验对实验小鼠的行为学评分进行测量,验证（CGRP）对创伤性颅脑损伤神经功能的保护作用。通过测量CGRP干预前后小鼠脑挫伤面积比较、脑水肿比较、血脑屏障破坏程度等方面的比较,来探讨CGRP对TBI小鼠脑损伤的保护作用。方法:清洁级（SPF）雄性BALB/C小鼠390只,随机分为sham组、TBI组和TBI+CGRP组。用1%戊巴比妥钠（40 mg/kg,i.p.i.）麻醉小鼠,根据Feeney重物下降法,建立开放性颅脑创伤模型。TBI+CGRP两组分别用CGRP肽（脑室注射+尾静脉注射）,术后每日采用改良神经严重程度评分（m NSS）检测各组小鼠的神经功能缺损程度。各组小鼠分别于术后相应的时间点（1、3、5、7天）取材;苏木精伊红染色（HE染色法）和（TTC）染色法:测量小鼠脑组织损伤面积,并进行组间对比;通过干湿重法测量不同组别小鼠的脑组织含水量;通过测量Evans Blue（EB）渗透率的方法,来判定TBI后血脑屏障的破坏程度。通过蛋白质印迹法（Western blot）测量脑组织CGRP蛋白的表达量。通过行为学测试对小鼠神经行为学进行测量:术后第8、9天进行旷场实验;术后第10-15天行水迷宫实验;术后第16-22天行巴恩斯迷宫实验;术后第23、24天为跳台实验的训练和测试阶段。结果:1.创伤性颅脑损伤（TBI）（Feeney重物下降挫伤法）动物模型稳定:术后小鼠平均昏迷时间约为1.5-2h,生命体征较平稳,体温恢复,呼吸平稳,逐渐苏醒和爬行,可进食水。脑组织经解剖,均可见局部挫伤灶,局部坏死、淤血,伴部分脑组织的凹陷缺损;部分样本损伤灶同侧可见蛛网膜下腔出血。2.各组小鼠m NSS评分差异术后第1天,TBI+CGRP组和TBI组相对sham组,神经功能均受损明显。TBI+CGRP组和TBI组神经功能基本相同,差异无统计学意义;在TBI后第2-7天,TBI+CGRP组小鼠m NSS评分低于TBI组,差异显着;第2-7天TBI+CGRP组和TBI组神经功能逐渐有所好转,两组小鼠的分数逐渐下降。3.TBI小鼠神经功能行为学评分结果旷场实验（Open field test）评分结果:总活动距离测试:sham组总距离最长,TBI+CGRP组小鼠的总距离居中间水平,TBI组的总距离最短。TBI+CGRP组小鼠的总距离相比TBI组的总距离长,差异显着。静止次数和静止时间和测试方面:TBI组小鼠静止次数最多,sham组和TBI+CGRP组静止次数较低,和TBI组小鼠相比,差异不显着,无统计学意义。TBI组小鼠静止时间最长,sham组和TBI+CGRP组静止时间相对较最低,和TBI组小鼠相比,差异不显着,无统计学意义。水迷宫实验:定位航行实验阶段:水迷宫测试小鼠发现平台的潜伏期,TBI+CGRP组小鼠的潜伏期相比TBI组小鼠的潜伏期时间短,差异显着,有统计学意义。TBI组小鼠比sham组小鼠的潜伏期长,差异显着,有统计学意义。空间探索实验阶段:在测试的第五天小鼠穿过平台次数,sham组最多,TBI组最少,TBI+CGRP组居中。TBI组穿过平台次数相比sham组少,差异显着,有统计学意义;TBI+CGRP组穿越平台次数多于TBI组,差异显着,有统计学意义。巴恩斯迷宫测试:训练阶段:TBI组小鼠的潜伏期相比较TBI+CGRP组小鼠的潜伏期长,差异显着,有统计学意义。第六天试验中,第一次探查目标洞（无暗箱）前的错误探查次数比较,TBI+CGRP组小鼠的探错次数相比TBI组小鼠多,差异显着,有统计学意义。跳台实验评分:在跳台试验测试阶段,TBI+CGRP组小鼠的潜伏期相比较TBI组小鼠的潜伏期长,差异显着,有统计学意义;错误次数:TBI+CGRP组小鼠的错误次数相比较于TBI组小鼠的错误次数少,差异显着,有统计学意义。4.不同组别小鼠脑组织标本创伤面积的测量和比较:三组小鼠脑组织切片相比较:TBI+CGRP组与TBI组相比较,均可见一定程度的脑组织损伤及局灶性神经细胞组织缺失,早期缺损范围的差异性较小。随着时间的推移,TBI小鼠脑组织切片可见更严重的脑损伤;定量计算脑损伤体积,TBI+CGRP组小鼠脑组织切片与TBI组小鼠脑组织切片相比较,损伤面积略小,但差异不显着,无统计学意义。5.脑水肿测定:外源性CGRP干预,将TBI术后脑水肿消退的时间点提前,减少了TBI诱导的脑水肿在TBI后持续时间,加速了TBI诱导的脑组织水肿的吸收,进而减轻脑损伤;另一方面,TBI+CGRP组小鼠的脑含水量在1天、3天、5天、7天这四个时间点,脑水肿程度均低于TBI组小鼠,差异显着,有统计学意义。6.血脑屏障损伤程度:TBI术后第1天,sham组未见明显依文思蓝（EB）渗出,TBI+CGRP组小鼠（EB）渗透率和TBI组相比无明显差异;TBI后第3、5、7天,TBI+CGRP组和TBI组小鼠依文思蓝（EB）渗透率仍较高,TBI+CGRP组小鼠依文思蓝（EB）渗透率低于TBI组,两者差异显着,有统计学意义。7.TBI后各组小鼠CGRP蛋白表达水平的差异:TBI组小鼠脑组织中CGRP表达水平显着降低,并随着时间的推移逐渐升高;TBI+CGRP组脑组织中CGRP蛋白表达水平明显高于TBI组,差异显着,有统计学意义。小结:1.根据Feeney重物下降法,可建立标准、可靠的开放性颅脑损伤动物模型,术后正常喂养及观察行为学变化,确认TBI模型建立。2.CGRP干预减低了创伤性颅脑损伤小鼠的神经功能损伤,减低了创伤性颅脑损伤挫伤灶的损伤面积;减低了创伤性颅脑损伤后脑水肿的程度,减少了TBI后脑水肿的持续时间;减轻了TBI后血脑屏障的破坏程度。3.通过蛋白印迹法可见TBI后小鼠脑组织中CGRP的表达水平显着降低,24h达最低,随时间推移逐渐回升。TBI+CGRP组小鼠脑组织中CGRP蛋白表达水平明显高于TBI组,提示本实验采用的脑室注射+尾静脉注射干预途径有效可靠。第三部分降钙素基因相关肽（CGRP）对创伤性颅脑损伤后神经元细胞自噬和凋亡的影响目的:通过对小鼠挫伤脑组织部位取材,对其进行自噬和凋亡相关标志性蛋白检测,观察对比CGRP干预前后自噬和凋亡标志性蛋白的变化情况,探讨CGRP在TBI环境下对自噬和凋亡的调控作用。方法:通过免疫荧光双染法:定位分析LC3和Neu N及GFAP蛋白;蛋白质印迹法,定量分析LC3、P62、Beclin-1、cleaved-caspase-3表达量;TUNEL和Neu N双染色法,分析TBI后神经元凋亡的表达变化情况。结果:1.CGRP对TBI小鼠神经元细胞自噬的影响免疫荧光双染法:脑皮层挫伤区LC3（+）蛋白定位于挫伤部位神经元的胞质中,Sham组可见少量阳性表达,随时间推移阳性表达程度无变化。TBI组于伤后1天可见LC3（+）细胞显着增多,随时间推移表达程度逐渐增强,高于Sham组,差异显着;TBI+CGRP组与TBI组比较,LC3（+）细胞数量较少,表达程度明显减弱,TBI后第1天,差异不显着,无统计学意义;而TBI后第3、5、7天,两组差异性逐渐增强,差异显着,有统计学意义。蛋白质印迹法:部分自噬标志物LC3、P62、Beclin-1蛋白表达与双染结果一致。TBI+CGRP组的LC3II/LC3I比值和Beclin-1水平较TBI组明显降低,差异显着,有统计学意义。P62水平的变化则相反,与sham组相比,TBI导致小鼠P62表达降低,TBI+CGRP组的P62较TBI组明显升高,差异显着,有统计学意义。CGRP的干预导致P62蛋白表达逐渐增强并维持在一个相对较高的阶段。2.CGRP对TBI小鼠神经元细胞凋亡的影响:TUNEL和Neu N双染色显示:TBI导致神经元凋亡增加,挫伤灶周围TUNEL（+）细胞明显增加;TBI+CGRP组的TUNEL（+）较TBI组明显降低,差异显着,有统计学意义;蛋白质印迹法:（Western blot法）:TBI导致神经元凋亡,小鼠挫伤灶脑组织凋亡相关蛋白cleaved-caspase-3表达升高,皮层组织细胞凋亡增加。TBI+CGRP组的cleaved-caspase-3较TBI组明显降低,差异显着,有统计学意义。3.CGRP对TBI小鼠神经元细胞神经胶质纤维酸性蛋白GFAP的影响:与sham组相比,TBI导致小鼠神经元细胞GFAP数量明显增加,Neu N数量明显减低,而CGRP的干预降低了神经元细胞损伤。脑皮层挫伤区GFAP（+）表达:Sham组可见少量阳性细胞表达,表达不明显。TBI组和TBI+CGRP组伤后1、3、5、7天均可见阳性细胞显着增多。TBI组GFAP（+）计数率高于Sham组,差异显着;TBI+CGRP组GFAP（+）计数率低于TBI组第1、3天差异无显着性,第5、7天差异显着,有统计学意义。脑皮层挫伤区Neu N（+）表达:Sham组可见适量Neu N（+）表达。TBI组和TBI+CGRP组伤后1、3、5、7天均可见Neu N（+）细胞显着减少。TBI组Neu N（+）计数率低于Sham组,差异显着,有统计学意义;TBI+CGRP组Neu N（+）计数率高于TBI组差异显着,有统计学意义。小结:1.TBI后小鼠神经细胞自噬和凋亡水平增加,予以外源性CGRP干预,有效抑制了TBI所致小鼠神经元细胞的自噬和凋亡;2.TBI后小鼠神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）在显着增加,CGRP干预后,减少了TBI小鼠颅脑损伤部位的胶质纤维酸性蛋白的出现,保护神经细胞功能。第四部分AKT/m TOR信号通路参与了外源性CGRP对神经元细胞自噬和凋亡的调控目的:通过利用CGRP干预TBI小鼠模型,在信号通路层面探讨CGRP对自噬和凋亡相关通路蛋白的调控情况,进一步探讨CGRP对自噬和凋亡的调控机制。方法:通过CGRP干预TBI小鼠模型,采用蛋白质印迹法（Western Blot法）,测定CGRP干预前后挫伤灶局部脑组织的AKT/m TOR、Fox O3a通路相关标志蛋白的变化情况,并对比CGRP干预前后的蛋白表达变化差异。结果:1.CGRP对AKT/m TOR通路的影响TBI术后导致了小鼠脑神经元细胞内p-Akt/Akt和p-m TOR/m TOR水平降低,TBI+CGRP组和TBI组均低于sham组,差异显着,有统计学意义。CGRP使这两者比值均升高。其中,CGRP对p-Akt/Akt激活作用较明显,术后1、3、5、7天四个时间点,TBI+CGRP组的p-Akt/Akt相比TBI组表达升高,差异显着,有统计学意义;CGRP对p-m TOR/m TOR激活作用较弱,术后第1、3天TBI+CGRP组p-m TOR/m TOR相比TBI组,差异显着,有统计学意义;术后第5、7天TBI+CGRP组p-m TOR/m TOR相比TBI组,差异不显着,无统计学意义;同时,Akt/m TOR信号的激活也在TBI后逐渐增强。2.CGRP对Fox O3a表达的影响TBI术后细胞核中Fox O3a蛋白水平显着升高,而细胞浆中Fox O3a蛋白水平显着降低,证实TBI导致了小鼠脑神经元细胞内Fox O3a蛋白分布的变化。CGRP使细胞核内Fox O3a增加逐渐减弱,而胞浆中Fox O3a逐渐升高。细胞核中Fox O3a蛋白表达情况可见,TBI+CGRP组的Fox O3a蛋白表达低于TBI组,差异显着,有统计学意义;而细胞浆中Fox O3a表达情况可见,TBI术后1、3、5、7天四个时间点,TBI+CGRP组的Fox O3a蛋白表达高于TBI组,差异显着,有统计学意义。小结:1.TBI抑制了Akt/m TOR信号通路的激活,对神经元细胞有损伤作用;外源性CGRP干预促进了Akt/m TOR信号通路的激活,导致了神经元细胞自噬和凋亡的降低,起到了脑保护作用。2.TBI促进了Fox O3a蛋白向神经元细胞核内转移,对神经元细胞有损伤作用;外源性CGRP干预可缓解细胞核内的Fox O3a升高趋势,保护神经元细胞。结论:1.临床TBI患者血清样本中CGRP变化趋势为先迅速降低然后逐渐升高,约24小时到达最低点,大约在14天前后达高峰,与动物模型变化趋势相同。2.血清CGRP水平可以预测TBI患者的预后不良及死亡情况,而且该预测的效能较高。CGRP高水平组远期预后、存活率优于CGRP低水平组;存活患者血清CGRP水平高于因TBI死亡的患者。CGRP可以作为TBI预后不良及死亡评估的参考指标。3.根据Feeney重物下降法,可建立标准、可靠的颅脑挫伤动物模型,术后正常喂养及观察行为学变化,确认TBI模型建立。4.CGRP干预,减低了创伤性颅脑损伤鼠的神经功能损伤,减低了创伤性颅脑损伤挫伤灶的损伤面积;减低了创伤性颅脑损伤后脑水肿的程度,减少了TBI后脑水肿的持续时间;减轻了TBI后血脑屏障的破坏程度;通过蛋白印迹法,可见TBI+CGRP组脑组织中CGRP蛋白表达水平明显高于TBI组,提示脑室注射联合尾静脉注射的外源性干预途径有效可靠。5.TBI后小鼠神经细胞自噬和凋亡水平增加,神经胶质纤维酸性蛋白GFAP增加;CGRP的干预有效抑制了TBI所致小鼠神经元细胞的自噬和凋亡,减少了TBI小鼠颅脑损伤部位GFAP的表达。6.TBI抑制了Akt/m TOR信号通路的激活,导致了神经元细胞自噬和凋亡水平升高,同时促进了Fox O3a蛋白向细胞核内转移,对神经元细胞有损伤作用;相反,外源性CGRP干预可促进Akt/m TOR信号通路的激活,抑制了神经元细胞自噬和凋亡,缓解了细胞核内的Fox O3a升高趋势,起到了脑保护作用。
