一、北京鸭精子发生过程若干超微结构的冷冻蚀刻电镜观察（论文文献综述）
沈凌霄,赵刚[1]（2021）在《红细胞冷冻保存的历史、机理与研究进展》文中研究说明现代输血医学中红细胞冷冻保存是低温生物学中典型的临床应用之一,本文详细回顾了红细胞低温冷冻保存的发展历史以及临床应用方法的演变,并从低温生物学角度阐明红细胞在低温冷冻过程中遭受低温损伤的机理以及影响红细胞冷冻效果的常见因素,汇总了目前国际上使用新型低温保护剂的案例、胞内递送海藻糖技术的发展、冰重结晶抑制剂的应用等,为从事输血医学的医务人员和关注红细胞冷冻保存的科研工作者提供参考。
范希萍[2]（2013）在《豆状带绦虫不同发育阶段的结构特征及其致病机理的研究》文中提出兔豆状囊尾蚴病呈世界性分布，严重威胁着养兔业的发展，对该病的研究有重要的兽医公共卫生学意义。为明确豆状带绦虫不同发育阶段的结构特点及其致病机理，本研究通过人工感染的方法成功建立了犬豆状带绦虫感染模型和家兔豆状囊尾蚴感染模型,并采用电子显微技术和病理组织学技术等研究方法对豆状带绦虫、六钩蚴及豆状囊尾蚴的超微结构和组织学结构进行了系统观察；同时对家兔感染豆状囊尾蚴后的病理学变化规律进行了研究与探讨。1)驱虫后的犬人工感染豆状囊尾蚴，发现感染后42d开始排出孕卵节片，收集孕卵节片。感染70d后剖杀犬，收集完整成虫，取头节、颈节、成节和孕节分别制备电镜样品，透射电镜观察；取头节、颈节、成节和孕节制备石蜡切片，分别采用HE常规染色法、Masson氏特殊染色法和Langhan氏特殊染色法染色，光镜观察。结果显示豆状带绦虫的基本结构与猪带绦虫结构相似，而豆状带绦虫小钩芯髓不均质，与猪带绦虫存在差异。2)分离六钩蚴，用人工肠液激活，制备电镜样品，透射电镜观察。结果显示豆状带绦虫六钩蚴可分为皮质层、皮下层和实质层几部分，基本结构与猪带绦虫六钩蚴结构相似，但小钩基部直径小于端部，芯髓不均质，与猪带绦虫六钩蚴存在差异；在实质层观察到含有9个核的合胞体，其周围的结构与合胞体结构相同，证实了六钩蚴的基本结构由合胞体组成。3)血清学检测豆状囊尾蚴抗体阴性的家兔，人工感染六钩蚴并隔离饲养两个月，取成熟豆状囊尾蚴，采用上述相同方法，观察其组织结构和超微结构。结果显示豆状囊尾蚴与猪囊尾蚴、羊脑多头蚴结构基本相似，但豆状囊尾蚴主要寄生于大网膜和肠系膜表面，肌肉中未发现；另外，在豆状囊尾蚴囊壁上未见微绒毛。表明带科绦虫囊尾蚴的基本结构相似，但存在种间差异。4)血清学检测豆状囊尾蚴抗体阴性的家兔人工感染六钩蚴，根据感染数量将试验动物分为高剂量组（6只）和低剂量组（6只），设对照组（6只）。于感染后第7d、30d和60d分别采取试验组和对照组家兔的肝脏、脾脏、肾脏，制作石蜡切片，HE染色，光镜观察；同时，每周耳缘静脉采血，进行血液学检查。结果显示：感染初期，不同试验组家兔的肝脏、脾脏和肾脏均呈急性出血性炎症变化，肝细胞空泡变性，间质可见六钩蚴，肉芽肿初步形成。感染一个月后，可见囊尾蚴移行道，肝细胞严重空泡变性，间质中有未成熟囊尾蚴。感染后期，肝细胞空泡变性和颗粒变性，可见寄生虫性特殊肉芽肿。血液学检查结果显示，试验组家兔外周血中的中性粒细胞和淋巴细胞在感染一周后明显高于对照组，一个月后开始下降，感染两个月时基本接近对照组。同对照组相比，试验组单核细胞和嗜酸性粒细胞的变化规律为感染一周后明显增多，一个月后继续上升，感染两个月时下降，趋于稳定。
曹木青[3]（2013）在《衣藻纤毛长度调控机制的研究》文中进行了进一步梳理纤毛/鞭毛是以细胞微管为核心，突起于细胞表面的保守细胞器。纤毛在很多物种细胞都有分布，在脊椎动物细胞分布更为广泛几乎所有细胞表面都有纤毛。纤毛长度受到精准的调控，同种类型细胞的纤毛长度基本一致。这种常见的细胞器在细胞信号传导、细胞分裂、细胞运动以及动物发育过程中发挥着重要作用，其结构缺陷和长度异常还会造成很多人类疾病。纤毛呈现出近似圆柱体的形状，体积大小可以直接通过长度来定量。同时作为一种便于观察的细胞器，纤毛的长度很容易测量，纤毛是研究细胞器大小调控的理想模型。纤毛长度控制机制的研究有多方面的意义，不但能为人类纤毛相关疾病提供理论依据，还能帮助我们了解细胞器大小调控的基本过程。纤毛长度调控理论目前还存在很大的争论，主要争议点在于细胞能否感受自身纤毛长度，并作出相应的调节，而这个问题的关键在于是否存在活性分子，其活性随纤毛长度变化出现相应的活性变化，而活性变化又反过来调节纤毛长度。我们主要使用衣藻研究纤毛，原来的研究发现，伴随着纤毛解聚和切割，衣藻蛋白激酶CALK发生SDS-PAGE敏感的磷酸化修饰，而在纤毛再生过程中，CALK的磷酸化状态与纤毛长度紧密相关。本研究鉴定了CALK的激酶活性调控位点为第193位苏氨酸（T193），位于激酶保守结构域第八亚区活化环上，和CALK同源蛋白Aurora T288类似，CALKT193磷酸化与否直接决定CALK磷酸化底物的能力。实验显示在无纤毛细胞中CALK的激酶活性很低，随着纤毛再生变长，CALK激酶活性逐渐增加，在纤毛达到全长时，恢复到正常水平；而在纤毛解聚过程中，CALK激酶活性出现迅速上调，而随着纤毛逐渐变短，CALK激酶活性逐渐下降，结合纤毛长度突变体，证实CALK活性调节和纤毛长度变化呈现线性关系。本研究还发现，T193磷酸化修饰并非原来报道的SDS-PAGE敏感的磷酸化，后者发生在蛋白C端非激酶区，可能对CALK的激酶活性起到调节作用。这些实验证实，在纤毛解聚和组装过程中，蛋白激酶CALK调控位点T193的磷酸化状态可以直接地连续地反映纤毛长度信号，为细胞主动感受自身纤毛长度的负反馈机制提供了强有力的证据。我们还利用比较蛋白组学手段，利用定量技术分析再生短纤毛和全长纤毛中，纤毛蛋白的的含量，确定了纤毛蛋白的组装顺序，为纤毛结构的极性现象和纤毛长度研究提供了新的线索。
刘栋[4]（2010）在《畜禽补体C3d基因克隆及序列分析和重组鸡C3d免疫佐剂效果研究》文中进行了进一步梳理在生产实践中,传统的疫苗（弱毒苗、灭活苗）对防治动物疫病发挥了重要作用,但近年来该类疫苗暴露出来的免疫效果不佳等缺陷,使研制更安全、高效、廉价的新型疫苗显得非常迫切和必要。基因疫苗主要由真核表达载体和保护性抗原基因构成,此种疫苗与传统疫苗相比,具有设计灵活、安全性高、性质稳定、成本低、同时诱导体液免疫和细胞免疫等优点。然而核酸疫苗存在的问题是产生抗体慢且水平低,需要加入有效的佐剂才能克服这些缺陷;核酸疫苗的佐剂需用分子佐剂,分子佐剂主要有干扰素分子佐剂、白细胞介素分子佐剂、胸腺肽分子佐剂及C3d分子佐剂等,其中C3d分子作为一种新型分子佐剂日益引起人们的关注。补体C3是机体补体激活的经典途径、替代途径以及甘露聚糖结合凝集素（MBL）途径的交汇点的中心成分,是宿主防御机能的一个分子。C3d片段是补体C3的裂解片段之一,是C3分子α链不能被蛋白酶再裂解并仍保持与抗原共价连接的最小片段,具有广泛的免疫学功能。其可以直接与抗原递呈细胞（APC）上的CR2受体结合,从而降低淋巴细胞的活化阈,提高抗原分子的免疫原性。因此,C3d被认为是一种具有研究、开发应用价值的核酸疫苗分子佐剂。鉴于上述研究背景,本研究在对不同动物补体C3d基因克隆及序列测定比较分析的基础上,探讨了补体C3d在不同畜禽间基因水平上的相关性和差异性;验证了鸡补体C3d原核表达重组蛋白（rChC3d）对大肠杆菌疫苗和新城疫灭活油乳苗的免疫增强作用;然后采用新城疫病毒F基因为试验材料、以鸡补体C3d的受体结合功能区P29作为分子佐剂,构建了C3d-P29.n（n=2、4、6）多聚体分子佐剂新城疫F基因疫苗,并经过检测证明了其具有较好的免疫保护效果。本研究成果为以后研制禽类的其他有效细菌及病毒性疫苗提供了理论基础和技术支撑。本研究主要内容如下:1、不同畜禽补体C3d基因的克隆及序列分析:从不同畜禽的肝细胞提取总RNA,通过RT-PCR扩增出C3d基因的cDNA,琼脂糖凝胶电泳鉴定后直接克隆到pMD18-T载体,构建pMD18-T-C3d重组质粒,转化大肠杆菌,酶切鉴定后进行序列测定,然后进行C3d序列比较、CR2结合区同源性分析比较。结果表明,畜禽补体C3d基因同源性相差较大,进化树反映出C3d基因具有种的多样性,亲缘关系越近,进化关系也越近。对CR2结合区分析发现,禽类的该区为29个氨基酸,而哺乳动物的为28个氨基酸,两类动物该区氨基酸的同源性仅为40%,而哺乳动物之间的同源性高达80%,证明补体C3d及CR2结合区具有种属的特异性。另外,用生物学软件对补体C3d基因编码的氨基酸序列以及蛋白结构进行了分析、用ESyPred 3D同源建模等软件对补体C3d的三级结构进行了三维结构预测和分子特征分析,分析结果显示,C3d 3D模型是一种由核心和外层构成的桶状分子结构。