陈卓[2]（2019）在《双参通脉颗粒对心肌缺血再灌注大鼠NF-κB信号通路影响的实验研究》文中提出目的:本研究通过在体实验观察双参通脉颗粒（Ginseng and Salvia Miltiorrhiza Granules,GSG）对心肌缺血再灌注（Myocardial infarction Ischemia reperfusion injury,MIRI）大鼠心功能的保护作用、对NF-κB信号通路的作用,通过离体细胞实验,观察双参通脉颗粒含药血清对乳大鼠心肌细胞缺氧复氧模型NF-κB信号通路的作用,探讨双参通脉颗粒对心肌缺血再灌注损伤的调节作用及机制,为临床用药提供理论支持。材料与方法:在体实验:SPF级12周龄SD大鼠50只,雌雄各半,质量（230±20）g。将50只SD大鼠随机分成5组,每组10只,分别为假手术组,模型组,西药组,中药低剂量组,中药高剂量组。按人体与大鼠体表面积换算药物剂量,低、高剂量分别相当于生药量7.31g/kg,13.45g/kg,西药合心爽用量4.23mg/kg。假手术组及模型组应用等量生理盐水,以上各组按2次/日,3ml/次,连续灌胃四周。心电图评估筛查后,结扎大鼠左冠状动脉前降支造模,缺血30min,再灌注120min,手术全程监测心电图判定造模是否成功,监测心功能。术后大鼠经腹主动脉取血,分离血清,ELISA法检测心肌组织氧化损伤指标谷胱甘肽过氧化酶（GSH-PX）、过氧化氢酶（CAT）、内皮素（ET）、髓过氧化物酶（MPO）含量变化,炎症介质白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-ɑ）含量变化;免疫组化法检测细胞间黏附分子-1（ICAM-1）、血管内皮细胞黏附分子-1（VCAM-1）含量变化;原位末端转移酶标记技术（TUNEL）染色评估心肌细胞凋亡指数;Western blot检测心肌核转录因子-κB（NF-κB）、IκBα蛋白表达;同时观察各组大鼠心肌组织病理变化。离体实验:双参通脉颗粒含药血清的制备:30只SD大鼠,饲养于适宜环境中,自由饮水,进食,温度,湿度适宜,适应性喂养3天,后分组,随机分成三组,正常组10只,双参通脉颗粒低、高剂量组各10只,中药予浓度为7.31g/kg、13.45g/kg的颗粒剂水溶液,日两次灌胃,3ml/次,日两次,连续2周,正常组给予等量盐水,中药各组持续灌胃5d后取血,离心,取上清,过滤灭菌,-80℃冻存备用。细胞培养及传代:大鼠心肌细胞株接种于培养基,置于温度37℃,5%CO2培养箱内24h,传代。细胞造模:建立心肌细胞缺氧复氧模型,细胞分四组,正常组、模型组、中药低、高剂量组。正常组在37℃,5%CO2培养基中加入与含药血清同浓度的正常大鼠血清,连续培养24h;模型组心肌细胞置培养箱（37℃,5%CO2,90%N2,5%O2）缺氧6h,后置于37℃,5%CO2培养基复氧12h,结束;中药低、高剂量组细胞培养液中加入最佳工作浓度的中药含药血清（过滤除菌,4℃保存,稀释到适当浓度约1000倍）,其余同模型组。分别取各组细胞培养瓶中培养液,按照LDH检测试剂盒说明书,通过比色法检测各组细胞培养液中的乳酸脱氢酶（LDH）活性;CCK-8法检测心肌细胞活性;将培养好的心肌细胞以适当密度接种于96孔板中,每组设置6个复孔,加入培养液,CCK-8,与未加细胞孔对比,放置培养箱4-5小时,完成后,用酶标仪于450nm处检测OD值,Annexin-V FITC/PI双染法检测细胞凋亡率;ELISA法检测各组细胞培养基上清液中IL-1β、IL-6及TNF-α含量变化,将各组心肌细胞按照上述实验方法加入含药学清及试剂后,按照ELISA试剂盒说明书操作;免疫荧光染色观察NF-κB、IκBα、Iκκβ的表达。采用SPSS17.0软件对所得实验数据进行处理分析,以均数±标准差（mean±SD）表示,组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）,两两比较采用q检验,凋亡率采用卡方检验（Chi-square test）,以p<0.05为具有统计学差异。结果:1双参通脉颗粒（GSG）对心肌缺血再灌注（MIRI）大鼠心功能的影响1.1 GSG对各组大鼠血流动力学的影响与模型组相比,GSG各组反映左心室收缩功能的指标（LVSP）显着升高（p<0.05）,左室最大上升速率（+dp/dtmax）升高（p<0.05）,反映左心室舒张功能的指标（LVDP）显着降低（p<0.05）,左室最大下降速率（-dp/dtmax）降低（p<0.05）,GSG低、高剂量组及西药组心率变化（D-value）均较模型组小（p<0.05）。1.2 GSG对MIRI大鼠血清GSH-PX、CAT、ET、MPO含量的影响GSG干预后,ET、MPO均有所下降,GSH-PX、CAT含量上升,与模型组比较有显着性差异（p<0.05）,与假手术组比较,模型组心肌细胞凋亡指数显着升高（p<0.05）,西药组及GSG低、高剂量组心肌细胞凋亡指数明显下降（p<0.05）。1.3 GSG对MIRI大鼠心肌组织病理变化的影响假手术组心肌纤维排列较紧密规整,组织间隙水肿较轻微,仅有轻度淤血,周围组织有微量渗出,血管轻度扩张。模型组心肌纤维扭曲断裂,细胞肿胀,组织间隙水肿,细胞核散乱无序,心肌细胞肥大,染色疏松。西药组心肌纤维断裂较少,排列紊乱,心肌间质疏松,心肌间隙血管扩张,周围可见水肿及渗出。中药低剂量组心肌纤维排列较MIRI组规整,组织间隙有水肿渗出,炎细胞浸润。中药高剂量组心肌纤维排列较规整,肌纤维断裂少,组织间隙水肿较轻。2双参通脉颗粒对MIRI大鼠NF-κB信号通路的影响2.1 GSG对血清炎症介质IL-1β、IL-6和TNF-ɑ含量的影响假手术组血清IL-1β、IL-6和TNF-ɑ含量水平升高不明显,模型组IL-1β、IL-6和TNF-ɑ含量增加（p<0.05）,与模型组比较,中药低、高剂量组IL-1β、IL-6和TNF-ɑ含量均显着下降（p<0.05）。2.2 GSG对心肌组织VCAM-1、ICAM-1含量变化的影响假手术组心肌组织可见微少的被染色的细胞;模型组心肌组织被染色的细胞较多,较密集;西药组染色细胞较模型组减少;中药低剂量组染色细胞较模型组减少;中药高剂量组染色细胞最少。ICAM-1含量变化:假手术组心肌组织可见微小的染色组织;模型组心肌组织被染色部位较大,较密集;西药组染色组织较模型组减少;中药低剂量组染色组织较模型组减少;高剂量组染色组织最少。2.3 GSG对大鼠心肌细胞凋亡率的影响假手术组心肌细胞凋亡率为6.12%,模型组心肌细胞凋亡率为32.01%,与假手术组比较有显着差异（p<0.05）;西药组凋亡细胞较模型组减少,25.32%;中药低剂量组细胞凋亡率为7.31%,与模型组比较有显着差异（p<0.05）;中药高剂量组细胞凋亡率为13.45%,与模型组比较有显着差异（p<0.05）。2.4 GSG对MIRI大鼠NF-κB、IκBα蛋白表达的影响与假手术组比较,模型组NF-κB蛋白表达显着升高（p<0.05）,IκBα蛋白表达显着降低（p<0.05）,给予GSG后,GSG低、高剂量组NF-κB蛋白表达均显着降低（p<0.05）,IκBα蛋白表达显着升高（p<0.05）。3双参通脉颗粒含药血清对乳大鼠心肌细胞NF-κB信号通路的影响3.1各组细胞培养液LDH活性改变正常组心肌细胞生长状态良好,心肌细胞培养液LDH活性为93.47U/L,模型组心肌细胞培养液LDH活性为241.54U/L,与正常组比较显着升高（P<0.05）;GSG低剂量组心肌细胞培养液LDH活性为175.02U/L,与模型组比较显着降低（P<0.05）,GSG高剂量组心肌细胞培养液LDH活性为142.77U/L,与模型组比较显着降低（P<0.05）。3.2各组心肌细胞存活率改变正常组心肌细胞存活率为80.65%;模型组心肌细胞存活率42.14%;与正常组相比明显降低（p<0.05）;中药低剂量组心肌细胞存活率为58.32%;与模型组相比显着升高（p<0.05）;高剂量组心肌细胞凋亡率为60.41%,与模型组比较均有显着性差异（p<0.05）。3.3各组心肌细胞凋亡率改变经Annexin V与PI染色后用流式细胞仪进行检测,正常组心肌细胞凋亡率为2.84%,模型组心肌细胞凋亡率为26.62%,与正常组比较有显着性差异（p<0.05）;中药血清低剂量组心肌细胞凋亡率为14.38%,高剂量组心肌细胞凋亡率为6.16%,与模型组比较均有显着性差异（p<0.05）。采用TUNEL法检测心肌细胞凋亡,正常组心肌细胞凋亡率为42.82%,模型组心肌细胞凋亡率值为83.71%,与模型组比较有显着性差异（P<0.05）;中药血清低剂量组心肌细胞AI值为54.21%,与模型组比较有显着性差异（P<0.05）,高剂量组心肌细胞凋亡率值为62.94%,与模型组比较有显着性差异（P<0.05）。3.4各组心肌细胞培养基上清IL-1β、IL-6和TNF-α含量改变与正常组比较,模型组心肌细胞培养基中IL-1β、IL-6和TNF-α含量显着增高（P<0.05）,与模型组比较,中药血清组IL-1β、IL-6和TNF-α含量均显着降低（P<0.05）。3.5各组心肌细胞内蛋白激酶NF-κB、IκBα、Iκκβ表达改变与正常组比较,模型组心肌细胞绿色荧光强度显着升高,表明NF-κB蛋白激酶表达量增加（P<0.05）,提示NF-κB含量增高;与模型组比较,中药血清处理组绿色荧光强度降低,说明中药GSG含药血清对NF-κB、Iκκβ有抑制作用;对IκBα有增加作用;中药组能降低NF-κB、Iκκβ蛋白激酶表达水平（P<0.05）,升高IκBα蛋白激酶表达水平（P<0.05）。结论:1双参通脉颗粒可以保护缺血再灌注大鼠的心功能,提高各项心功能指标,降低心律失常发生率,减轻心肌细胞氧化损伤。2双参通脉颗粒可以降低NF-κB信号转导通路中的关键炎症介质IL-1β、IL-6和TNF-α的含量,降低蛋白激酶NF-κB、Iκκβ的表达,升高抑制凋亡蛋白IκBα的表达,降低心肌细胞凋亡率。3双参通脉颗粒含药血清可以降低炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的含量,降低蛋白激酶NF-κB、Iκκβ的含量,升高蛋白激酶IκBα的含量,从而提高大鼠缺氧复氧心肌细胞的存活率,抑制凋亡率。
曹璐[3]（2019）在《大鼠颌下腺上皮细胞放射性损伤模型的建立与评估》文中认为目的:建立放射性唾液腺损伤的细胞学模型,为后期放射性损伤唾液腺的功能修复实验研究打下细胞学基础。方法:利用组织块法与酶消化法从新生3d SD大鼠颌下腺中分离颌下腺细胞,通过胰蛋白酶差速脱壁法及传代纯化得到大鼠颌下腺上皮细胞,对其进行培养、传代;对传至P2细胞应用免疫细胞化学法进行角蛋白（CK7）鉴定;制备P2代大鼠颌下腺上皮细胞细胞悬液,利用医用电子直线加速器对细胞悬液进行不同剂量的照射（0Gy、1Gy、3Gy、5Gy、7Gy、9Gy）;通过CCK-8（Cell Counting Kit-8）技术检测各照射剂量组细胞增殖活性;使用Annexin V-FITC/PI流式细胞技术对各照射剂量组细胞凋亡情况进行检测;通过酶联免疫吸附试验（ELISA）法测定各组细胞72h后上清液中大鼠唾液淀粉酶α1（AMY1）的含量;使用糖原PAS染色法及免疫细胞化学法对各组细胞糖原分泌及E-钙黏蛋白表达能力进行评估比较。结果:1、原代SD大鼠颌下腺上皮细胞,第6天细胞镜下呈多角形,鹅卵石样排列,第14天细胞呈铺路石样;2、P2代大鼠颌下腺上皮细胞CK7阳性表达,证明细胞为上皮来源;3、放射后72h各组细胞镜下可见0Gy与1Gy组细胞无明显差异,细胞形态均一,细胞密度约90%;3Gy组细胞形态均一,细胞密度稍降低;5Gy组细胞密度进一步降低,但细胞形态尚可;7Gy与9Gy组细胞异形性大,细胞密度大幅度下降,其中9Gy组镜下极少见贴壁活细胞;4、CCK-8检测显示各组细胞在1-7天内增殖活性均先增加后降低,细胞的增殖能力随照射剂量的增加而降低,除0Gy与1Gy组增殖活性无明显统计学差异（P﹥0.05）外,剩余组间细胞增殖活性差异均具统计学意义（P﹤0.05）,其中5Gy组细胞增殖活性降至0Gy组的约53.95%;5、各组细胞流式细胞凋亡检测结果可知除0Gy与1Gy组间细胞凋亡率差异无统计学意义之外（P>0.05）,剩余各组间差异均具有统计学意义（P<0.05）,其中5Gy组细胞凋亡率明显升高至12.65±0.72%;6、各组细胞上清液中AMY1浓度随照射剂量的增加而减少,差异均具有统计学意义（P<0.05）,其中5Gy组细胞AMY1浓度降至0Gy组的约59.9%;7、各组细胞糖原染色结果见0Gy、1Gy组细胞胞质内均见大量深红色糖原颗粒,3Gy组细胞胞质内深红色糖原颗粒稍减少,5Gy、7Gy两组细胞胞质内的红色糖原颗粒明显减少且染色变浅,而9Gy组胞胞质内几乎无红色糖原颗粒;8、各组细胞E-Cad免疫细胞化学结果可见0Gy、1Gy组细胞胞浆呈深棕褐色,3Gy、5Gy组细胞胞浆棕褐色变浅,7Gy、9Gy组细胞胞浆内极少见棕褐色颗粒。结论:辐射造成大鼠颌下腺上皮细胞损伤且随辐射剂量的增加,细胞损伤程度加重,而5Gy的X线照射可能为SD大鼠颌下腺上皮细胞放射性损伤细胞学模型合适照射剂量。
金石峰[4]（2019）在《miR-494-3p靶向HTRA1调节瘢痕疙瘩成纤维细胞生物学功能及机制研究》文中研究说明目的:瘢痕一直以来都是整形外科领域的一大难题。创伤后过度的修复会导致病理性瘢痕的形成,病理性瘢痕主要包括瘢痕疙瘩和增生性瘢痕。TGF-β1是伤口愈合后强有力的生长因子,被认为是瘢痕疙瘩和其他纤维化疾病的关键调控因子,TGF-β1与TGF-β受体结合后将激活信号传导到细胞核内,激发多种信号转导途径,来调控瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖过程。HTRA1是一种热激性蛋白,属于HTRA家族成员之一。研究发现,HTRA1在肿瘤中具有剪切细胞内TGF-β1前体进而抑制TGF-β1信号通路的作用。鉴于HTRA1为TGF-β1的抑制基因,且HTRA1的异常表达与众多肿瘤有关,尽管瘢痕疙瘩没有恶性征象,但其某些特征包括超出原有创伤范围、持续性生长并极易复发等又与恶性肿瘤有一定相似性。因此,本研究旨在首先明确HTRA1在瘢痕疙瘩中的表达水平、生物学功能以及潜在作用机制。然后在前期工作的基础上。进一步研究靶向HTRA1的miRNA对瘢痕疙瘩成纤维细胞生物学功能的影响。方法:在HTRA1研究阶段,从组织水平,收集瘢痕疙瘩和正常皮肤组织各26例,应用RT-PCR、western blot和免疫组化技术检测HTRA1和TGF-β1的表达水平差异;从细胞内分子信号水平,应用细胞共培养、荧光素酶报告基因实验,研究HTRA1在瘢痕疙瘩形成过程中对TGF-β1活化的调控机制;应用慢病毒介导的基因沉默靶向抑制HTRA1或者TGF-β1,模拟靶向治疗瘢痕疙瘩的尝试,并研究HTRA1在瘢痕疙瘩中可能同时存在的TGF-β1非依赖调控机制;应用细胞衰老实验,研究HTRA1通过影响细胞衰老发挥TGF-β1非依赖的调控机制。在进一步研究HTRA1上游调控机制中,首先利用在线生物信息学软件（TargetScan,Pictar和MicroRNA）预测靶向HTRA1的miRNA,然后利用荧光素酶报告系统验证HTRA1是miR-494-3p的靶基因。在组织水平,应用RT-PCR检测miR-494-3p的表达水平。通过原代培养瘢痕疙瘩来源的成纤维细胞,采用Lipofectamine 2000转染miR-494-3p mimic和miR-494-3p inhibitor,从而过表达miR-494-3p或降低miR-494-3p表达。MTT法检测miR-494-3p不同表达水平的瘢痕疙瘩成纤维细胞活力变化。流式细胞术检测miR-494-3p不同表达水平的瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡和细胞周期的变化。Transwell侵袭实验检测miR-494-3p不同表达水平的瘢痕疙瘩成纤维细胞侵袭能力的变化。Western blot实验检测miR-494-3p不同表达水平的瘢痕疙瘩成纤维细胞胶原合成能力的变化。结果:1、Real time PCR检测结果显示,HTRA1和TGF-β1在正常组织和瘢痕疙瘩中均表达,但HTRA1和TGF-β1的mRNA表达在瘢痕疙瘩中明显高于正常皮肤,差异有统计学意义（P<0.05）。Western blot和免疫组织化学染色均可以检测到瘢痕疙瘩和正常皮肤中HTRA1和活性TGF-β1的蛋白表达,但HTRA1和活性TGF-β1的表达在瘢痕疙瘩中明显高于正常皮肤,差异有统计学意义（P<0.05）。2、正常皮肤组织和瘢痕疙瘩中均可以检测到Smad2总蛋白以及磷酸化Smad2;和正常组织相比,瘢痕疙瘩Smad2总蛋白含量没有发生明显变化,磷酸化Smad2（p-Smad2）水平显着高于正常皮肤组织,差异有统计学意义（P<0.05）。荧光素酶报告基因结果显示,活性TGF-β1可以特异性的激活PAI-1启动子介导的荧光素酶基因表达而非活性TGF-β1则不能激活荧光素酶基因的表达。单独暴露于重组人HTRA1（rhHTRA1）或非活性TGF-β1的成纤维细胞中Smad2磷酸化水平和活性TGF-β1量均明显升高,rhHTRA1和latent TGF-β1共同处理进一步增强瘢痕疙瘩成纤维细胞中Smad2的磷酸化和活性TGF-β1的含量。3、干扰HTRA1或TGF-β1明显抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖,干扰HTRA1比单独干扰下游TGF-β1对瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖具有更好的抑制效果。4、敲除HTRA1可以显着增强β-半乳糖苷酶活性,在基因敲除HTRA1的瘢痕疙瘩成纤维细胞中过表达S328A突变型HTRA1并未能逆转细胞衰老,抑制HTRA1而非TGF-β1能诱导成纤维细胞衰老。5、通过生物信息学分析我们发现瘢痕疙瘩成纤维细胞中HTRA1是miR-494-3p的潜在靶基因.荧光素酶活性结果显示,miR-494-3p能够与HTRA1 3’UTR上的结合位点结合而抑制荧光素酶的表达。6、miR-494-3p在正常皮肤组织和瘢痕疙瘩中均表达,在瘢痕疙瘩组织中的表达显着降低（P<0.05）。7、采用miR-494-3p mimic或miR-494-3p inhibitor处理瘢痕疙瘩成纤维细胞,我们发现24h后,瘢痕疙瘩细胞活力没有发生显着变化,而当培养48h和72h,miR-494-3p过表达明显抑制细胞活力,而抑制miR-494-3p则促进细胞活力,差异有统计学意义（P<0.05）。过表达miR-494-3p显着诱导瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡,而抑制其表达能够降低瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡率（P<0.05）。细胞周期分析表明,过表达miR-494-3p引起细胞在G1期和S期细胞比例降低,G2期细胞所占比例升高;而抑制miR-494-3p则导致细胞在G1期比例升高,G2期比例降低。细胞侵袭实验显示,miR-494-3p过表达显着减少穿膜细胞数量,而干扰miR-494-3p表达则增加穿膜成纤维细胞数量。我们检测胶原蛋白含量发现,miR-494-3p过表达显着降低胶原蛋白I和III的表达水平,而干扰miR-494-3p表达则增强这两种蛋白表达量。结论:1、瘢痕疙瘩中的HTRA1表达升高,一方面通过依赖于TGF-β1的方式,活化前体TGF-β1,促进成纤维细胞复制,胶原蛋白合成,另一方面通过独立于TGF-β1的方式抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞衰老,来共同促进疾病的发展。2、瘢痕疙瘩中的miR-494-3p可以通过调控其靶基因HTRA1表达,发挥抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞活力,促进细胞凋亡和细胞周期阻滞,减少细胞侵袭和胶原蛋白合成能力,从而抑制疾病的发展,miR-494-3p有望成为瘢痕疙瘩治疗的新靶点。
朱梦茹[5]（2019）在《人脂肪干细胞来源外泌体促进脂肪干细胞成骨分化的作用研究》文中进行了进一步梳理目的:提取并鉴定人脂肪干细胞（human adipose-derived stem cells,ADSCs）不同成骨分化阶段的外泌体（hADSC-Exos）,探究hADSC-Exos促进成骨分化的适宜提取时间及作用浓度,证明其能够进入hADSCs内进行调控。研究方法:酶消化法分离培养原代hADSCs并进行鉴定;超速离心法提取hADSCs未成骨诱导（Exo0）,成骨诱导114d（Exo14）及1528d（Exo28）的外泌体,并采用透射电镜,Western Blot,动态光散射法进行鉴定;使用茜素红染色检测比较3种hADSC-Exos促进原始hADSCs成骨分化的能力;PKH67标记Exo14检测hADSCs对其摄取的能力;CCK-8和划痕法分别检测三种不同浓度（10、15、20μg/ml）Exo14对hADSCs增殖及迁移能力的影响;Western Blot检测不同浓度Exo14对hADSCs成骨相关蛋白表达的作用。结果:实验所获取的hADSCs符合间充质干细胞鉴定标准。透射电镜及动态光散射结果表明所获取的外泌体具有典型的外泌体形态特征,Western Blot检测外泌体CD63,CD9呈阳性表达。茜素红染色表明培养21d后,Exo14组矿化结节含量明显高于Exo28组。PKH67标记的外泌体能够被hADSCs摄取进入细胞,聚集在细胞核周围。CCK-8表明培养24h,48h外泌体对细胞增殖能力无影响,至72h,15μg/mlExo14明显促进hADSCs增殖;划痕实验表明培养至12h外泌体组明显高于阴性对照PM组（P<0.01）,且随外泌体浓度增加促细胞迁移能力呈递减趋势但统计学分析无意义（P>0.05）。Western Blot检测共培养3d,Exo14组成骨相关蛋白ALP,RUNX2呈阳性表达,结果表示15μg/mlExo14组促RUNX2表达能力与成骨诱导液组（阳性对照组）相当,蛋白表达明显高于10μg/mlExo14组（0.583±0.045）和20μg/mlExo14（0.499±0.010）。结论:hADSCs成骨诱导114d分泌的外泌体Exo14能够被原始的hADSCs高效摄取并且进入细胞内独立作用诱导hADSCs成骨分化。较低浓度的Exo14即可促进hADSCs增殖,迁移,成骨分化,并且最适宜作用浓度为15μg/ml。
卢园[6]（2014）在《银杏叶与通心络对脑缺血再灌注后一氧化氮产生的影响》文中认为目的:本实验通过对比银杏叶提取物及通心络超微粉这两种药物对于进行脑缺血再灌注处理后的SD大鼠海马的NO（Nitric oxide,一氧化氮）产生量的影响,探讨两者的作用机制。方法:本实验选择32只成年雄性SD大鼠随机分为四组,最后总共22只入组:生理盐水组（n=8只）、7-硝基吲唑（7-Nitroindazole,7-NI）组（n=4只）、银杏叶提取物组（n=5只）以及通心络超微粉组（n=5只）。通过四血管阻断法制作大鼠脑缺血后再灌注模型:实验第1天,在苯巴比妥（40mg·kg-1）腹腔注射麻醉下,手术显露大鼠两侧的椎动脉并采用电烧灼法进行永久性闭塞;第2天,通过腹腔注射20%的乌拉坦（1.2g·kg-1）麻醉大鼠,将其仰卧位置于手术台上,在颈部正中取一长约1.5cm的切口,游离并手术显露大鼠两侧颈部血管,随后用5g重物同时悬挂在两侧宽松围绕在颈总动脉的手术线上,持续10分钟后移除,松开两侧丝线,维持灌注60min,造成大鼠前脑缺血再灌注模型。制作模型前20分钟内,各组大鼠腹腔注射相应药物。实验中,分别使用动态血压监测仪连通大鼠右侧股动脉,激光超声仪探入大鼠左侧海马区,一氧化氮监测仪定位于大鼠右侧海马区来测定并记录SD大鼠的动态血压、海马内血流量及一氧化氮浓度。结果:模型制作前,四组SD大鼠（生理盐水组、7-NI、银杏叶提取物组及通心络超微粉组）的平均动脉血压和海马的血流量及相关生理学指标的差异没有统计学意义（p>0.05）。同样,四组SD大鼠在实验前及缺血过程中及缺血再灌注时上述各组指标组内及组间相互比较均无统计学意义（p>0.05）。SD大鼠的脑缺血模型予以再灌注10分钟后,其海马内NO的表达达到一个高峰,数值分别为:对照组（2218.75±243.64）pA,7-N I 组（900 ±98.43）pA,银杏叶提取物组为（730±106.18）pA,通心络超微粉组（870 ± 127.33）pA;7-NI组和通心络超微粉组、银杏叶提取物组分别与生理盐水组相比较,NO的表达差异十分显着（p<0.001）。通心络超微粉组与7-NI两组组间相比,差异并无统计学意义（p>0.05）;但通心络超微粉组与银杏叶提取物组相比较,银杏叶提取物比通心络超微粉组对于NO在脑缺血再灌注早期的产生有更强的抑制作用,且有统计学差异（p<0.05）。结论:银杏叶提取物、通心络超微粉、7-NI均可以减少NO的产生,银杏叶提取物比通心络超微粉影响更显着,这可能是保护脑缺血再灌注损伤后的海马神经元的机制之一,并为临床神经保护治疗方法提供了一定的依据。