本研究为进一步研究动物C3d分子佐剂基因疫苗奠定了基础。2、鸡补体C3d原核表达载体的构建及其重组蛋白的纯化:补体C3d是补体系统（Complement system,CS）中补体C3的最终裂解产物。为研究其免疫增强的生物学功能,利用RT-PCR技术从罗曼蛋鸡肝脏总RNA中扩增出C3d cDNA,经克隆测序证实所得基因为C3d。然后,将其连接至表达载体pET-32a（+）,转化E. coli BL21（DE3）,通过IPTG诱导表达。SDS-PAGE分析结果表明,目的基因在大肠杆菌中以包涵体的形式进行了高效表达,Western-blotting证实目的蛋白为C3d。包涵体蛋白通过尿素溶解液洗涤并溶解后,经硫酸铵盐析、透析、浓缩和Sephadex G-200凝胶过滤层析,重组C3d蛋白得到纯化。最后,SDS-PAGE及Western-blotting检测验证该C3d表达蛋白得到很好的纯化,并且纯化后的表达蛋白仍具有良好的反应原性。本研究为进一步研究、利用鸡补体C3d蛋白提供了保证。3、鸡补体C3d重组蛋白对大肠杆菌疫苗的免疫增强作用研究:从SDS-PAGE凝胶中分离纯化原核表达的重组C3d蛋白,用戊二醛将其与大肠杆菌抗原连接,免疫注射SPF鸡;对照组鸡免疫注射完全弗氏佐剂大肠杆菌疫苗。分别在免疫后的第2、3、4、5、6、7、8、9周采血,用ELISA方法测定血清中的抗体含量,同时测定血清中总补体活性。结果表明,免疫后3周,弗氏佐剂大肠杆菌疫苗诱导鸡体产生的抗体效价高于C3d佐剂疫苗组,但至第4周,弗氏佐剂疫苗组的抗体水平达到高峰（OD值=0.273±0.044）,然后迅速下降,到第9周降至0.200±0.055,而C3d疫苗组鸡免疫后的抗体水平持续上升,从免疫后第2周的0.099±0.030上升到第9周的0.275±0.020。证明原核表达的C3d能够促进免疫记忆细胞的产生,并能够使细菌抗原给予免疫细胞持续稳定的刺激,从而使鸡体维持高水平抗体的时间延长。研究结果为研制有效的家禽细菌性疫苗提供了理论依据。4、鸡补体C3d重组蛋白对新城疫病毒灭活油乳苗的免疫增强作用研究:为进一步探讨重组鸡补体C3d蛋白的佐剂作用,本试验观察了原核表达纯化后的重组鸡补体C3d蛋白和新城疫灭活油乳苗共同免疫鸡群之后,重组鸡补体C3d蛋白对新城疫灭活油乳苗的免疫协同作用。将7日龄雏鸡分为三组进行免疫注射,作用结果显示联合免疫灭活油乳苗和重组鸡补体C3d蛋白的鸡群,在免疫后1～7周（即14～57日龄）整个观察期内,不但其胸腺T淋巴细胞对ConA、法氏囊B淋巴细胞对PMA的反应均明显强于单纯油乳苗免疫组（其中除在接种后第1周时两组鸡的B淋巴细胞增殖OD值差异不显着外,其余各检测时间两组间均表现为差异显着（P<0.05）或极显着（P<0.01）,特别是T淋巴细胞增殖情况在接种第2周后均表现为差异极显着（P<0.01））;而且联合免疫组的HI抗体效价水平也持续性高于单纯油乳苗免疫鸡群,并在免疫接种后5～7周时差异显着（P<0.05）。在免疫接种后第7周时进行的攻毒保护试验中,联合免疫组的保护率为100%,而单纯油乳苗免疫组鸡在观察期内则有3只发病,保护率为83.3%,且有1只死亡。总之,本试验所用重组鸡补体C3d蛋白和灭活油乳苗联合免疫可显着提高机体的体液免疫和细胞免疫水平,产生了较好的免疫协同作用,使机体对新城疫病毒的综合免疫保护能力得到进一步的增强,从而初步验证了重组C3d蛋白的免疫佐剂作用。5、新城疫病毒C3d-P29分子佐剂F基因疫苗的构建及其表达:C3d是补体C3的裂解产物之一,与抗原相连时可以明显提高抗原分子的免疫原性。CR2/CD21在其功能发挥过程中起到重要作用,P29为编码C3d与CR2结合区域的基因。在克隆出C3d cDNA基础上,设计引物克隆P29至pUC19载体,利用同裂酶BamH I和Bgl II构建pUC-P29.n。酶切获得P29.n,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1（+）。最后RT-PCR扩增新城疫F基因,定向克隆至真核表达载体pcDNA-P29.n中P29.n的上游,构建完成新城疫F基因疫苗,用IFA法检测pcDNA-F-C3d-P29.n可在CEF中大量表达。本研究为进一步研究补体C3d的分子佐剂效应以及开发和利用鸡C3d奠定了基础。6、鸡C3d-P29重组质粒特异性增强鸡补体总活性与C3含量的初步研究:为验证鸡补体C3d-P29分子佐剂作用,本试验比较研究了免疫注射含有鸡C3d-P29基因重组表达质粒之后的鸡血清中补体水平及其补体C3含量与含有异种动物（如小鼠）CR2结合区基因序列重组质粒或空白对照之间的差异,以探讨鸡补体C3d基因重组质粒能否特异性的增强鸡补体总活性与补体C3含量。根据构建的真核表达重组质粒不同分为五组对鸡进行免疫注射,具体为空白对照（PBS）组;pcDNA3.1空质粒组;含有新城疫F基因的pcDNA3.1-F组;含有新城疫F基因以及鸡CR2结合区（P29）基因序列C3d-P29六聚体的pcDNA3.1-F-ChC3d-P29.6组;含有新城疫F基因以及小鼠CR2结合区（P28）基因序列C3d-P28六聚体的pcDNA3.1-F-MC3d-P28.6组。分别采取各组经二免后成年鸡的新鲜血清,测定其补体总活性;利用生化合成的C3α链N端21肽,经免疫家兔后制备的抗鸡C3抗体,具有能够与鸡血清中的补体C3发生特异性反应的特性,用来测定注射过不同真核表达质粒后鸡血清中C3含量差异。结果表明,空白对照（PBS）组;pcDNA3.1空质粒组; pcDNA3.1-F组; pcDNA3.1-F-ChC3d-P29.6组和pcDNA3.1-F-MC3d-P28.6组五个试验组鸡血清中的补体C3含量分别为0.34±0.005mg/mL、1.47±0.008mg/mL、1.70±0.005mg/mL、1.78±0.007mg/mL和4.18±0.008mg/mL。免疫鸡补体C3d（pcDNA3.1-F-ChC3d-P29.6组）的鸡血清中补体总活性和C3含量都远远高于其他组,差异极显着（P<0.01）;并且鸡C3d重组质粒能特异性增强鸡补体总活性与C3含量,差异极显着（P<0.01）。7、新城疫补体C3d分子佐剂疫苗免疫效果的研究:在克隆了鸡C3d cDNA和新城疫F48E9株F基因cDNA的基础上,构建编码CR2结合区P29基因的多聚体,以此多聚体为分子佐剂构建了新城疫F基因疫苗pcDNA3.1-F-C3d-P29.2、pcDNA3.1-F-C3d-P29.4、pcDNA3.1-F-C3d-P29.6及pcDNA3.1-F,通过了实验室安全检验和效力检验。将含有不同个数P29基因的多聚体作为分子佐剂的新城疫F基因疫苗、新城疫油乳剂灭活苗以及质粒载体作为对照分别免疫SPF鸡,利用MTT法、血凝抑制法（HI）和ELISA等分别检测不同疫苗免疫后的细胞免疫和体液免疫水平,并在免疫后第五周进行了攻毒试验。最后,还进行了重组鸡补体C3d质粒（pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6）及原核表达重组C3d蛋白（rChC3d）对外周血T淋巴细胞增殖效果对比试验。结果表明,以补体C3d-P29为分子佐剂的新城疫F基因重组疫苗安全性好;虽然免疫后抗体水平和保护率不如新城疫油乳剂灭活苗,但是能够抵抗致死量病毒的攻击,具有较好的保护作用,其中以pcDNA3.1-F-C3d-P29.6效果更好;MTT法测定T淋巴细胞转化结果表明,补体C3d-P29.6佐剂能显着促进淋巴细胞转化,多数时间点与油佐剂的效果相当,部分时间点显着强于油佐剂。MTT法检测pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6与rChC3d对外周血T淋巴细胞增殖效果显示pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6免疫组峰值较rChC3d协同免疫组出现时间稍晚,但随后质粒免疫组可维持在更高的水平值。这表明pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6在体内持续的时间更长。本研究中C3d分子佐剂疫苗免疫效果的验证,为进一步开发和利用鸡C3d奠定了基础。