郭丽君[7]（2011）在《粒细胞集落刺激因子联合促红细胞生成素对脑缺血再灌注损伤的保护作用研究》文中研究表明研究背景:脑缺血发生后,尽早开通闭塞的血管,恢复血液灌流,是限制和缩小梗塞面积,改善预后的关键。但再灌注往往引起脑组织损伤的进一步加重,即再灌注损伤,导致神经细胞坏死或凋亡,神经功能障碍。超早期溶栓是目前治疗脑缺血唯一有效的措施,但太短的治疗时间窗及再灌注损伤使其临床应用受到限制;降低脑组织代谢、各种神经保护剂（自由基清除剂、钙通道阻断剂等）虽然可以在一定程度上降低患者的死亡率,但存在临床疗效不确定,不良反应严重等问题,且对于改善患者的神经功能症状,效果并不理想,究其原因是并没有从根本上解决神经细胞数量减少的问题。干细胞移植治疗脑缺血受到研究者的关注。移植的神经干细胞可在缺血脑组织局部迁移、增殖,并分化成神经元部分地替代和修复受损的神经元,从而在一定程度上改善神经功能缺失症状;然而伦理学问题、来源困难及移植后的免疫排斥反应等因素限制了其临床应用。MSCs作为目前研究最广泛的成体干细胞进入了人们的视线;但MSCs在体内向神经细胞的转化效率极低及体外扩增后的成瘤风险等,使人们不得不重新审视MSCs移植在脑缺血治疗中的作用及安全性。因此,我们迫切需要寻找新的治疗脑缺血再灌注损伤的方法,以保护和修复受损神经细胞的功能。细胞因子因其获得简便、无创伤、且有潜在的抗神经细胞凋亡和促进神经再生等作用而进入研究者的视线。粒细胞集落刺激因子（G-CSF）是粒系造血生长因子,用于各种原因引起的中性粒细胞减少症以及动员外周血干细胞移植治疗免疫性疾病。最近研究显示,脑缺血时,G-CSF能减少梗塞面积,促进神经功能恢复,可能的机制为:1、促进神经再生;2、促进神经营养因子的分泌;3、抑制细胞凋亡;4、抑制炎症反应;5、促进血管发生等。促红细胞生成素（EPO）是一种刺激骨髓造血的糖蛋白类激素,主要由成人肾脏和胎肝合成,用于各种原因引起的贫血,主要是肾性贫血的治疗。随着研究的深入,发现EPO还通过非造血相关效应在缺血所致脑损伤中发挥神经保护作用,可能通过:1、抑制细胞凋亡;2、减轻炎症反应;3、减少兴奋性氨基酸的毒性作用;4、抗氧化应激;5、促进神经和血管发生等。目前认为脑缺血的发病机制复杂,是多种机制、多个环节共同作用的结果,单靠某一种药物治疗,并不能达到最好的治疗效果,联合应用作用于脑缺血后不同环节的神经保护剂,进行多靶点、多环节的综合治疗,成为脑缺血神经保护研究的新方向。由于脑组织的功能极大程度上依赖于神经元的数量和质量,因此,如果采取措施,使缺血早期神经细胞的凋亡减少,最大限度的保存神经细胞的数量;同时缺血后期使神经细胞的再生增加,促进神经细胞的增殖、分化,必将有利于脑缺血再灌注损伤后的组织修复和功能恢复。因此,我们首次尝试将G-CSF和EPO联用,以细胞凋亡和神经再生为切入点,观察联合治疗对脑缺血再灌注损伤的保护作用。本课题采用乳鼠皮质神经元氧糖剥夺复糖、复氧模型和局灶性脑缺血再灌注大鼠模型,研究G-CSF联合EPO治疗是否具有防治脑缺血再灌注损伤,促进神经功能恢复的效应,并探讨其可能的作用机制。本实验内容可归纳成四部分,概述如下:第一部分粒细胞集落刺激因子联合促红细胞生成素对乳鼠皮质神经元氧糖剥夺模型的保护作用目的:利用体外培养的乳鼠皮质神经元制备氧糖剥夺复糖、复氧（OGD/R）模型,观察G-CSF和EPO单独或联合治疗对皮质神经元OGD/R后的保护作用。方法:体外培养乳鼠皮质神经元,建立氧糖剥夺（4h）复糖、复氧（24h）模型;研究不同浓度的G-CSF和EPO对皮质神经元的保护作用;研究最佳治疗浓度时,G-CSF和EPO单独或联合治疗对皮质神经元的保护作用,通过CCK-8分析测定细胞活力、LDH漏出量检测细胞损伤程度、AnnexinV/PI法测定细胞凋亡率、Western-blot法检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3的表达。结果:1、成功制备了乳鼠皮质神经元氧糖剥夺复糖、复氧（OGD/R）模型。2、G-CSF 0.1μg/ml、1μg/ml和10μg/ml处理组均可提高细胞活力、降低LDH漏出量,1μg/ml保护作用最强,10μg/ml保护作用略有下降。3、EPO 1U/ml、10U/ml和100U/ml处理组均可提高细胞活力、降低LDH漏出量,10U/ml和100U/ml保护作用相似。4、G-CSF和EPO联合治疗组较各单独治疗组明显提高细胞活力、降低LDH漏出量、减少细胞凋亡率（P <0.05）;与G-CSF比较,EPO的干预明显提高细胞活力、降低LDH漏出量、减少细胞凋亡率,且有统计学差异（P <0.05）。5、G-CSF和EPO联合治疗组较各单独治疗组明显增加皮质神经元Bcl-2表达、降低Caspase-3表达;与G-CSF比较,EPO的干预使Bcl-2表达增加、Caspase-3表达降低更显着（P <0.05）;G-CSF和EPO单独或联合治疗均可降低Bax表达,但三个治疗组间无明显差异。结论:G-CSF可减少皮质神经元OGD/R后的细胞损伤,最佳治疗浓度为1μg/ml。EPO可减少皮质神经元OGD/R后的细胞损伤,最佳治疗浓度为10U/ml。G-CSF联合EPO明显抑制皮质神经元OGD/R后的细胞损伤,减少细胞凋亡率,增加Bcl-2的表达、降低Bax、Caspase-3的表达。EPO干预使皮质神经元凋亡减轻更明显。第二部分粒细胞集落刺激因子联合促红细胞生成素对脑缺血再灌注大鼠的保护作用目的:通过建立局灶性脑缺血再灌注大鼠模型,在整体水平上,观察G-CSF和EPO单独或联合治疗对大鼠脑缺血再灌注后的保护作用,对联合治疗的有效性及安全性进行评价。方法:制备大脑中动脉阻断、局灶性脑缺血再灌注大鼠（I/R）模型,给予G-CSF和EPO单独或联合治疗,共5天;分别于再灌注的相应时间点进行神经功能评分、TTC染色检测梗塞面积、HE染色检测脑组织的病理改变、干湿法测定脑组织含水量、检测外周血象,实验结束时计算各组大鼠的死亡率。结果:1、成功制备局灶性脑缺血再灌注大鼠模型,制模成功率为73.9%。2、再灌注3d、7d、14d时三个治疗组神经功能评分均高于I/R组,差异有显着性（ P <0.05）;7d、14d时,联合治疗组较各单独治疗组神经功能评分明显增加,均有统计学差异（ P <0.05）;各时间点G-CSF组和EPO组比较,神经功能评分均无明显差异。3、脑梗塞灶主要位于大脑皮质及基底节区;再灌注3d、7d时,三个治疗组梗塞面积均明显小于I/R组;联合治疗组较各单独治疗组梗塞面积明显缩小,且有统计学差异（ P <0.05）;各时间点G-CSF组和EPO组比较,梗塞面积均无明显差异。4、HE染色可见I/R组脑组织水肿明显,神经细胞稀疏、间隙增大、体积变小,胞核固缩,核仁不明显,缺血中心区可见核碎裂、核溶解等细胞坏死改变、出现软化坏死灶;各治疗组神经细胞损伤明显减轻,细胞坏死有所减少、组织水肿减轻。5、I/R组大鼠于再灌注后体重明显下降,7d时体重出现回升,以后持续增加;再灌注1d、3d时三个治疗组与I/R组比较体重无明显差异,7d、14d时,三个治疗组与I/R组比较体重均有所增加（P <0.05）;各时间点三个治疗组间大鼠体重均无明显差异。6、I/R组大鼠死亡率为31.91%;三个治疗组大鼠死亡率分别为20.0%、17.94%、17.94%;三个治疗组均可降低大鼠的死亡率（P <0.05）,但三个治疗组间大鼠死亡率无明显差异。7、再灌注1d、3d时三个治疗组与I/R组比较脑组织含水量无明显差异,7d时三个治疗组均明显减少脑组织含水量（ P <0.05）;各时间点三个治疗组间脑组织含水量均无明显差异。8、各组大鼠各时间点HB、RBC、PLT均无差异;I/R组再灌注1d时WBC开始增加,7d时达到高峰,14d时有所下降;各时间点I/R组和三个治疗组间、三个治疗组间WBC均无显着性差异（P >0.05）,但均显着高于对照组（P <0.05）。结论:G-CSF联合EPO治疗明显改善大鼠的神经功能症状、减少梗塞面积、减轻脑组织病理改变、降低大鼠死亡率,对大鼠脑缺血再灌注损伤有保护作用。短期内联合使用G-CSF和EPO,对大鼠的血液指标未见显着影响,所用药物剂量安全。第三部分粒细胞集落刺激因子联合促红细胞生成素对脑缺血再灌注大鼠神经细胞凋亡影响的研究目的:观察G-CSF和EPO单独或联合治疗对脑缺血再灌注大鼠神经细胞凋亡的影响及其可能的机制。方法:分别于再灌注1d、3d、7d时,TUNEL染色检测各组大鼠缺血周围脑组织凋亡神经细胞数;免疫组化法检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3的表达;Western-blot法检测p-Akt活性。结果:1、I/R组1d时出现大量凋亡细胞,3d时凋亡细胞数达高峰,7d时下降;再灌注1d时三个治疗组与I/R组比较凋亡细胞数无明显差异;3d、7d时三个治疗组凋亡细胞数均明显低于I/R组,联合治疗组较各单独治疗组凋亡细胞数明显减少,均有统计学差异（ P <0.05）;再灌注3d、7d时,与G-CSF组比较,EPO组凋亡细胞数明显减少（均P <0.05）。2、G-CSF和EPO联合治疗组较各单独治疗组均可明显增加脑组织Bcl-2的表达、降低Caspase-3的表达;与G-CSF组比较,EPO组Bcl-2表达增加、Caspase-3表达降低更明显,且有统计学差异（P <0.05）;与I/R组比较,G-CSF和EPO单独或联合治疗均可降低脑组织Bax表达,但三个治疗组间Bax表达无明显差异。3、I/R组脑组织p-Akt活性明显升高;与I/R组比较,三个治疗组均可增加p-Akt的活性,联合治疗组较各单独治疗组p-Akt的活性明显增加（P <0.05）;G-CSF组与EPO组比较, p-Akt活性无明显差异。结论:G-CSF联合EPO治疗显着减少缺血再灌注引起的神经细胞凋亡,增加缺血周围脑组织Bcl-2的表达、抑制Bax、Caspase-3的表达;联合治疗可能部分通过激活PI-3K/Akt途径发挥协同的抗凋亡作用。EPO在抑制神经细胞凋亡方面作用显着。第四部分粒细胞集落刺激因子联合促红细胞生成素对脑缺血再灌注大鼠神经再生作用的研究目的:观察G-CSF和EPO单独或联合治疗对脑缺血再灌注大鼠神经细胞增殖、分化及神经营养因子表达的影响。方法:通过Brdu标记增殖细胞,分别于再灌注1d、3d、7d、14d时,采用荧光单染法检测各组大鼠缺血周围脑组织Brdu阳性细胞数;免疫荧光双标法检测Brdu/NeuN、Brdu/GFAP双阳性细胞数;RT-PCR法检测神经营养因子BDNFmRNA、NGFmRNA的表达。结果:1、I/R组1d时可见散在的BrdU阳性细胞,7d时阳性细胞数达高峰,14d时下降;再灌注1d、3d时三个治疗组间及与I/R组间BrdU阳性细胞数均无明显差异;7d、14d时三个治疗组BrdU阳性细胞数均高于I/R组,联合治疗组较各单独治疗组BrdU阳性细胞数明显增加（P <0.05）;再灌注7d、14d时,与EPO组比较,G-CSF组BrdU阳性细胞数明显增加（均P <0.05）。2、I/R组可见少量BrdU/NeuN和BrdU/GFAP双阳性细胞;三个治疗组BrdU/NeuN和BrdU/GFAP双阳性细胞数均明显高于I/R组;联合治疗组较各单独治疗组BrdU/NeuN和BrdU/GFAP双阳性细胞数均明显增加,且有统计学差异（P <0.05）;与EPO组比较,G-CSF组BrdU/NeuN和BrdU/GFAP双阳性细胞数均明显增加（ P <0.05）。3、I/R组脑组织中BDNFmRNA表达明显增加;与I/R组比较,三个治疗组BDNFmRNA表达均明显升高（P <0.05）;但三个治疗组间表达无明显差异。4、I/R组脑组织中NGFmRNA表达明显增加;与I/R组比较,三个治疗组NGFmRNA表达均明显增加（P <0.05）;联合治疗组较各单独治疗组NGFmRNA表达增加显着;与EPO组比较,G-CSF组NGFmRNA表达有显着增加（P <0.05）。结论:G-CSF联合EPO治疗明显促进大鼠缺血周围脑组织神经细胞的增殖,及向神经元和神经胶质细胞发生分化,同时促进神经营养因子BDNFmRNA、NGFmRNA的表达增加。G-CSF在促进神经细胞再生方面作用显着。