戴成吉[5]（2010）在《镉对小鼠精母细胞凋亡及附睾内精子质量的影响》文中提出本研究采用人工水质染毒的方法,利用透射电镜技术、荧光免疫与流式细胞术（FCM）相结合的方法,探讨重金属镉对小鼠睾丸内精母细胞和精子凋亡及附睾内成熟精子质量的影响,旨在为金属镉繁殖毒理学研究提供基础理论依据,并为后续精母细胞凋亡基因及成熟精子酪氨酸磷酸化蛋白表达研究奠定基础。结果表明:各实验组中小鼠精母细胞处于凋亡时期的数量显着高于对照组,凋亡时期的精母细胞超微结构呈现出细胞内线粒体空泡、核膜内陷、染色质周缘化及核固缩等现象,表明镉容易引起小鼠精母细胞凋亡;各实验组中早期凋亡精子的比例显着高于对照组,而活性精子的比例显着低于对照组（P<0.05）,其中0.10mmol/L氯化镉剂量组精子成活率（75.1%）显着低于对照组和其他实验组,而早期凋亡率（22.6%）则显着高于对照组和其他实验组;高剂量组睾丸生殖细胞DNA断裂率（18.2%）及附睾精子断裂率（26.5%）均显着高于对照组（3.3%、5.6 %）（P<0.05）。各试验组小鼠睾丸内DNA断裂的生殖细胞数量低于附睾内DNA断裂的精子数量。随着添加剂量的增加,小鼠睾丸内生殖细胞及附睾内精子凋亡率逐渐升高。表明小鼠生殖细胞凋亡及DNA损伤数量与镉剂量具有一定相关性。
黄诗韵[6]（2010）在《精浆游离mRNA一般特征及附睾液游离mRNA功能的初步研究》文中进行了进一步梳理第一部分人cfsRNA的提取及含量、种类、来源分析目的：建立提取cfsRNA的有效方法,了解其含量、种类、来源。为进一步探索cfsRNA的临床应用价值及存在意义奠定基础。方法：收集精液参数正常的男性精液标本,联合应用Trizol LS Reagent和RNeasy Kit提取和纯化cfsRNA, RT-qPCR扩增管家基因β-actin （ACTB）比较纯化前后RNA提取效果,建立稳定的提取纯化技术,RT-qPCR扩增ACTB分析精液参数正常男性cfsRNA含量,并通过琼脂糖凝胶电泳和Agilent 2100 Bioanalyze （Lab on chip）的双重检测,验证cfsRNA质量及种类。用Affymetrix公司的Human Gene 1.0ST Array,分析精液参数正常的男性cfsRNA的mRNA种类及来源。结果：联合应用Trizol LS Reagent和RNeasy Kit提取和纯化的cfsRNA,用于荧光定量RT-PCR所得到的ct值比不纯化所提取cfsRNA明显提前,差异有显着性意义（P<0.01）。对10例精液参数正常标本分析,cfsRNA含量范围为每毫升精浆0.87μg到3.64μg,RNA分子完整性指数RIN （RNA Integrity Number）为6.4。28S与18S倒置,比值为0.6。Agilent 2100 Bioanalyze的结果分析说明cfsRNA可能种类繁多,包括28S rRNA,18S rRNA和小分子RNA（如5S rRNA, tRNA, microRNA等）及在这一范围间大量存在的大小不等的mRNA分子。cfsRNA芯片分析结果共20106种转录子存在,已知基因14,575个,其中12,089为已知基因,并有基因表达信息,其余为假基因、未知功能转录、小RNA等。芯片结果表达信息提示cfsRNA来源于多个男性生殖器官,其中前列腺表达而睾丸不表达2,009个,睾丸表达而前列腺部表达1,529个,前列腺和睾丸均表达2,518个,其余6,033个不在睾丸和前列腺中表达。结论：联合应用Trizol LS Reagent和RNeasy Kit可获得大量cfsRNA,能应用于microay、northern-blot、RT-PCR等技术。cfs-mRNA种类繁多,来源于多个男性生殖器官。可能成为精浆来源器官某些疾病（如肿瘤、基因表达异常所致疾病等）的无创性诊断、性犯罪法医鉴定等方面的新分子标志物。第二部分人cfs-m RNA一般特性分析实验一人cfs-m RNA完整性及稳定性分析目的：考虑到上述应用前景和优势,研究cfs-mRNA的一般特性是否满足分子检测技术的基本要求。本部分主要是研究精液正常男性cfs-mRNA的完整性、稳定性、是否与其他物质结合存在。本部分的完成将为进一步研究病理情况下cfs-mRNA及其应用研究奠定严谨的实验基础。方法：本部分采用分析mRNA的完整性的公认的方法,即针对mRNA不同部位：分别设计可扩增全长及针对5’端、3’端及中段片段的引物,收集精液参数正常的精浆标本9例,通过RT-qPCR的方法定量比较ACTB、DDX4 mRNA各自5’端、3’端及中段片段的量的差异,以转录子5’端为1,分析其3’端及中段相对5’端的比例,从而反映mRNA的完整性。在室温下静置,分别于0 min、20 min、45 min、90 min及24 h取出400μl精浆,提取cfsRNA,荧光定量RT-PCR检测入ACTB、DDX4 mRNA不同片段的量变及大鼠ACTB mRNA的量变规律。为分析cfsRNA是否以与大分子结合形式存在而逃避精浆RNA酶的降解作用,精液参数正常男性精浆标本分别通过直径分别是5.0μm、0.45μm、0.22μm的滤膜分别过滤,运用荧光定量RT-PCR观察过滤前后ACTB、DDX4 mRNA的量变规律。由于Triton X-100可以分解大分子结合物质,我们收集5人精浆,分为两等份,一份加TritonX-100（终浓度为10 ml/L）以分解蛋白质、脂类等物质,室温下静置20 min,另一份在提取RNA时加入TRIzol LS后加入,分别于0、5、10、20 min时取400μl精浆,荧光定量RT-PCR分析精浆ACTB、DDX4 mRNA的量变规律。结果：相对于ACTB mRNA的5’端,其中段片段的相对量为71%（P<0.05）,3’端片段的相对量减少到24.2%（P<0.001）。相对于DDX4 mRNA的5’端（100%）,其中段片段的相对量为48.4%（P<0.05）,其3’端片段的相对量减少到2.0%（P<0.001）。结果说明cfs-mRNA可能主要以片段形式存在,而主要可能从mRNA3’端开始降解。精浆在室温下静置不同时间后,较0 min时间ACTB mRNA的量,ACTB mRNA的5’端、3’端及中段在24 h内均无明显减少（P>0.05）,说明ACTB mRNA是稳定的。DDX4 mRNA的5’端在24 h内稳定（P>0.05）,而DDX4 mRNA中段的含量在90 min时开始慢慢减少,24 h后已经降解到最初的25.8%（P<0.01,）3’端含量在20 min已降到了27.4%,90 min时已检测不到（P<0.001）。精浆通过5.0μm的滤膜,与未过滤组比较,5.0μm的滤膜对ACTB、DDX4 mRNA水平均无影响,表明没有残余细胞的影响。而与未过滤组比较,通过0.45μm、0.22μm的滤膜后ACTB mRNA分别减少到55.2%和27.2%,DDX4mRNA分别减少到56.0%和39.4%（P＜0.05）,说明精浆过滤后cfs-mRNA减少可能主要是与大分子结合存在。为进一步证实cfs-mRNA稳定性与复合物结合有关,我们向精浆标本中加入Triton X-100, cfs-mRNA稳定性明显下降,在室温条件下处理10min,20 min后,ACTB mRNA5’端水平下降到6.1%和2.3%,DDX4mRNA5’端水平10min后已检测不到。说明RNA-分子复合物结合是cfs-mRNA稳定存在与精浆中的关键机制。结论：精浆中有完整的cfs-mRNA存在,但主要以片段形式存在,且可能从mRNA3’端开始降解。cfs-mRNA可能是以与大分子物质形成复合物而存在于精浆中,尽管cfsRNA在精浆中相对稳定,但我们建议后续的研究或临床应用中为保证更好的cfsRNA质量,获得精浆标本后应立即放置液氮或-80℃保存,尤其是要对3’端分析时。实验二人cfs-mRNA存在形式研究目的：由于cfsRNA大量存在于精浆中,且精浆小体（seminal microparticles, SMPs）已被证实是稳定且大量的精浆物质之一。我们推测cfsRNA可能存在于来自不同男性生殖器官来源的SMPs中,后者是保护游离保护游离RNA不被环境中RNA酶降解的物质。方法：精液标本选自精液参数正常的男性及严重少精子症患者。分离SMPs并通过透射电镜观察形态,为获得包裹在SMPs内的cfsRNA,分别将RNA酶A加入从15例精液参数正常男性及10例严重少精子患者分离得到的SMPs重悬液中,浓度为100μg/ml,37℃水浴15 min,以去除SMPs表面或是裸露存在的cfsRNA。继续加入0.25%的胰酶37℃水浴15 min以分解SMPs外的RNA-蛋白质复合物。分离纯化以SMPs形式存在的cfsRNA,选择管家基因及男性生殖系统特异mRNA指标进行RT-PCR扩增,分析SMPs内是否存在cfsRNA以及相应比例。