尹艳艳[8]（2008）在《黄芪总苷对脑缺血/再灌注损伤的保护作用及其作用机制研究》文中研究表明缺血性脑血管病（Ischemic Cerebrovascular Disease,ICVD）是由脑部血液循环障碍,导致以局部神经功能损伤、缺失为特征的一组疾病。ICVD具有发病率高、致残率高、死亡率高、复发率高和并发症多等特点,是引起人类致残、死亡的最主要疾病之一,给人类的身体健康造成了极大的伤害。因此,寻找与开发防治缺血性脑血管病的理想药物己日益受到国内外的广泛重视,成为当前医药学界工作者特别关注的研究课题。黄芪是我国传统中药,为豆科植物蒙古黄芪（Astraglus membranaceus Bge. var monghaalicus Hsiao）或膜荚黄芪（A. membranaceus Bge）的干燥根,其中含有皂苷类、黄酮类及苷类、糖类、多种氨基酸及微量元素。黄芪总苷（Astragalosides,AST）作为其主要成分具有抗氧化、免疫调节、促智等作用,临床常用于防治心脑血管疾病、促智、延缓衰老、免疫功能紊乱性疾病和抗肿瘤等多种疾病。本课题采用大鼠线栓法制作局灶性脑缺血再灌注模型和海马神经元缺氧/复氧模型,从以下几个方面对黄芪总苷进行研究,以探讨其对脑缺血再灌注损伤后神经功能和学习记忆功能恢复的保护作用及其机制。第一部分黄芪总苷对脑缺血再灌注损伤大鼠学习记忆功能的影响及其作用机制研究在MCAO大鼠模型上,研究了AST对脑缺血再灌注后7d大鼠学习记忆功能的影响及其机制。采用Morris水迷宫,观察AST对逃避潜伏期和游泳距离的影响;采用免疫组化的方法检测NGF和BDNF蛋白的表达;采用Western blot检测p-ERK1/2、p-JNK和p-Akt活性。实验结果显示:与模型组比较,AST（80mg/kg）可以明显缩短5d、6d和7d逃避潜伏期和游泳距离,AST（40mg/kg）可以缩短6d和7d的潜伏期和5d、6d和7d的游泳距离,AST（20mg/kg）可以缩短7d的潜伏期和6d和7d的游泳距离。AST（20,40、80mg/kg）可以增加NGF和BDNF蛋白的表达;AST（40、80mg/kg）可以上调p-ERK和p-Akt的表达、下调p-JNK的表达,可能是其发挥脑保护作用的机制之一。第二部分黄芪总苷对脑缺血再灌注大鼠的保护作用及其作用机制研究在MCAO大鼠模型上,研究了AST对脑缺血再灌注后1d、3d、7d和14d大鼠的保护作用及其机制。观察了AST对模型大鼠体重、神经功能评分、脑指数、脑含水量和脑梗死体积的影响;检测脑组织中超氧化物歧化酶（SOD）、乳酸脱氢酶（LDH）和一氧化氮合酶（NOS）活性,丙二醛（MDA）、乳酸（LD）和一氧化氮（NO）含量;采用苏木素-伊红（HE）染色观察脑组织病理改变;采用RT-PCR检测iNOSmRNA、NGFmRNA、BDNFmRNA和p75NTRmRNA的表达;采用real-time PCR检测TrkAmRNA和TrkBmRNA的表达。实验结果如下:1脑缺血再灌注后1d、3d、7d和14d模型组大鼠体重均有明显降低,AST（40mg/kg,ig）3d、7d和14d可以明显升高降低的模型大鼠体重。2模型大鼠在缺血再灌注1d时,神经功能评分最高,然后逐渐降低,14d时基本恢复正常;AST（40mg/kg,ig）3d可以明显降低模型大鼠升高的神经功能评分。3脑缺血再灌注后1d、3d和7d模型组大鼠脑指数均有明显增高,14d模型组大鼠脑指数恢复至正常;AST（40mg/kg,ig）3d和7d可以明显降低脑指数的增加。4脑缺血再灌注后1d模型组大鼠脑含水量已经明显增加,随着再灌注的进行,含水量逐步增加,在再灌注3d达到高峰,然后开始下降,7d仍有增加,至14d已经恢复正常。AST（40mg/kg,ig）3d和7d可以明显减轻大鼠缺血再灌注后脑组织含水量的增加。5脑缺血再灌注后出现明显的梗死灶,缺血再灌注3d时脑梗死体积最大。AST （40mg/kg,ig）3d、7d和14d可以明显减轻大鼠缺血再灌注后脑梗死体积。6脑缺血再灌注后1d、3d和7d模型组大鼠脑组织SOD活力明显降低和MDA含量明显升高;AST（40mg/kg,ig）3d、7d可以明显升高SOD活性、降低脑组织中MDA含量。7脑缺血再灌注后1d、3d和7d模型组大鼠脑组织LDH活力明显下降、LD含量明显升高,至14d基本恢复到正常水平;AST（40mg/kg,ig）3d、7d可以明显升高脑组织中LDH活性、降低脑组织中LD含量。8脑缺血再灌注后1d、3d和7d模型组大鼠脑组织NO含量、NOS活力明显升高,至14d基本恢复到正常水平;AST（40mg/kg,ig）3d、7d可以明显降低脑组织中NO含量和NOS活性。9脑缺血再灌注后1d、3d和7d模型组大鼠脑组织iNOSmRNA表达明显升高,至14d基本恢复到正常水平;AST（40mg/kg,ig）3d、7d可以明显降低脑组织中iNOSmRNA表达。10 AST（40mg/kg,ig）3d、7d和14d可以不同程度的减轻脑缺血再灌注大鼠脑组织的病理损害。11脑缺血再灌注后1d、3d、7d和14d模型组大鼠脑组织NGFmRNA表达明显升高,7d达到高峰;AST（40mg/kg,ig）3d、7d和14d可以明显升高脑组织中NGFmRNA。12脑缺血再灌注后1d、3d、7d和14d模型组大鼠脑组织BDNFmRNA表达明显升高,3d达到高峰;AST（40mg/kg,ig）3d、7d和14d可以明显升高脑组织中BDNFmRNA。13脑缺血再灌注后1d、3d和7d模型组大鼠脑组织p75NTRmRNA表达明显升高,3d达到高峰,14d基本恢复正常;AST（40mg/kg,ig）3d和7d可以明显降低脑组织中p75NTRmRNA。14缺血再灌注后1d、3d和7d模型组大鼠脑组织TrkAmRNA表达明显升高,7d达到高峰,14d基本恢复正常;AST（40mg/kg,ig）7d和14d可以明显升高脑组织中TrkAmRNA。15缺血再灌注后1d、3d和7d模型组大鼠脑组织TrkBmRNA表达明显升高,7d达到高峰,14d基本恢复正常;AST（40mg/kg,ig）3d和7d可以明显升高脑组织中TrkBmRNA。第三部分黄芪总苷对海马神经元缺氧复氧损伤的保护作用及其作用机制研究在原代培养的海马神经元缺氧/复氧（A/R）模型上,研究了AST对A/R诱导的海马神经元损伤的保护作用及其作用机制。采用MTT和LDH释放率法,检测海马神经元的活力;检测细胞上清液中SOD活性、MDA和NO含量;采用荧光素染料Hoechst33258染色法,测定海马神经元凋亡;采用Annexin-V/PI双染法,在流式细胞仪上检测细胞凋亡;采用Fluo-3/AM染色,测定海马神经元内[Ca2+]i的变化。结果显示,缺氧复氧组海马神经元活力明显降低;缺氧前加入AST（10、20、40μg/ml）可以明显提高海马神经元的活力,缺氧后复氧前加入AST（40μg/ml）可以提高海马神经元的活力。A/R组海马神经元LDH的释放率明显升高;AST（10、20、40μg/ml）可以明显降低A/R后海马神经元的LDH释放率。A/R后海马神经元培养上清液中SOD活性明显降低,MDA、NO含量明显升高; AST（10、20、40μg/ml）可以明显升高上清液中SOD活性、降低MDA和NO含量。A/R组表现出明显的细胞凋亡;与A/R组比较,AST（10、20、40μg/ml）可以明显减轻缺氧复氧后海马神经元的凋亡率,显着降低胞浆内钙离子的平均荧光强度。结论:本文研究了黄芪总苷对脑缺血再灌注损伤后的神经保护作用和对学习记忆功能的影响,并对其作用机制进行了探索。研究发现黄芪总苷对脑缺血再灌注损伤后的学习记忆功能有明显的保护作用,其作用机制涉及抗氧化、促进NGF、BDNF及其高亲和力受体TrkA、TrkB的表达、抑制低亲和力受体p75NTR的表达、抑制细胞凋亡、上调p-ERK和p-Akt的表达、下调p-JNK的表达等有关。
任秀君[9]（2007）在《针刺对高血脂合并脑缺血大鼠神经干细胞和神经营养因子的影响》文中提出研究目的:高脂血症（hyperlipidemia,HLP）由血中脂蛋白合成与清除紊乱所致,表现为血浆脂蛋白异常、血脂增高等,属于祖国医学的“痰浊”“瘀血”范畴。它是动脉粥样硬化等心脑血管疾病发生的重要危险因素,有效地防治HLP是防治心脑血管疾病的重要途径。脑血管疾病是目前严重危害人类健康的主要疾病之一。在我国死于脑血管病者居三大死因首位。其中缺血性脑血管疾病占60%～80%。脑血管病具有发病率高、致残率高、死亡率高的“三高”特点,是威胁人类尤其是中老年人健康的常见病、多发病。为了减少和延缓中风的发生,减轻中风后机体状态,从高血脂阶段早期进行针刺干预,是针刺防治中风的新视角,具有重要流行病学研究意义。高血脂与中风,神经干细胞与神经营养因子之间的关系是目前研究尚未进行探讨的部分,本研究试图通过建立高血脂合并脑缺血动物模型,并观察针刺的影响,探讨在高血脂阶段积极早期进行针刺干预,是否可通过升高神经营养因子的合成与分泌,从而促进神经干细胞的增殖、迁移和分化,促进脑损伤的修复和再生。研究方法:应用大鼠喂养经典高脂饲料,化学诱导大脑中动脉血栓闭塞制造高血脂合并脑缺血模型。将动物随机分为八组:正常对照组、高血脂模型组、高血脂治疗组、脑缺血模型组、脑缺血治疗组、高血脂合并脑缺血模型组、高血脂合并脑缺血治疗Ⅰ、Ⅱ组。高血脂治疗组用电针三阴交、丰隆穴治疗10天。脑缺血治疗组用针刺人中、百会穴治疗7天。高血脂合并脑缺血治疗Ⅰ、Ⅱ组,先给大鼠喂养高脂饲料造成高血脂模型,治疗Ⅰ组电针三阴交、丰隆穴10天后,两组同时电针三阴交、丰隆穴,针刺人中、百会穴,7天后处死。正常对照组和模型组均不针刺。用生化方法检测各组治疗前后血脂四项。应用神经行为学指标观察治疗前后神经症状的改善情况。实验结束用免疫组化方法检测海马区和额叶皮层脑缺血病理改变、室管膜下区和大脑额叶皮层nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1表达情况。用酶联免疫法（ELISA）检测右侧大脑匀浆中神经元特异性烯醇化酶（NSE）、神经生长因子（NGF）、脑源性神经营养因子（BDNF）、碱性成纤维生长因子（bFGF）浓度。实验结果:1高血脂合并脑缺血模型的建立本实验选用经典高脂饲料喂养6周造成高脂血症大鼠模型,在此基础上用大脑中动脉FeCl3刺激血栓性闭塞法造成局灶性脑缺血,最终造成高血脂合并脑缺血模型。预实验结果显示,与同时段正常对照组比较,高血脂组4周、6周CHO、LDL-C、TG升高有显着差异,P<0.01,HDL-C没有显着差异。说明高脂饲料喂养4-6周可以造成大鼠高血脂模型。由于高血脂形成时间较长,饲养6周的高血脂症大鼠模型更近似于人类高血脂症的病理变化,正式实验定为6周。正式实验,42天,高脂饮料喂养的各组大鼠的CHO和LDL-C、TG与正常对照组大鼠比较,升高有显着性差异,P<0.01。HLD-C降低有显着性差异,P<0.01。证明高血脂症大鼠造模成功,可以进行实验。52天脑缺血造模后,在MCAO清醒（术后约1h）后,在1～2h内观察模型动物有脑缺血模型出现的神经功能缺失症状,各组大鼠在造模后1～2h的神经症状行为在评定上均有阳性反应,与正常对照组比较均有显着性差异p<0.01。HE染色结果可见,实验组动物脑缺血造模后,缺血灶出现在额叶,位置比较恒定,缺血灶内细胞排列散乱,并见大量神经元变性坏死,出现脑水肿表现,海马区大量神经元变性坏死,排列紊乱,各组有不同程度的神经元脱失现象等病理改变,说明本实验的脑缺血模型制作是成功的。本实验首次建立高血脂合并脑缺血的动物模型,此模型成功率高,死亡率小,重复性好,充分模拟了人类疾病的病理及生理改变。2正常大鼠血脂、HE染色结果、神经干细胞、NSE、神经营养因子的表达正常大鼠CHO 51.92±9.46mg/dL, HDL-C 26.80±8.16 mg/dL,LDL-C 30.50±8.19 mg/dL,TG47.98±12.18 mg/dL。HE染色结果显示,大鼠右侧海马区和额叶皮层神经细胞排列清楚,细胞形态清晰。神经干细胞标志,nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1阳性细胞,在正常大鼠右侧脑内表达较少,在前脑背外侧伸展、侧脑室外侧壁可观察到散在的nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1的阳性细胞（背外侧伸展nestin:阳性细胞数63±9.40;面密度0.62±0.10%;光密度0.50±0.03%。PCNA:阳性细胞数185±10.60;面密度1.93±0.11%;光密度1.22±0.07%。vimentin:阳性细胞数95±6.31;面密度0.61±0.04%;光密度0.34±0.02%。Tuj-1:阳性细胞数56±7.69;面密度0.96±0.13%;光密度0.22±0.03%。侧脑室外侧壁:nestin:阳性细胞数41±5.61;面密度0.35±0.05%;光密度0.23±0.03%。PCNA:阳性细胞数114±22.79;面密度1.25±0.25%;光密度0.94±0.19%。vimentin:阳性细胞数48±11.85;面密度1.05±0.26%;光密度0.58±0.14%。Tuj-1:阳性细胞数35±4.69;面密度0.88±0.12%;光密度0.45±0.06%。）正常对照组大脑右侧额叶皮层相应区域表达更少。（nestin:阳性细胞数14±3.47;面密度0.11±0.03%;光密度0.09±0.02%。PCNA:阳性细胞数58±6.52;面密度0.64±0.07%;光密度0.39±0.04%。vimentin:阳性细胞数56±6.46;面密度0.22±0.03%;光密度0.11±0.01%。Tuj-1:阳性细胞数13±5.14;面密度0.08±0.03%;光密度0.05±0.02%。）右侧大脑匀浆中NSE（41.70±3.47 ng/dL）及神经营养因子NGF（79.36±7.07 pg/ml）、BDNF（5.66±0.86μg/L）、bFGF（51.20±6.05 ng/L）含量呈基础表达。3针刺对实验性高血脂大鼠的治疗作用3.1针刺对实验性高血脂大鼠血脂的作用经针刺治疗后,和高血脂模型组相比,高血脂治疗组大鼠的CHO、LDL-C、TG降低有极显着差异,P<0.01。HLD-C升高有极显着差异,P<0.01。说明针刺能降低实验性高血脂大鼠CHO、LDL-C、TG,升高HLD-C,调节血脂水平。3.2针刺对实验性高血脂大鼠右侧大脑SVZ和额叶皮层神经干细胞的作用nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1在实验性高血脂造模后大鼠脑内表达较少,在室管膜下区SVZ、背外侧角可观察到散在的nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1的阳性细胞,额叶皮质表达更少,与正常对照组相比,其阳性细胞数、面密度、光密度没有显着差异,P>0.05。针刺对实验性高血脂大鼠nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1表达影响不大。3.3针刺对高血脂大鼠右侧脑组织匀浆中NSE的作用高血脂造模后,右侧脑匀浆中NSE浓度与正常脑匀浆中NSE浓度没有显着差异,P>0.05,说明高血脂本身不能影响右侧脑组织中NSE的分泌与合成。高血脂大鼠治疗组和模型组之间没有显着差异,说明针刺不能影响实验性高血脂大鼠NSE的分泌。3.4针刺对实验性高血脂大鼠右侧脑组织匀浆中神经营养因子的作用与正常对照组比较,高血脂模型组大鼠大脑匀浆中NGF、BDNF、bFGF含量明显降低,P<0.05或P<0.01;与高血脂模型组比较,针刺治疗组BDNF显着升高,P<0.05,NGF、bFGF没有显着差异,P>0.05,但有升高的趋势。实验结果提示高血脂可降低大鼠大脑中NGF、BDNF、bFGF的分泌与合成,针刺可升高高血脂状态某些神经营养因子的含量,如BDNF。4针刺对实验性脑缺血大鼠的治疗作用4.1针刺对实验性脑缺血大鼠脑缺血后神经行为评分和脑缺血病理改变的作用59天,与正常对照组比较,脑缺血模型组和脑缺血治疗组神经症状评分升高有极显着性差异,p<0.01;与脑缺血模型对照组比较,脑缺血治疗组的神经症状评分降低有极显着性差异,p<0.01。HE染色结果显示,脑缺血治疗组缺血区周围组织水肿减轻,无明显的细胞空泡变性,细胞核正常。海马CA3区结构完整的神经细胞明显增多,变性坏死细胞较少,细胞周围间隙明显缩小,血管病变主要以内皮细胞肿胀,空泡形成为主。说明针刺治疗对局灶性脑缺血大鼠具有显着的治疗作用。4.2针刺对实验性脑缺血大鼠脑缺血后缺血侧SVZ和额叶皮层神经干细胞的作用脑缺血后,大鼠缺血侧前脑室管膜下区（背外侧伸展、侧脑室外侧壁）、缺血区额叶皮层nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1强表达,并有多层阳性细胞,背外侧角可见大量的nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1阳性细胞,并向外形成了背外侧伸展,脑缺血区可见散在的nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1表达。与正常对照组比较,脑缺血模型组、治疗组nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1阳性细胞个数、面密度、光密度升高均有极显着差异,P<0.01;与脑缺血模型组比较,脑缺血治疗组各项升高均有极显着差异,P<0.01。脑缺血后存在神经干细胞的增殖,并有一部分神经干细胞有向胶质细胞和神经元祖细胞定向分化的趋向。针刺后各项指标高于脑缺血组。说明针刺可提高实验性脑缺血大鼠大脑侧脑室背外侧伸展、侧脑室外侧壁、缺血区nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1的表达。针刺结果显示,针刺可促进大脑SVZ和额叶皮层神经干的增殖,并能促进神经干细胞向胶质细胞和神经元祖细胞定向分化,同时可能促进神经干细胞从SVZ区向缺血区迁移。4.3针刺对实验性脑缺血大鼠缺血侧脑组织匀浆中NSE的作用与正常组相比,脑缺血模型组大脑匀浆中NSE含量明显上升,有极显着性差异,P<0.01;与脑缺血模型组相比,脑缺血治疗组大脑匀浆中NSE含量降低有极显着差异,P<0.01。实验结果提示:脑缺血后,脑匀浆中NSE浓度显着升高,说明出现脑损伤。针刺可降低NSE浓度,从而减轻脑损伤。4.4针刺对实验性脑缺血大鼠脑缺血后缺血侧脑组织匀浆中神经营养因子的作用与正常组相比,脑缺血模型组缺血侧脑组织匀浆中NGF、BDNF、bFGF含量明显上升,有显着性差异,P<0.05;与脑缺血模型组相比,脑缺血治疗组缺血侧脑组织匀浆中NGF、bFGF含量升高有显着差异,P<0.05或P<0.01。实验结果提示脑缺血后,缺血侧脑组织匀浆中NGF、BDNF、bFGF浓度显着升高,说明脑缺血后,自身可分泌神经营养因子,从而产生一定的脑保护作用。针刺可通过促进缺血侧大脑NGF、bFGF的分泌与合成,加强脑保护作用。5针刺对实验性高血脂合并脑缺血大鼠的治疗作用5.1针刺对实验性高血脂合并脑缺血大鼠血脂的作用经针刺治疗后,与正常对照组比较,高血脂合并脑缺血模型组、高血脂合并脑缺血模型治疗Ⅰ组、Ⅱ组CHO、LDL-C升高有极显着性差异,P<0.01;高血脂合并脑缺血模型组、高血脂合并脑缺血模型治疗Ⅱ组TG升高,有极显着性差异,P<0.01;与高血脂合并脑缺血模型组比较,治疗Ⅰ组CHO、TG、LDL-C降低有显着性差异,P<0.01或P<0.05,治疗Ⅱ组没有显着差异,P>0.05;与治疗Ⅰ组比较,治疗Ⅱ组CHO、LDL-C、TG没有显着差异,P>0.05;HDL-C,各组之间比较没有显着差异,P>0.05,但与42天比较,治疗Ⅰ组HDL-C升高有显着差异,P<0.01。本实验表明,针刺可降低高血脂合并脑缺血大鼠CHO、TG、LDL-C水平,升高HDL-C水平,高血脂合并脑缺血模型治疗治疗Ⅰ组疗效好于治疗Ⅱ组,从而说明从高血脂阶段积极介入针刺治疗,可更好、更有效地调节血脂水平。5.2针刺对实验性高血脂合并脑缺血脑缺血后神经行为评分和脑缺血病理改变的作用与合并模型组比较,合并治疗组神经症状评分显着降低,p<0.05;与合并治疗Ⅰ组比较,Ⅱ组没有显着差异,p>0.05,说明针刺治疗对局灶性脑缺血大鼠具有显着的治疗作用。针刺后缺血区HE结果显示,针刺后缺血区周围组织水肿减轻。高血脂合并脑缺血治疗Ⅰ组水肿程度最轻,无明显的细胞空泡变性,细胞核正常。海马CA3区结构完整的神经细胞明显增多,变性坏死细胞较少,细胞周围间隙明显缩小,血管病变主要以内皮细胞肿胀,空泡形成为主。说明电针在高血脂成模后积极治疗可减轻脑损害。5.3针刺对实验性高血脂合并脑缺血大鼠缺血侧SVZ和额叶皮层神经干细胞的作用高血脂合并脑缺血模型组前脑侧脑室背外侧伸展、侧脑室外侧壁、额叶缺血区nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1阳性细胞的表达弱于单纯脑缺血模型组。与正常对照组比较,高血脂合并脑缺血模型组、高血脂合并脑缺血治疗Ⅰ组、Ⅱ组阳性细胞个数、面密度、光密度升高均有极显着差异,P<0.01;与高血脂合并脑缺血模型组比较,高血脂合并脑缺血治疗Ⅰ组、Ⅱ组阳性细胞个数、面密度、光密度升高均有极显着差异,P<0.01;与高血脂合并脑缺血治疗Ⅰ组比较,高血脂合并脑缺血Ⅱ组各项降低有极显着差异,P<0.01。实验结果提示高血脂可减弱脑缺血后nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1阳性细胞的表达。即高血脂可减弱脑缺血后神经干细胞的增殖,迁移和分化。针刺可提高高血脂合并脑缺血模型大鼠大脑侧脑室背外侧伸展、侧脑室外侧壁、缺血区nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1的表达。高血脂合并脑缺血治疗Ⅰ组比Ⅱ组各项表达要强,说明在高血脂阶段介入治疗,更能提高nestin、PCNA、vimentin、Tuj-1表达。针刺结果显示,针刺可促进高血脂合并脑缺血模型大鼠大脑SVZ和额叶皮层神经干的增殖,并能促进神经干细胞向胶质细胞和神经元祖细胞定向分化,同时可能促进神经干细胞从SVZ区向缺血区迁移。说明在高血脂阶段介入治疗,更能促进神经干细胞的增殖,分化和迁移。5.4针刺对实验性高血脂合并脑缺血大鼠缺血侧脑组织匀浆中NSE的作用与正常对照组和脑缺血模型组比较,高血脂合并脑缺血模型组大脑匀浆中NSE含量显着上升,有显着性差异,P<0.05,P<0.01。与正常对照组相比,合并各组缺血侧大脑匀浆中NSE含量明显上升,有极显着性差异,P<0.01;与合并模型组比较,合并治疗Ⅰ组、Ⅱ组下降有显着差异P<0.01,P<0.05;与高血脂合并脑缺血模型治疗Ⅰ组比较,Ⅱ组升高有显着差异P<0.05。实验结果提示,高血脂合并脑缺血可加重脑缺血后脑损伤,针刺可减低高血脂合并脑缺血大鼠的脑损伤,尤其在高血脂阶段介入针刺治疗的治疗Ⅰ组疗效远远好于治疗Ⅱ组。5.5针刺对实验性高血脂合并脑缺血大鼠缺血侧脑组织匀浆中神经营养因子的作用与正常对照组、脑缺血模型组比较,高血脂合并脑缺血模型组NGF、BDNF、bFGF降低有极显着差异,P<0.01;与高血脂合并脑缺血模型组比较,治疗Ⅰ组和治疗Ⅱ组NGF、bFGF上升有显着差异P<0.01;与高血脂合并脑缺血治疗Ⅰ组比较,Ⅱ组NGF、BDNF降低有显着差异P<0.01。实验结果提示:高血脂可降低脑缺血后脑自身的保护作用,针刺可通过促进NGF、BDNF、bFGF的分泌和合成,从而起到脑保护的作用。针刺治疗Ⅰ组的NGF、BDNF高于Ⅱ组,说明在高血脂阶段积极进行针刺治疗可更好的提高神经营养因子分泌,从而起到脑保护的作用。实验结论:1高血脂合并脑缺血模型的建立是成功的。2高血脂本身并不能影响实验性高血脂大鼠右侧室管膜下区和右侧额叶皮层神经干细胞的增殖、迁移与分化,和右侧脑匀浆中NSE的表达,但能降低右侧大脑匀浆中神经营养因子,如NGF、BDNF、bFGF的分泌。3脑缺血能增强实验性脑缺血大鼠缺血侧室管膜下区和额叶皮层神经干细胞的增殖、迁移与分化,促进缺血侧脑组织中NSE的分泌,促进缺血侧脑组织中NGF、BDNF、bFGF的分泌与合成。4高血脂合并脑缺血,可减弱脑缺血后室管膜下区和右侧额叶皮层神经干细胞的增殖、迁移与分化,促进缺血侧脑组织NSE的分泌,降低缺血侧脑组织NGF、BDNF、bFGF的分泌,减弱大脑的自我保护作用。5针刺“丰隆”、“三阴交”,可降低实验性高血脂大鼠CHO、TG、LDL-C,升高HDL-C水平。针刺不能影响实验性高血脂大鼠高血脂后大脑右侧室管膜下区和额叶皮层神经干细胞的增殖、迁移与分化,和右侧脑组织中NSE的分泌,但能促进右侧脑组织中BDNF的分泌与合成。6针刺“百会”“人中”可改善实验性脑缺血大鼠神经行为症状评分,改善脑缺血状态,降低缺血侧NSE的分泌,增强实验性脑缺血大鼠缺血侧大脑室管膜下区和额叶皮层神经干细胞的增殖、迁移与分化,促进大脑缺血侧脑组织NGF、bFGF的分泌与合成。7针刺可降低高血脂合并脑缺血大鼠CHO、TG、LDL-C水平,升高HDL-C水平,改善高血脂合并脑缺血模型大鼠神经行为症状评分,改善脑缺血状态,可提高高血脂合并脑缺血后缺血侧室管膜下区和缺血区神经干细胞的增殖、迁移与分化,降低缺血侧脑组织中NSE的分泌,促进缺血侧脑组织中神经营养因子NGF、BDNF、bFGF的分泌与合成。8从高血脂阶段积极介入针刺治疗,可更好、更有效地调节血脂水平,改善脑缺血状态,明显提高高血脂合并脑缺血后缺血侧室管膜下区和缺血区神经干细胞的增殖、迁移与分化,降低缺血侧大脑NSE的分泌,促进缺血侧大脑匀浆中神经营养因子NGF、BDNF、bFGF的分泌与合成。9针刺能通过促进缺血侧脑组织NGF、BDNF、bFGF的分泌,降低NSE分泌,促进神经干细胞的增殖、迁移和分化,从而促进神经元的修复和再生。综上所述本实验结果显示,神经营养因子和神经干细胞增殖、迁移、分化之间存在必然联系。在实验性脑缺血和实验性高血脂合并脑缺血大鼠脑缺血造模后,神经营养因子含量的升高,往往同神经干细胞的增殖同时出现,所以猜测本实验脑缺血后是神经营养因子的升高促进了神经干细胞的增殖、迁移和分化。实验结果表明,针刺作为一种治疗手段在一定程度上促进了神经营养因子的分泌,从而最终促进了脑缺血后神经干细胞增殖、迁移、分化,尤其在高血脂阶段针刺治疗可减轻脑缺血后损伤,促进神经元的修复与再生。