由于SMPs大小为直径30 nm-1.0μm之间,将6例精液参数正常男性的SMPs重悬液分为过滤组及未过滤组,过滤组分别通过直径分别是0.8μm、0.45μm、0.22μm及0.10μm的滤膜,运用荧光定量RT-PCR,观察与未过滤组比较,过滤不同孔径滤SMPs内cfsRNA的量变规律。结果：SMPs悬液的透射电镜观察显示为圆形或椭圆形微小结构,大小不等,可成簇分布。在精液参考值正常男性cfsRNA及其SMPs形式（smpRNA）中,六个基因：ACTB, DDX4, PRM2, DEFB129, SERPINA5及TGM4的检出率均为100%。对于精液正常男性及严重少精子症患者,比较总cfsRNA与SMPs形式存在的cfsRNA的量,ACTB, DDX4, PRM2, DEFB129,SERPINA5和TGM4 mRNA水平无明显的降低,说明绝大多数cfsRNA以SMPs形式存在,足以稳定被检出。由于SMPs大小为直径30nm-1.0μm之间,精浆通过0.8μm、0.45μm、0.22μm及0.10μm的滤膜后不同基因cfsRNA含量都有一定程度减少（P<0.01）。结论：精液参数正常男性及严重少精子症患者却大部分cfsRNA存在于SMPs中,从而保护不被精浆RNA酶降解,是潜在的诊断疾病的新分子标志物。这一形式的RNA物质是否也可以通过融合进入精子细胞发挥功能,有待进一步研究。第三部分小鼠附睾特异性mRNAs通过附睾小体递入精子的研究目的：本部分首先通过RT-qPCR定量附睾游离mRNA在附睾小体中的含量,参考文献选择并用RT-PCR证实小鼠附睾尾部表达而附睾头部区域不特异性表达基因：Crisp1。通过体外实验观察Crisp1 mRNAs是否存在于附睾小体中,并能通过附睾小体进入附睾头部精子。方法：取10-12周龄BALB/c雄性小鼠双侧附睾头、尾部,分离精子及附睾小体。将附睾上清液分成两份,分别用于提取附睾游离RNA （cfeRNA）和附睾小体RNA,用RT-qPCR,通过分析附睾特异性表达基因：Adam 7、Crisp1、Wfdc2、Wfdc9、Defb22,定量比较附睾游离mRNA和附睾小体中的mRNA含量。将超高速离心法获得的附睾尾部小体与附睾头部精子用PBS液37"C共孵育1 h,通过RT-PCR检测附睾尾部Crisp1mRNAs是否在孵育后的附睾头部精子中检测到,同时,以附睾头部末孵育的精子为阴性对照,以附睾尾部精子为阳性对照组。通过原位杂交-免疫电镜观察附睾尾部小体递入Crisp1mRNAs的定位。结果：RT-qPCR定量分析附睾游离Adam7、Crisp1、Wfdc2、Wfdc9、Defb22 mRNA在附睾小体中的比例，结果显示附睾小体内mRNA与游离形式mRNA水平无明显差异；通过RT-PCR的方法,分别在小鼠附睾头、尾小体中发现附睾头部小体不含Crisp1mRNA,主要在附睾尾部小体表达,推测附睾尾部上皮区域特异性表达Crisp1mRNA。分别观察小鼠附睾头、尾精子,发现附睾头部精子不含Crisp1mRNA,主要在附睾尾部精子中表达。附睾头部精子与附睾体尾部小体孵育后,可检测到Crisp1mRNA,主要表达于顶体及尾部中段,其胞浆小滴未消失,与附睾尾部精子中的定位一致。透射电镜分析结果表明附睾头部精子与附睾尾部小体孵育前,无明显胶体金颗粒存在,说明Crisp1mRNA不表达。而将附睾头部精子与附睾尾部小体孵育后,可见胶体金颗粒大小在10-20nm,主要分布于顶体,尾部主段及线粒体。结论：由于精子离开睾丸后转录被抑制,精子在附睾尾部获得附睾上皮区域特异性Crisp1mRNA。表明附睾游离mRNA可通过附睾小体递入精子。
周军年[7]（2009）在《肝/造血共祖细胞的鉴定及Epimorphin调控肝干细胞分化的机制研究》文中研究指明胎肝是微环境调控干细胞增殖分化的一个极佳模型,在胎肝微环境中,中胚层起源的造血细胞、间质细胞和内胚层起源的上皮细胞在其中共同发育成熟。本论文主要分为两大部分,在第一部分中,我们尝试建立一个新的研究肝和造血发育关系的单克隆模型;在第二部分中,我们对胎肝发育后期（胎肝造血已经结束,肝上皮细胞开始逐渐发育成熟时）特异性表达在胆板间质表面的一个蛋白——上皮形态发生素（EPM）调控肝干细胞分化的机制进行了研究。一、肝/造血共祖细胞的鉴定胎肝是造血和肝脏系统发育的重要器官,在胎肝的不同发育阶段,造血和肝脏系统均具有密切的关联性和相互的调控作用,同时胎肝也是微环境调控干细胞增殖分化的一个极佳模型,对其进行发育生物学的系统研究将有助于了解造血起源、肝脏发育、干细胞多向分化及调控机制等一系列热点问题,并且在肝脏疾病和造血系统疾病的发生发展和治疗新策略领域也具有十分重要的意义。此前有研究者提出过一个假说,即在胎肝发育的早期可能存在着肝和造血的共祖细胞,此类共祖细胞的存在与否,对早期造血起源和肝脏发育具有重要的研究价值。此后的一些研究报道也在一定程度上支持了这个假说,因为这些报道都证实在骨髓或其它一些造血位点存在着具有向肝和造血双向分化能力的细胞群体。我们研究室之前的工作也表明,在人脐带血中可以分离出一群具有β2m-/c-Met+表面标志特征的细胞亚群,此群细胞也具有双向分化的潜能。但这些研究在组织来源、细胞模型、鉴定技术等方面均存在一定局限,都不能排除这样一种重要的可能性:即在这些细胞群体中存在着独立的肝干/祖细胞和造血干/祖细胞（HS/PCs）,只是因为这两类独立存在的干/祖细胞在特定的环境下各自分化形成了肝脏细胞和造血细胞,从而显现出细胞群体的双向分化潜能。因此,为了准确地发现和验证肝/造血共祖细胞的存在,我们建立了小鼠胎肝来源的高增殖潜能集落形成细胞（HPP-CFC）模型,HPP-CFC是在体外不需要基质支持的最早的具有多向分化潜能的造血前体细胞,以往对AGM（主动脉-性腺-中肾区域）区来源的HPP-CFC克隆的研究已经证实其除具有造血分化潜能外,还具有向内皮分化的潜能。因此,我们利用此类单克隆起源的前体细胞,重点研究胎肝来源的单克隆HPP-CFC向肝上皮细胞分化的潜能,本部分研究内容如下:（一）小鼠胎肝HPP-CFC体系的建立及向肝系细胞分化我们首先进行了单克隆HPP-CFC的培养以及诱导分化实验。利用造血和肝诱导因子的共同作用,对单克隆来源的HPP集落细胞向造血和肝上皮细胞进行诱导分化,并采用透射电镜、巢式RT-PCR、细胞免疫荧光等方法,从细胞形态、超微结构、上皮细胞分化标志等方面对分化后的细胞进行检测。检测结果显示诱导后的部分细胞具有肝细胞特异性的超微结构,在细胞表面形成微绒毛,在胞浆内具有较大的细胞核,大量的圆形线粒体和糖原颗粒。并在mRNA和蛋白水平以不同比例的表达白蛋白（ALB）、甲胎蛋白（AFP）、细胞角蛋白（CK8,CK18）等肝上皮分化标志。（二）小鼠胎肝细胞的分选为进一步研究这群具有肝和造血双向分化潜能的细胞在胎肝中的表型,我们利用免疫磁珠（MACS）进行细胞分选。结果表明:胎肝来源的HPP-CFC主要来自于CD45+细胞,CD45-细胞不具有形成造血克隆的能力。在肝上皮细胞分化潜能上,流式分选（FACS）获得的CD49f+/Sca-1+细胞与未分选细胞无明显差异。究其原因,有两种可能性:（a）CD49f+/Sca-1+并没有富集我们发现的这群具有肝和造血双向分化潜能的前体细胞;（b）这群双阳性细胞在半固体培养体系中对于造血和肝因子刺激的应答不同,可能更倾向于造血分化。（三）小鼠胎肝HPP-CFC单克隆源性的鉴定本部分研究通过细胞混合实验,采用巢式PCR联合荧光显微镜观察,对GFP和Sry双遗传标记的HPP克隆进行了检测,证明了本研究采用的单克隆HPP模型具有严格的单克隆源性。令人惊讶的是,这些诱导后的HPP克隆细胞同时还表达间质标志α-SMA（α-smooth muscle actin）和原始内皮细胞标志Flk-1（fetal liver kianse-1）。我们推测这群CK8+/α-SMA+细胞可能代表了胎肝中的一群具有多向分化潜能的上皮-间质转换细胞（EMT）,这群细胞可能起源于中内胚层细胞。以上结果说明,胎肝来源的HPP-CFC可能代表了一个新的假想中的肝/造血共祖细胞单克隆模型,为研究胎肝中造血和非造血细胞的发育关系提供了一个新的切入点,虽然这个模型本身还有很多需要改进的地方。二、Epimorphin蛋白调控肝干细胞分化的机制研究在胎肝微环境中,我们初步验证了肝/造血共祖细胞存在的可能性,实际上,在胎肝发育的后期,胎肝微环境逐渐由支持造血分化转向促进上皮细胞的发育成熟,那么在这个过程中胎肝中的基质微环境必然发生较大的改变。