张凯[10]（2006）在《兔血管化自体移植颌下腺细胞凋亡的实验研究》文中进行了进一步梳理研究背景:血管化自体颌下腺移植是治疗重症角结膜干燥症的一种有效方法,多数患者术后眼干的症状得到有效缓解。但部分移植腺体于术后1周左右会进入“休眠期”,分泌减少,易导致导管阻塞;而度过“休眠期”的腺体,有一部分出现泪溢或分泌不足,影响治疗效果。血管化自体颌下腺移植首先经历了缺血再灌注的过程,之后则是一个失神经支配的过程。近年来,已有研究表明缺血再灌注损伤及失神经支配与细胞凋亡有密切关系,但是目前对血管化自体移植颌下腺细胞凋亡的相关研究尚未见报道。研究目的:研究血管化自体颌下腺移植术后颌下腺细胞的凋亡。研究方法:建立家兔血管化自体颌下腺移植动物模型,于移植术后1、3、7、30、60、90天取腺体,称重,光镜及透射电镜观察移植腺体组织学形态特征,免疫组化法及蛋白质免疫印迹法检测caspase3的表达。研究结果:1.移植术后第7天腺体重量明显下降,移植术后第30天腺体重量下降至最低点。2.光镜观察可见移植后早期腺体实质部分萎缩样改变。3.电镜观察正常腺体腺细胞锥体形,核椭圆形位基底1/3处,胞浆内充满大小不等的低电子密度分泌颗粒,移植术后第7天腺细胞可见核染色质边聚、凋亡小体形成、细胞膜呈泡状等典型的凋亡特征。4.免疫组化染色可见在移植术后第7天caspase3（p20）表达较对照组明显增加,阳性细胞数量明显增加,阳性细胞呈灶状分布,主要分布于腺泡细胞。5.蛋白质免疫印迹分析可见caspase3（p20）活化片段在移植7天表达较对照组上调79%,p<0.01。研究结论:1.自体移植后家兔颌下腺发生的萎缩,可能是“休眠期”的病理基础。2.血管化自体移植颌下腺早期发生了腺泡细胞凋亡。
二、颌下腺缺血再灌注后细胞凋亡与增殖的研究中国医科大学第一临床学院整形外科（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、颌下腺缺血再灌注后细胞凋亡与增殖的研究中国医科大学第一临床学院整形外科（论文提纲范文）
（1）降钙素基因相关肽（CGRP）通过调控Akt/mTOR信号通路介导的凋亡和自噬减轻创伤性颅脑损伤的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 创伤性颅脑损伤患者血清CGRP水平及与预后的关系 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 降钙素基因相关肽(CGRP)对创伤性颅脑损伤模型小鼠的神经功能保护作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 降钙素基因相关肽(CGRP)对创伤性颅脑损伤后神经元细胞自噬和凋亡的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分 AKT/mTOR信号通路参与了外源性CGRP对神经元细胞自噬和凋亡的调控 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述一 自噬和凋亡在颅脑创伤治疗中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 降钙素基因相关肽CGRP在神经系统疾病中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）双参通脉颗粒对心肌缺血再灌注大鼠NF-κB信号通路影响的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 论文一 双参通脉颗粒对心肌缺血再灌注大鼠心功能的保护作用 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文二 双参通脉颗粒通过NF-κB信号通路对心功能的保护作用 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文三 双参通脉颗粒含药血清对乳大鼠心肌细胞模型NF-κB信号通路的影响 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
（3）大鼠颌下腺上皮细胞放射性损伤模型的建立与评估（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 实验流程图 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 附件 |
（4）miR-494-3p靶向HTRA1调节瘢痕疙瘩成纤维细胞生物学功能及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:HTRA1抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞衰老的机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 标本来源 |
| 2.2 主要试剂和仪器 |
| 2.2.1 主要试剂 |
| 2.2.2 主要仪器和设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 制备石蜡切片 |
| 2.3.2 免疫组化 |
| 2.3.3 免疫印迹(Western Blot) |
| 2.3.4 Real time PCR |
| 2.3.5 原代细培养 |
| 2.3.6 分组 |
| 2.3.7 PAI-1 启动子介导的荧光素酶报告基因实验检测TGF-β1 活性 |
| 2.3.8 shRNA设计和细胞转染 |
| 2.3.9 细胞增殖检测 |
| 2.3.10 细胞衰老试验 |
| 2.3.11 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 HTRA1和TGF-β1 在瘢痕疙瘩和正常组织中表达水平检测 |
| 3.2 瘢痕疙瘩中Smad信号通路活化水平检测 |
| 3.3 活性TGF-β1 的鉴定 |
| 3.4 HTRA1 正向调节瘢痕疙瘩成纤维细胞中latent TGF-β1 的活化 |
| 3.5 干扰HTRA1或TGF-β1 表达对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的影响 |
| 3.6 干扰HTRA1或TGF-β1 表达对瘢痕疙瘩成纤维细胞衰老的影响 |
| 3.7 HTRA1 抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞衰老不依赖于TGF-β1 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分:miR-494-3p靶向HTRA1 并调节瘢痕疙瘩成纤维细胞功能 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器和设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 原代细胞培养 |
| 2.2.2 细胞计数 |
| 2.2.3 质粒抽提 |
| 2.2.4 细胞活力检测 |
| 2.2.5 总RNA抽提 |
| 2.2.6 miRNA提取 |
| 2.2.7 Real-time PCR |
| 2.2.8 荧光素酶报告基因的检测 |
| 2.2.9 细胞转染 |
| 2.2.10 荧光素酶报告载体系统的筛选 |
| 2.2.11 细胞凋亡检测 |
| 2.2.12 蛋白质免疫印迹 |
| 2.2.13 细胞周期测定 |
| 2.2.14 细胞侵袭测定 |
| 2.2.15 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 miR-494-3p在正常皮肤组织和瘢痕组织中表达水平检测 |
| 3.2 miR-494-3p与 HTRA13’UTR特异性结合 |
| 3.3 miR-494-3p对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的影响 |
| 3.4 miR-494-3p对瘢痕疙瘩细胞凋亡和细胞周期的影响 |
| 3.5 miR-494-3p对瘢痕疙瘩成纤维细胞侵袭的影响 |
| 3.6 miR-494-3p对瘢痕疙瘩成纤维细胞胶原合成的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 本论文创新性的自我评价 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）人脂肪干细胞来源外泌体促进脂肪干细胞成骨分化的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 1 前言 |
| 2 材料及方法 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 hADSCs提取与培养 |
| 2.2.2 流式细胞仪检测hADSCs表面分子标志物 |
| 2.2.3 ADSCs多向分化能力鉴定 |
| 2.2.4 超速离心法提取hADSCs-Exos |
| 2.2.5 透射电镜鉴定外泌体形态 |
| 2.2.6 动态光散射分析外泌体粒径 |
| 2.2.7 蛋白印迹法检测外泌体表面分子标志 |
| 2.2.8 不同时间外泌体与hADSCs共培养 |
| 2.2.9 茜素红染色及半定量含钙测定 |
| 2.2.10 hADSCs摄取PKH67 标记外泌体 |
| 2.2.11 不同浓度的外泌体与hADSCs共培养 |
| 2.2.12 CCK-8 法检测hADSCs增殖能力 |
| 2.2.13 划痕法检测ADSCs迁移能力 |
| 2.2.14 碱性磷酸酶染色(BCIP/NBT法) |
| 2.2.15 碱性磷酸酶(ALP)活性检测 |
| 2.2.16 成骨相关蛋白检测 |
| 2.2.17 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 hADSCs形态学观察 |
| 3.2 hADSCs表面分子标志物鉴定 |
| 3.3 hADSCs多向分化能力鉴定 |
| 3.4 hADSCs-Exos电镜鉴定 |
| 3.5 hADSCs-Exos粒径分析 |
| 3.6 hADSCs-Exos表面标志物分子鉴定 |
| 3.7 不同分化阶段分泌的ADSCs-Exos对 ADSCs成骨矿化的影响 |
| 3.8 hADSCs摄取PKH67 标记的hADSCs-Exos |
| 3.9 不同浓度hADSCs-Exos对细胞增殖能力的影响 |
| 3.10 不同浓度外泌体对细胞迁移能力的影响 |
| 3.11 ALP染色及活性检测 |
| 3.12 Western Blot检测成骨相关蛋白表达 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（6）银杏叶与通心络对脑缺血再灌注后一氧化氮产生的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 主要的试剂与仪器 |
| 1.2 实验动物的选取与分组 |
| 1.3 大鼠脑缺血再灌注模型制备方法 |
| 1.4 生理指标检测 |
| 1.5 海马内一氧化氮浓度检测 |
| 1.6 海马血流测定 |
| 1.7 统计学分析方法 |
| 2. 结果 |
| 2.1 生理学指标 |
| 2.2 平均动脉血压变化 |
| 2.3 海马内血流的影响 |
| 2.4 海马内NO生成的影响 |
| 3. 讨论 |
| 4. 结论 |
| 参考文献 |
| 银杏叶与通心络对脑梗死后NO产生的影响 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
（7）粒细胞集落刺激因子联合促红细胞生成素对脑缺血再灌注损伤的保护作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 G-CSF 联合EPO 对乳鼠皮质神经元氧糖剥夺模型的保护作用 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 G-CSF 联合EPO 对脑缺血再灌注大鼠的保护作用 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 G-CSF 联合EPO 对脑缺血再灌注大鼠神经细胞凋亡影响的研究 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 G-CSF 联合EPO 对脑缺血再灌注大鼠神经再生作用的研究 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间发表文章 |
| 个人简介 |
| 致谢 |
（8）黄芪总苷对脑缺血/再灌注损伤的保护作用及其作用机制研究（论文提纲范文）
| 一 英文缩略词表 |
| 二 中文摘要 |
| 三 英文摘要 |
| 四 正文 |
| 引言 |
| 第一部分 黄芪总苷对脑缺血再灌注损伤大鼠学习记忆功能的影响及作用机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 大鼠局灶性脑缺血模型制作 |