已知在小鼠胎肝发育至E17.5时,此时胎肝造血已经结束,造血细胞开始向骨髓迁移,一个称为“上皮形态发生素”的重要基质蛋白EPM开始随着胚肝细胞上其受体αvβ1整合素的逐渐上调而在胎肝间质上逐渐开始表达,而此时胆板正在进入一个比较大的组织重塑期,在胆板的两层细胞之间逐渐出现局部膨大,最终形成胆管结构,那么我们要问,EPM是否有可能在肝/造血共祖细胞向上皮细胞的分化决定中发挥作用呢?目前的研究表明,EPM在众多的上皮组织器官包括肺、乳腺、胰腺、胆囊、发毛囊、小肠、皮肤、肾、生殖腺中,调控上皮细胞腺管形态的发生。已有研究表明,EPM在肝再生修复的后期表达上调,而且EPM参与肝干细胞的分化过程。基于上述研究,我们推测EPM可能在胆管形态发生以及肝干细胞向胆管上皮细胞的分化过程中发挥作用。对EPM在干细胞向胆管细胞分化过程中机制的研究,不仅有助于理解胎肝发育过程中上皮细胞特化命运的决定,更有助于指导体外肝组织工程等应用方面的研究。组织工程化肝单元的构建可能代表了未来以干细胞为种子细胞的肝组织工程发展的方向。目前在肝单元构建的研究中,研究者着眼于种子细胞向肝细胞、血管内皮细胞的诱导分化,但对于胆管的分化和形态发生研究较少,究其原因,可能是因为和肝细胞相比,胆管上皮细胞（BEC）发挥功能除了一般意义上的单个上皮细胞极性的产生外,更加强调细胞群体的极性排列和空间结构的产生和维持,因而增加了研究的难度。但实际上,虽然BEC在肝脏全部细胞中的比例较低,但由BEC构成的肝内胆管（IHBD）对于肝代谢功能的发挥尤其是肝细胞分泌的胆汁的输送和调节至关重要。因此本研究中,我们将结合体内CCl4肝损伤模型和体外肝干/祖细胞模型——WB-F344细胞系来重点研究EPM和胆管形态发生的关系以及EPM调控WB-F344细胞管腔样形态发生的机制,本部分研究内容如下:（一） EPM蛋白诱导WB细胞形成胆管样结构为了证明EPM蛋白和胆管形态的发生和功能的维持密切相关,我们进行了小鼠体内EPM蛋白和胆管的共定位研究。在本研究中,我们采用小鼠CCl4肝损伤模型,首次发现了无论在CCl4肝损伤组织还是正常的肝脏组织中,在胆管周围的间质组织中存在EPM蛋白的高表达。这些结果表明EPM在IHBD正常形态的维持和再生过程中发挥着重要的作用。既然在肝脏内表明EPM可能与胆管的功能维持和再生有关,为了进一步研究EPM与胆管形态发生的关系,我们在体外以大鼠肝干/祖细胞系WB-F344细胞为模型,进一步开展了EPM在WB细胞向胆管系特异性分化和管腔形态发生过程中的作用研究。I-EPM对于WB细胞的增殖具有一定的抑制作用,并能够特异性的诱导WB细胞形成管状样结构,无论是EPM抗体还是其受体β1 integrin的抗体均能阻断i-EPM诱导的形态发生过程;对诱导后的细胞进行肝和胆管系相应特异性标志的RT-PCR和Western Blotting分析表明,肝上皮细胞特异性标志包括ALB,CK18和TAT均未被诱导表达,与肝祖细胞和/或肝上皮细胞系相关的基因如AFP,HNF3α和HNF6受到抑制,胆管特异性标志CK19上调,考虑到i-EPM并不上调成熟胆管的功能性标志如GGT、Yp,我们的结果表明i-EPM特异性诱导WB细胞形成的管腔样结构属于幼稚的胆管系细胞。（二） EPM蛋白具有调控WB细胞有丝分裂方向（MO）的能力Hirai此前曾经提出EPM蛋白排布信息的不同可能会影响三维培养的乳腺上皮细胞团中细胞的有丝分裂方向的推测,而干细胞在分化和自我更新的过程中必然牵涉到细胞有丝分裂方向的调控,因此从本部分研究开始主要探讨i-EPM蛋白促进WB细胞分化的相关生物力学机制。在micropattern模型中,绝大多数WB细胞沿着i-EPM蛋白阵列线和细胞膜交界面的切线方向分裂。在上述micropattern体系中加入抗EPM多克隆抗体、抗EPM受体（β1 integrin）抗体、La-A阻断后,这种i-EPM调控的有丝分裂方向的规律性消失。在i-EPM诱导的管状样结构中也观察到了沿着切线方向分裂的WB细胞。总之我们这部分的研究表明,i-EPM具有调控WB细胞有丝方向分裂定位的能力;而不论在i-EPM诱导MO还是管腔形成（DF）的过程中,细胞黏附和应力纤维的排布都至关重要。（三）外力作用下应力纤维排布方向决定WB细胞有丝分裂方向Micropattern模型中La-A阻断实验结果表明应力纤维方向（SFO）在i-EPM决定WB细胞MO过程中具有潜在重要作用,为了进一步验证SFO在引导细胞有丝分裂方向过程中的重要作用,我们建立了一个经过改进的静态单轴拉伸模型来研究WB细胞在收到外力刺激后SFO对MO的调控作用,结果表明,在持续外力作用条件下,MO从属于SFO,且二者在方向定位上具有高度相关性。（四）细胞黏附、SFO、MO决定在i-EPM诱导WB细胞胆管样结构形成中的作用第一节的工作中我们证明了i-EPM具有诱导WB细胞向幼稚的胆管上皮细胞分化的能力,同时我们发现了一个新的有趣的现象:即具有同样EPM蛋白活性结构域的可溶性EPM（s-EPM）对WB细胞并不具有如同不可溶性EPM蛋白（i-EPM）一样的形态发生效果,究其原因可能和i-EPM蛋白空间分布信息、介导的细胞黏附状态等与s-EPM不同有关,这可能激发的是一条不完全等同于生物化学信号通路的途径。而我们实验室的前期研究也表明Matrigel促进WB细胞向胆管细胞分化过程中需要RhoA蛋白的参与,而RhoA在干细胞分化过程中与细胞骨架的重排和细胞形状的改变等生物力学信号密切相关,那么i-EPM诱导WB细胞向胆管系的分化是否也和i-EPM蛋白空间分布信息调节了细胞骨架有关呢?我们的结果表明,i-EPM在体外可以诱导WB细胞较快的装配形成黏着斑,并诱导WB细胞的应力纤维成束状集中于细胞边缘按一定方向排列,而不接触EPM和抗EPM阻断组的WB细胞的的应力纤维呈杂乱无章分布,尤其是s-EPM处理的WB细胞更为显着。而且F-actin阻断剂La-A可以扰乱管腔样结构的形成。最后我们要探讨的是i-EPM诱导WB细胞MO决定和DF形态发生之间是充分还是必要的关系。在我们的研究中,所有能够扰乱MO决定的因素对于DF结构的形成都有抑制性作用。但我们在培养表面涂布此前报道具有调节细胞MO能力的层纤连蛋白（FN）,却并不能诱导WB细胞分化形成管状样结构。这些结果表明MO定位的决定对于i-EPM诱导形成DF是必需的,但不是充分的。综上所述,我们的研究初步表明,在i-EPM诱导肝干细胞（WB细胞）向胆管系分化,产生管腔样形态发生的过程中,除了传统上研究的生物化学信号通路外,还存在着一条相对独立、不完全依赖于生物化学信号的生物物理信号途径: EPM-β1 integrin-SFO-MO-DF。即i-EPM通过介导细胞的FA组装和引导SF的排布,调节MO,从而诱导DF形态发生。
章雷[8]（2009）在《SEC-10在线虫细胞转运途径中的功能研究》文中提出Exocyst复合物是由SEC-3, SEC-5, SEC-6, SEC-8, SEC-10, SEC-15, EXO-70和EXO-84共8种亚基蛋白组成一种蛋白质复合物,它在细胞内物质的转运中起着重要的作用。目前人们认为exocyst复合物主要作用于囊泡和膜结构融合之前的栓系（tethering）过程,以及囊泡从高尔基体分泌之后被转运到膜附近的过程,但是对于其具体分子机制尚无法完全阐明。此外还有报道exocyst复合物的蛋白组分SEC-5, SEC-8在胞吞中行使功能。为了更加清晰的了解exocyst复合物的作用机理,以及探寻该复合物是否还存在其他未知的功能,我们针对exocyst复合物的蛋白组分SEC-10开展了研究。线虫作为模式生物在诸多方面存在着不可比拟的优势,所以我们选取它作为研究的平台。我们首先构建完成了国内首个高通量线虫突变基因库,通过对该突变基因库进行筛选,我们成功得到sec-10基因突变的线虫种系。我们发现sec-10基因的缺失引起了线虫的多种缺陷表型,而且sec-10基因也广泛地在线虫体内表达。我们分别针对了神经肌肉接头处的信号传递,腔胞的胞吞以及产卵这三个方面进行了研究。神经肌肉接头处的电生理数据显示sec-10基因的缺失对于目前已经报道过的突触后三种离子型受体均不存在影响,而且也未干扰突触前的囊泡自发性分泌。但是药学实验的结果却能够推论出sec-10基因突变种系的突触后膜上受体过度敏感,我们推测是由于突触后膜上离子型受体以外的其他类型受体受到了影响。通过GFP吸收实验,我们发现sec-10基因突变种系的腔胞存在明显的胞吞缺陷,而肌肉分泌GFP完全正常,成像结果显示sec-10基因的缺失严重影响了Clathrin依赖的胞吞途径相关分子的定位和形态,但是sec-10基因突变种系的腔胞中早期内涵体,晚期内涵体,溶酶体以及高尔基体的形态和分布均正常,而且rhodamin-dextran在胞内的定位也和野生型基本一致,因此推测该突变体Clathrin依赖的胞吞途径受阻,而腔胞内转运过程未产生明显改变。最后对于产卵过程中若干关键步骤的检测结果显示,sec-10基因突变种系的肠部分泌卵黄完全正常,而卵母细胞对卵黄的吸收异常,卵黄是受精卵发育过程中的必需营养成分,推测sec-10基因突变种系的受精卵在后继发育过程中养分不足,可能导致产卵障碍。