| 1.2.2 神经功能缺损评分 |
| 1.2.3 分组与给药 |
| 1.2.4 水迷宫实验 |
| 1.2.5 免疫组织化学检测 |
| 1.2.6 免疫印记(western blot)检测蛋白表达 |
| 1.3 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 AST 对局脑缺血再灌注大鼠水迷宫逃避潜伏期和游泳距离的影响 |
| 2.2 AST 对局脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织 NGF 表达的影响 |
| 2.3 AST 对局脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织 BDNF 表达的影响 |
| 2.4 AST 对局脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织 p-ERK 活性的影响 |
| 2.5 AST 对局脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织 p-JNK 活性的影响 |
| 2.6 AST 对局脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织 p-Akt 活性的影响 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 黄芪总苷对脑缺血再灌注损伤的保护作用及其作用机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 大鼠局灶性脑缺血（MCAO）再灌注模型制作 |
| 1.2.2 神经功能缺损评分 |
| 1.2.3 分组及给药 |
| 1.2.4 MCAO 再灌注大鼠脑含水量、脑指数和脑梗死体积的测定 |
| 1.2.5 生化指标测定 |
| 1.2.6 病理组织学检查 |
| 1.2.7 RT-PCR 技术 |
| 1.2.8 荧光定量 PCR |
| 1.3 统计学处理 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 AST 对局脑缺血再灌注大鼠体重的影响 |
| 2.2 AST 对局脑缺血再灌注大鼠神经功能评分的影响 |
| 2.3 AST 对局脑缺血再灌注损伤大鼠脑指数的影响 |
| 2.4 AST 对局脑缺血再灌注损伤大鼠脑含水量的影响 |
| 2.5 AST 对局脑缺血再灌注损伤大鼠脑梗死体积的影响 |
| 2.6 AST 对局脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织 SOD 活性的影响 |
| 2.7 AST 对局脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织 MDA 含量的影响 |
| 2.8 AST 对局脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织 LDH 的影响 |
| 2.9 AST 对局脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织 LD 的影响 |
| 2.10 AST 对局脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织 NO 的影响 |
| 2.11 AST 对局脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织 NOS 活性的影响 |
| 2.12 AST 对局脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织 iNOSmRNA 的影响 |
| 2.13 AST 对局脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织病理组织学的影响 |
| 2.14 AST 对局脑缺血再灌注大鼠脑组织 NGF mRNA 表达的影响 |
| 2.15 AST 对局脑缺血再灌注大鼠脑组织 BDNF mRNA 表达的影响 |
| 2.16 AST 对局脑缺血再灌注大鼠脑组织 p75NTRmRNA 表达的影响 |
| 2.17 AST 对局脑缺血再灌注大鼠脑组织 TrkAmRNA 表达的影响 |
| 2.18 AST 对局脑缺血再灌注大鼠脑组织 TrkBmRNA 表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 第三部分 黄芪总苷对海马神经元缺氧复氧损伤的保护作用及其作用机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 相关试剂的配制 |
| 1.2.2 胎鼠海马神经元培养 |
| 1.2.3 海马神经元缺氧/复氧模型的建立 |
| 1.2.4 实验分组及给药 |
| 1.2.5 神经元活力检测 |
| 1.2.6 海马神经元上清液中 SOD、MDA 和 NO 的测定 |
| 1.2.7 海马神经元凋亡的测定 |
| 1.2.8 海马神经元游离钙的测定 |
| 1.3 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 AST 对海马神经元缺氧/复氧后活力(MTT)的影响 |
| 2.2 AST 对海马神经元缺氧/复氧后 LDH 释放率的影响 |
| 2.3 AST 对海马神经元缺氧/复氧后细胞上清液 SOD 活性和 MDA 含量的影响 |
| 2.4 AST 对海马神经元缺氧/复氧后细胞上清液 NO 含量的影响 |
| 2.5 AST 对海马神经元缺氧/复氧诱导细胞凋亡的影响 |
| 2.6 AST 对海马神经元缺氧/复氧后胞浆内游离钙的影响 |
| 3 讨论 |
| 五 结论 |
| 六 参考文献 |
| 七 附录 |
| 八 致谢 |
| 九 综述 |
| 十 参考文献 |
（9）针刺对高血脂合并脑缺血大鼠神经干细胞和神经营养因子的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语（abbeviations） |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 针刺治疗高血脂的研究进展 |
| 1 中医对高脂血症认识 |
| 2 高血脂的病因病机 |
| 3 针刺治疗高血脂的临床研究 |
| 4 针刺治疗高血脂的实验研究 |
| 5 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 综述二 中医学对中风病的认识 |
| 1 病名 |
| 2 病位 |
| 3 病因 |
| 4 促发因素 |
| 5 临床症状 |
| 6 辨证施治 |
| 7 预后 |
| 8 针灸在治疗中风中的作用 |
| 参考文献 |
| 综述三 针刺对实验性脑缺血作用机制的研究进展 |
| 1 针刺对脑缺血合并症的实验研究 |
| 2 针刺抗脑缺血的作用机制研究 |
| 3 展望 |
| 参考文献 |
| 综述四 神经干细胞与脑缺血 |
| 1 神经干细胞的发现 |
| 2 神经干细胞的概念 |
| 3 神经干细胞的生物学特性 |
| 4 神经干细胞的定位和标记 |
| 5 脑缺血与NSC 的激活 |
| 6 脑缺血时影响NSC 增殖的因素 |
| 7 针灸与脑缺血后神经干细胞的研究现状 |
| 8 研究展望与科学意义 |
| 参考文献 |
| 综述五 神经营养因子与脑缺血及神经干细胞的关系 |
| 1 神经干细胞分化及其相关因子 |
| 2 NGF 家族与脑缺血及神经干细胞的关系 |
| 2.1 NGF |
| 2.2 BDNF |
| 3 GDNF 家族与脑缺血及神经干细胞的关系 |
| 4 其他生长因子与脑缺血及神经干细胞的关系 |
| 4.1 bFGF |
| 4.2 其他生长因子 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 前言 |
| 实验一 高血脂合并脑缺血大鼠模型的建立 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验二 电针对实验性高血脂大鼠血脂四项的影响 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验三 电针对高血脂合并脑缺血大鼠血脂四项的影响 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验四 针刺对实验性脑缺血神经行为及脑缺血病理改变的影响 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| HE 染色图 |
| 实验五 针刺对高血脂合并脑缺血大鼠Nestin 的影响 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| Nestin 表达图 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验六 针刺对高血脂合并脑缺血大鼠PCNA 的影响 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| PCNA 表达图 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验七 针刺对高血脂合并脑缺血大鼠vimentin 的影响 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| Vimentin 表达图 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验八 针刺对高血脂合并脑缺血大鼠Tuj-1 的影响 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| Tuj-1 表达图 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验九 针刺对高血脂合并脑缺血大鼠神经元特异性烯醇化酶（NSE）的影响 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验十 针刺对高血脂合并脑缺血大鼠神经营养因子NGF、BDNF、bFGF 的影响.. |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综合讨论 |
| 实验结论 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）兔血管化自体移植颌下腺细胞凋亡的实验研究（论文提纲范文）
| 一、正文 |
| （一） 中文摘要 |
| （二） 英文摘要 |
| （三） 前言 |
| （四） 材料与方法 |
| （五） 结果 |
| （六） 讨论 |
| （七） 结论 |
| （八） 参考文献 |
| （九） 附图 |
| 二、文献综述 |
| （一） 综述 |
| （二） 参考文献 |
| 三、致谢 |
| 学位论文版权使用授权书 |
四、颌下腺缺血再灌注后细胞凋亡与增殖的研究中国医科大学第一临床学院整形外科（论文参考文献）
- [1]降钙素基因相关肽（CGRP）通过调控Akt/mTOR信号通路介导的凋亡和自噬减轻创伤性颅脑损伤的实验研究[D]. 田军. 河北医科大学, 2021(02)
- [2]双参通脉颗粒对心肌缺血再灌注大鼠NF-κB信号通路影响的实验研究[D]. 陈卓. 辽宁中医药大学, 2019(01)
- [3]大鼠颌下腺上皮细胞放射性损伤模型的建立与评估[D]. 曹璐. 遵义医科大学, 2019(08)
- [4]miR-494-3p靶向HTRA1调节瘢痕疙瘩成纤维细胞生物学功能及机制研究[D]. 金石峰. 中国医科大学, 2019(01)
- [5]人脂肪干细胞来源外泌体促进脂肪干细胞成骨分化的作用研究[D]. 朱梦茹. 中国医科大学, 2019
- [6]银杏叶与通心络对脑缺血再灌注后一氧化氮产生的影响[D]. 卢园. 南京医科大学, 2014(04)
- [7]粒细胞集落刺激因子联合促红细胞生成素对脑缺血再灌注损伤的保护作用研究[D]. 郭丽君. 山西医科大学, 2011(08)
- [8]黄芪总苷对脑缺血/再灌注损伤的保护作用及其作用机制研究[D]. 尹艳艳. 安徽医科大学, 2008(05)
- [9]针刺对高血脂合并脑缺血大鼠神经干细胞和神经营养因子的影响[D]. 任秀君. 北京中医药大学, 2007(02)
- [10]兔血管化自体移植颌下腺细胞凋亡的实验研究[D]. 张凯. 大连医科大学, 2006(11)