邢丽丽[9]（2008）在《十足目甲壳动物精子发生过程碱性蛋白的初步研究》文中研究说明精子发生可分为：精原细胞、精母细胞、精细胞、精子四个阶段。精子形成过程是精子发生的最后阶段。精子形成过程中,精细胞形成精子,形态结构发生了显着的变化,染色质高度浓缩,这个过程中核碱性蛋白对浓缩精子核和保护DNA遗传物质起了重要的作用。十足目甲壳动物的精子普遍存在着非浓缩核的现象,有别于其它物种,因此吸引了众多学者对这类动物精子发生、精子形成过程核碱性蛋白的特征进行研究。本文通过对精子发生过程中赖氨酸,精氨酸等碱性氨基酸变化的研究,探究精子发生过程中碱性蛋白的变化,通过组织切片技术结合苯胺蓝染色和坂口反应,研究了中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）、日本沼虾（Macrobrachium nipponense）、细角滨对虾（Penaeus stylirostris）、日本对虾（Penaeus japonicus）、中国明对虾（Fenneropenaeus chinensis）这5种十足目甲壳动物精子发生过程中赖氨酸、精氨酸的变化情况。结果表明：十足目甲壳动物精子发生过程中,赖氨酸含量由多到少；始终没有发现精氨酸。由碱性氨基酸的变化特征推测十足目甲壳动物精子发生过程中碱性蛋白的变化：从其精原细胞到成熟精子未发现鱼精蛋白,核碱性蛋白发生了转移。通过半薄切片结合苯胺蓝染色定性定位研究中华绒螯蟹、中国明对虾、日本沼虾3种十足目甲壳动物精子发生过程中赖氨酸的变化情况。进一步验证：赖氨酸含量由多到少。但辨明了尽管在精子形成阶段发生了细胞核碱性蛋白的转移,但最终是成熟精子细胞核由于保留或新合成仍然存在少量碱性蛋白。对中华绒螯蟹的精子发生过程中核碱性蛋白的提取和电泳分析验证了中华绒螯蟹精巢中碱性蛋白与肌肉组蛋白接近,分子量差异比肌肉组蛋白小。精子核内应仍有碱性蛋白存留,含精子特异的碱性蛋白,分子量更小,认为精子发生过程发生了核碱性蛋白的替代。
李六林[10]（2007）在《‘新高’梨花粉败育的细胞学和生理特性研究》文中认为梨（Pyrus）属于典型的自交不亲和性植物，生产中需要合理配置授粉树，才能达到预期的产量和品质。在栽培的品种中，一些雄性败育的品种，如‘新高’、‘爱宕’和‘黄金梨’等，增加了授粉树选配的问题和生产管理上的困难。为克服梨雄性不育给生产上带来的负面影响和利用雄性不育资源在解决梨花粉直感效应及改善品质方面的潜在价值，本试验以雄性不育‘新高’梨和雄性可育‘丰水’梨为材料，开展梨雄性不育机理的研究。为此，本试验在对‘新高’梨雄性不育性进行鉴定的基础上，研究其花粉败育的时期和特征；并以此为依据，从细胞和亚细胞水平以及荧光物质的分布特性等方面研究了‘新高’花粉败育的细胞学机制；分析花蕾发育过程中矿质营养变化，对Ca2+及其影响Ca2+分布的酶进行了细胞化学定位，以探讨其分布的变化与花粉败育的关系；最后对花蕾中的激素及其影响IAA的酶和多胺进行分析，以从生理角度进一步揭示‘新高’花粉败育的机制。研究主要结果如下：1．‘新高’花药皱缩，发白，虽可以正常开裂，但花粉很少。在少数花药的横切面上虽然可看到微量花粉，但花粉染色很浅，且不规则，没有生活力。‘新高’花粉母细胞能正常进行减数分裂产生四分体；在小孢子产生后，发育缓慢，小孢子壁薄，加厚不明显；随着单核小孢子的液泡化，小孢子粘连降解，或小孢子细胞壁破损，细胞质、细胞核降解消失，很少见到二核花粉。说明‘新高’属于小孢子退化类型的雄性不育品种，小孢子退化主要发生在单核小孢子中期到晚期。2．在花粉母细胞减数分裂前，‘新高’花粉母细胞和花药壁的发育与‘丰水’没差异，药壁包含表皮、药室内壁、中层和绒毡层，花粉母细胞被胼胝质包围。‘新高’四分小孢子染色很浅，胼胝质解体后，‘新高’较‘丰水’小孢子浅染，外粉壁发育迟缓而显得较薄。单核中期大部分小孢子收缩变形，且大小不等，细胞质解体，大部分不见细胞核。随后，小孢子壁破损，内含物外流，小孢子逐渐解体成为空壳或仅留下小孢子壁降解的残余物。在游离小孢子形成时，‘新高’绒毡层出现了不均匀的染色，其它花药壁结构与‘丰水’差异不明显。3．‘新高’在小孢子母细胞时期出现包裹小孢子母细胞的胼胝质厚薄不均匀，部分不完整，胞内线粒体等细胞器的结构模糊，内质网分布少等早期异常现象；在四分体小孢子内小囊泡分布少，线粒体等细胞器的膜呈透明状，之后小孢子液泡膜破裂，细胞质开始解体，线粒体、质体、内质网等细胞器相继解体或退化，核仁解体，最后出现了同心环状的膜状体，以及细胞质及细胞核降解的残骸。而‘丰水’小孢子母细胞和雄配子体的线粒体结构清晰，液泡膜完整，且含有丰富的内质网、核糖体和高尔基体等细胞器，此外在四分体小孢子膜内分散着大量的小囊泡，这些小泡可能与原外壁的形成有关。4．‘新高’四分小孢子表现出局部形成原外壁，或质膜和原外壁分离等不良现象，同时在胞内有很少的小囊泡。在单核小孢子时期，外壁上不能沉积孢粉素或只有表面沉积孢粉素，形成了透明状的外壁或无基足层的外壁，即使有的可以形成完整的外壁，但较正常孢子的外壁薄。而‘丰水’在四分小孢子时期形成了良好的原外壁，在雄配子体发育过程中，其外壁迅速发育。在花粉成熟时，花粉壁由薄的内壁及由基足层、基柱、覆盖层共同组成的外壁构成。两个品种的小孢子母细胞或四分体时期的胼胝质均能正常形成，并能及时降解，没有差异；‘丰水’小孢子外壁的自发荧光物质随雄配子体的发育而逐渐增多，在单核小孢子后期，小孢子外壁上除萌发的孔沟外均匀地沉积大量的自发荧光物质。‘新高’在单核小孢子早期小孢子外壁的荧光物质与‘丰水’差异不大，之后从局部到整个小孢子表面呈透明状，随之变形和相互粘连，有的小孢子表面荧光物质呈网状分布等异常表现。5．‘新高’和‘丰水’小孢子母细胞时期的绒毡层细胞都含有大量的线粒体、内质网等细胞器；随着减数分裂的进行，两个品种的绒毡层细胞质收缩，细胞间和内切相面形成了许多空腔，细胞内高尔基体和分泌小泡增多，内质网膨胀形成槽库结构；四分体时期，‘丰水’绒毡层内分泌小囊泡和槽库结构的内质网进一步增多，并向药室分泌大量的乌氏体，而‘新高’绒毡层细胞内的部分细胞器消失，内质网垛叠，线粒体等细胞器边缘呈透明状，并产生了大量的小液泡；在小孢子发育的过程中，‘新高’并没有像‘丰水’一样出现结构清晰的内质网、线粒体等细胞器，而且出现了一些形态各异、结构模糊的细胞器；在绒毡层细胞解体时，‘丰水’绒毡层细胞内主要为油体等结构，并呈极性分布。而‘新高’细胞内还含有槽库结构的内质网，并和其它结构一起呈无序分布。‘新高’和‘丰水’绒毡层中自发荧光物质都产生于小孢子母细胞时期，以后荧光增强。在四分体小孢子即将释放单核小孢子时，‘丰水’绒毡层细胞表面分布大量的自发荧光物质颗粒，而‘新高’表面的自发荧光物质颗粒较少。6．‘新高’结果枝和结果母枝中Fe、Zn、Cu、Ca、Mg和K含量较‘丰水’低，尤其是结果枝中ca和zn的含量差异更大，只有Mn的差异不显着。从四分体时期开始到单核小孢子后期，‘新高’和‘丰水’梨在花蕾中各矿质营养含量总体上呈逐渐下降的趋势，但‘新高’中Fe、zn、cu、Mg和Ca含量均低于‘丰水’，差异达到显着水平，Mn含量在单核花粉期后显着地高于‘丰水’，K的差异不明显。7．运用焦锑酸钾沉淀法，对‘新高’和‘丰水’花药发育过程中Ca2+进行了细胞化学定位研究。‘新高’和‘丰水’小孢子母细胞膜表面均有Ca2+淀颗粒的分布。在四分体时期，‘丰水’小孢子表面积累了大量的Ca2+沉淀颗粒，而在‘新高’中基本没有Ca2+沉淀颗粒。随着胼胝质的解体，在‘丰水’小孢子的液泡、外壁以及细胞膜等部位均积累了Ca2+沉淀颗粒，‘新高’小孢子中的Ca2+沉淀颗粒则更多地分布在细胞质以及一些细胞器上。‘新高’小孢子中的Ca2+常分布与其花粉败育有关。从小孢子母细胞开始，‘丰水’花药绒毡层的径切向面和内切向面均分布着大小不等的Ca2+沉淀颗粒。随着小孢子的产生和发育，Ca2+沉淀颗粒分布的量逐渐增多。在单核晚期，Ca2+沉淀颗粒又减少。但‘新高’在四分体时期绒毡层中Ca2+沉淀颗粒明显比‘丰水’要少，而单核小孢子时期Ca2+分布较‘丰水’多。8．应用铅沉淀法，分析了花药发育过程中Ca2+-ATPase的分布。‘丰水’小孢子母细胞膜上基本上没有Ca2+-ATPase的分布，只是在一些细胞器上有少量的分布；单核小孢子发育过程中，‘丰水’小孢子质膜及内壁上的Ca2+-ATPaS逐渐增加，但在胞质内分布较少。从小孢子母细胞时期开始，在‘丰水’绒毡层细胞膜和液泡膜等细胞器以及乌氏体上分布有大量的Ca2+-ATPase，随绒毡层的解体而逐渐减少。自四分小孢子开始，‘新高’和‘丰水’花药Ca2+-ATPase就有差别：‘新高’四分小孢子细胞膜几乎没有Ca2+-ATPase的分布，随小孢子的发育质膜上Ca2+-ATPase虽逐渐增多，但比‘丰水’明显少；‘新高’绒毡层膜以及乌氏体有明显Ca2+-ATPase分布，除小孢子母细胞时期外，与‘丰水’的差异不明显。9．‘新高’梨花蕾中IAA含量从四分体后极显着地低于‘丰水’，在单核花粉早期和单核花粉晚期仅为‘丰水’的22．7％和27．0％，‘新高’梨IAA含量的亏缺可能是导致‘新高’败育的原因之一；‘新高’梨在花粉发育的前期IAA氧化酶活性显着地高于‘丰水’，而两个品种POD活性变化一致，并且活性的差异不显着，说明POD不是导致‘新高’IAA含量的亏缺的关键酶；‘新高’梨ABA含量从四分体以后却显着地高于‘丰水’。10．‘新高’花蕾发育过程中游离态的Put和Spd变化幅度不大，‘丰水’则在单核花粉到二核花粉时期出现高峰，其含量是‘新高’的3-5倍；‘新高’中游离态的Spm也显着地低于‘丰水’。‘丰水’中高氯酸可溶共价结合态Put、Spd和Spm含量逐渐增加，‘新高’在花粉败育期或败育前期出现不同于‘丰水’的高峰，此种形态多胺含量的增加可能影响到游离态多胺含量的增加，而影响到花粉的发育。‘新高’和‘丰水’中高氯酸不可溶结合态多胺含量的变化基本一致。‘丰水’中不同种类的多胺均以游离态为主，‘新高’以高氯酸可溶结合态为主。综上所述，本研究从细胞形态、亚细胞水平、细胞化学和生理生化水平上首次对‘新高’雄性不育机理进行了系统的研究。明确了‘新高’花粉败育的时期和主要细胞学机制，探明了‘新高’雄性不育在细胞化学和某些生理生化方面的败育机理。为从分子水平来研究‘新高’雄性不育的机理和人工调控育性的表达提供了理论依据。
二、北京鸭精子发生过程若干超微结构的冷冻蚀刻电镜观察（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、北京鸭精子发生过程若干超微结构的冷冻蚀刻电镜观察（论文提纲范文）
（1）红细胞冷冻保存的历史、机理与研究进展（论文提纲范文）
| 1 前言 |
| 2 红细胞低温保存历史回顾 |
| 2.1 红细胞低温保存的前期探索： |
| 2.2 红细胞低温保存的临床应用： |
| 3 红细胞低温保存机理 |
| 3.1 保护剂引起的渗透性变化： |
| 3.2 冷冻过程中的低温损伤： |
| 3.3 降温速率与两因素假说： |
| 3.4 低温保护剂保护机理： |
| 3.5 复温、压积及储存等： |
| 4 红细胞低温保存新方法 |
| 4.1 新型低温保护剂： |
| 4.2 胞内递送海藻糖： |
| 4.3 冰重结晶抑制剂： |
| 5 总结 |
（2）豆状带绦虫不同发育阶段的结构特征及其致病机理的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| SUMMARY |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 带科绦虫不同发育阶段的结构研究进展 |
| 1 猪带绦虫及其幼虫的结构特点 |
| 1.1 猪带绦虫及六钩蚴的结构特点 |
| 1.2 猪囊尾蚴的结构特点 |
| 2 牛带绦虫及其幼虫的结构特点 |
| 2.1 牛带绦虫与六钩蚴结构特点 |
| 2.2 牛囊尾蚴的结构特点 |
| 3 豆状带绦虫的结构特点 |
| 3.1 豆状带绦虫的结构 |
| 3.1.1 豆状带绦虫的组织结构 |
| 3.1.2 豆状带绦虫的超微结构 |
| 3.2 豆状囊尾蚴的结构 |
| 3.2.1 豆状囊尾蚴的组织结构 |
| 3.2.2 豆状囊尾蚴的超微结构 |
| 3.3 六钩蚴的结构 |
| 3.3.1 六钩蚴的小钩 |
| 3.3.2 六钩蚴的肌肉系统 |
| 3.3.3 六钩蚴的破壳与侵袭 |
| 第二章 囊尾蚴病的研究进展 |
| 1 猪囊尾蚴病概述 |
| 2 牛囊尾蚴病概述 |
| 3 兔豆状囊尾蚴病概述 |
| 本研究的目的和意义 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第一章 豆状带绦虫及其六钩蚴结构的观察 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 仪器与设备 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 试验方法 |
| 1.3.1 动物模型建立与样品采集 |
| 1.3.2 电镜样品的制备与观察 |
| 1.3.3 石蜡切片的制备与观察 |
| 2 结果 |
| 2.1 豆状带绦虫的超微结构 |
| 2.1.1 头节 |
| 2.1.2 颈节 |
| 2.1.3 成节 |
| 2.1.4 孕节 |
| 2.2 豆状带绦虫六钩蚴的超微结构 |
| 2.2.1 六钩蚴的外膜 |
| 2.2.3 六钩蚴的小钩 |
| 2.3 豆状带绦虫的组织结构 |
| 2.3.1 头节 |
| 2.3.2 颈节 |
| 2.3.3 成节 |
| 2.3.4 孕节 |
| 3 讨论 |
| 3.1 成虫的超微结构 |
| 3.2 六钩蚴的超微结构 |
| 3.3 成虫的组织结构 |
| 4 小结 |
| 附图 1：豆状带绦虫及其六钩蚴结构 |
| 第二章 兔豆状囊尾蚴结构的观察 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 仪器与设备 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 动物模型建立与样品采集 |
| 1.3.2 电镜样品的制备与观察 |
| 1.3.3 石蜡切片的制作与观察 |
| 2 结果 |
| 2.1 豆状囊尾蚴的超微结构 |
| 2.1.1 头节 |
| 2.1.2 颈节 |
| 2.1.3 囊壁 |
| 2.2 豆状囊尾蚴的组织结构 |
| 2.2.1 囊壁 |
| 2.2.2 囊腔 |
| 2.2.3 虫体 |
| 3 讨论 |
| 3.1 豆状囊尾蚴的超微结构 |
| 3.1.1 囊壁 |
| 3.1.2 虫体 |
| 3.2 豆状囊尾蚴的组织结构 |
| 3.2.1 囊壁 |
| 3.2.2 虫体 |
| 4 小结 |
| 附图 2：兔豆状囊尾蚴结构 |
| 第三章 家兔实验性豆状囊尾蚴病不同感染时期病变规律的研究 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试剂与设备 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 建立感染模型 |
| 1.4 样品采集 |
| 1.5 切片制备 |
| 2 结果 |
| 2.1 临床症状 |
| 2.2 病理学变化 |
| 2.2.1 大体剖检变化 |
| 2.2.2 病理组织学变化 |
| 3 讨论 |
| 3.1 感染方法 |
| 3.2 临床症状 |
| 3.3 实质器官的病理变化 |
| 4 小结 |
| 附图 3：家兔人工感染豆状囊尾蚴后病理组织学变化 |
| 第四章 家兔实验性豆状囊尾蚴病不同感染时期的血液病理学研究 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要试剂与设备 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 建立感染模型 |
| 1.4 病料采集 |
| 2 结果 |
| 2.1 中性粒细胞的变化结果 |
| 2.2 淋巴细胞的变化结果 |
| 2.3 单核细胞的变化结果 |
| 2.4 嗜酸性粒细胞的变化结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 实验方法 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 中性粒细胞的变化 |
| 3.2.2 淋巴细胞的变化 |
| 3.2.3 单核细胞的变化 |
| 3.2.4 嗜酸性粒细胞的变化 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 附件 1 透射电镜超薄切片的制作方法 |
| 附件 2 石蜡切片的制作方法 |
| 附件 3 HE.染色法 |
| 附件 4 MASSON 氏三色染色法 |
| 附件 5 LANGHAN 氏碘染色法 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 导师简介 |
（3）衣藻纤毛长度调控机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第1章 引言 |
| 1.1 纤毛 |
| 1.1.1 纤毛的形成 |
| 1.1.2 纤毛的结构 |
| 1.1.3 纤/鞭毛内运输机制（Intraflagellar Transport，IFT） |
| 1.1.4 纤毛的功能 |
| 1.1.5 纤毛与人类疾病 |
| 1.2 纤毛的极性和长度调控 |
| 1.2.1 纤毛的极性 |
| 1.2.2 纤毛的长度调控 |
| 1.3 本论文选题意义及研究内容概述 |
| 第2章 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验用菌株和载体 |
| 2.1.2 实验用衣藻株系 |
| 2.1.3 抗体、生化试剂及试剂盒 |
| 2.1.4 常用试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 基因克隆与质粒构建 |
| 2.2.2 蛋白质的原核表达 |
| 2.2.3 酵母菌实验方法 |
| 2.2.4 衣藻实验方法 |
| 第3章 纤毛长度调控 CALK 激酶活性 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 本章实验方法 |
| 3.3 实验结果和分析 |
| 3.3.1 CALK 及其同源蛋白生物信息学分析 |
| 3.3.2 CALK 激酶活性调控位点的确认 |
| 3.3.3 针对 CALK 激酶区 T193 磷酸化修饰特异性抗体制备 |
| 3.3.4 CALK SDS-PAGE 敏感的磷酸化并非 T193 位的磷酸化 |
| 3.3.5 去除纤毛过程中 CALK 激酶活性的变化 |
| 3.3.6 纤毛再生过程中 CALK 的激酶活性变化 |
| 3.3.7 CALK 的激酶活性和纤毛长度呈现线性正相关 |
| 3.3.8 CALK 的激酶活性在突变体中也与纤毛长度呈正相关 |
| 3.3.9 CALK 以及活性 CALK 在细胞中的定位 |
| 3.3.10 CALK 可能调控纤毛前体蛋白进入纤毛的速率 |
| 3.3.11 CALK 活性调节纤毛长度初步研究 |
| 3.4 本章总结 |
| 第4章 CALK 激酶活性的调控 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 本章实验方法 |
| 4.3 实验结果和分析 |
| 4.3.1 在纤毛解聚和纤毛切割过程中 CALK 自我激活 |
| 4.3.2 CALK 的 C 端对于其激酶活性的调控 |
| 4.3.3 CALK 相互作用蛋白的初步鉴定 |
| 4.3.4 CALK 候选相互作用蛋白验证 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 纤毛的比较蛋白组学研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 本章实验方法 |
| 5.3 实验结果和分析 |
| 5.3.1 纤毛蛋白的内源标记和样品收集 |
| 5.3.2 质谱结果分析 |
| 5.3.3 质谱结果验证 |
| 5.4 本章讨论 |
| 第6章 工作总结和讨论 |
| 6.1 工作总结 |
| 6.2 讨论 |
| 6.2.1 CALK 如何感知纤毛长度信号 |
| 6.2.2 CALK 如何调控纤毛长度 |
| 6.2.3 CALK 激酶活性和 C 端磷酸化的关系 |
| 6.2.4 CALK 激酶活性与纤毛长度调控 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录A 常用溶液配制方法 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果 |
（4）畜禽补体C3d基因克隆及序列分析和重组鸡C3d免疫佐剂效果研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 DNA 疫苗及C3d 分子佐剂的研究进展 |
| 综述一 DNA 疫苗的研究进展及其免疫应答增强策略 |
| （一） DNA 疫苗的研究进展 |
| 1、核酸疫苗的研究历史 |
| 2、核酸疫苗的组成和分类 |
| 2.1 核酸疫苗的组成 |
| 2.2 核酸疫苗的分类 |
| 3、DNA 疫苗的免疫机制 |
| 4、核酸疫苗的优点及其不足 |
| 4.1 核酸疫苗的优点 |
| 4.2 核酸疫苗的不足 |
| 5、影响DNA 免疫效果的主要因素 |
| 5.1 目的基因的选择 |
| 5.2 载体及启动子的选择 |
| 5.3 增强剂和佐剂的应用 |
| 5.4 接种途径和剂量 |
| 5.5 接种前动物组织的预处理 |
| （二） DNA 疫苗免疫应答增强策略 |
| 1、分子佐剂的应用 |
| 1.1 细胞因子基因佐剂 |
| 1.2 共刺激分子 |
| 1.3 补体佐剂 |
| 1.4 免疫刺激序列（immunostimulation sequence，ISS） |
| 1.5 霍乱毒素（choleratoxin，CT）和大肠杆菌不耐热肠毒素（heat-labile enterotoxin，LT） |
| 1.6 蛋白转换域（protein transduction domains，PTD） |
| 1.7 模拟或增强MHC 作用 |
| 1.8 提高APC 存活时间和捕捉处理抗原的能力 |
| 1.9 提高抗原处理能力 |
| 1.10 双作用子的应用 |
| 2、通过基因修饰改变抗原特性以提高其免疫原性 |
| 3、载体的优化及选择 |
| 3.1 质粒载体 |
| 3.2 细菌载体 |
| 3.3 病毒载体 |
| 4、免疫方案的优化 |
| 4.1 免疫途径 |
| 4.2 免疫工具的选择 |
| 4.3 免疫程序及组合免疫 |
| 5、展望 |
| 综述二 补体系统概述及C3d 分子佐剂的研究进展 |
| （三） 补体系统概述 |
| 1、补体成分的分类 |
| 1.1 补体系统的固有成分 |
| 1.2 补体系统的调节因子 |
| 1.3 补体受体 |
| 1.4 补体活性片段 |
| 2、补体系统的激活 |
| 2.1 经典激活途径 |
| 2.2 替代途径 |
| 2.3 凝集素途径 |
| （四） CR2-C3d 的结构特征及生物学功能 |
| 1、分子特征 |
| 1.1 C3d 分子 |
| 1.2 CR2(CD21 分子) |
| 1.3 CR2-C3d 结合的结构特征 |
| 2、C3d-CR2 结合介导的生物学效应及作用机理 |
| 2.1 C3d-CR2 结合介导、增强B 细胞Ag 的内化、提呈 |
| 2.2 C3d-CR2 结合促进B 细胞活化及分化 |
| 2.3 C3d-CR2 结合促进记忆性B 细胞的产生 |
| （五） C3d 分子佐剂的研究进展 |
| 1、分子佐剂的应用 |
| 2、C3d 的分子结构 |
| 3、C3d 分子的佐剂作用 |
| 3.1 C3d 可提高抗流感病毒、抗麻疹病毒HA 抗体的水平 |
| 3.2 C3d 可以增强基因免疫效果 |
| 3.3 C3d 可促进抗HIV-1 衣壳蛋白抗体的生成 |
| 3.4 C3d-P28 可在提高体液免疫应答的同时增强基因免疫诱导的HBV 特异性细胞免疫应答 |
| 3.5 C3d 可增强PPS514 的免疫原性、促进Ig 类别转换 |
| 3.6 C3d 负调控HER-2/neu 基因免疫诱导的免疫应答 |
| 3.7 C3d 增强hCGβ的免疫原性、转变免疫应答 |
| 3.8 C3d 与靶抗原共表达的免疫抑制效应 |
| 4、C3d 分子佐剂作用的可能机制 |
| 4.1 C3d 偶联抗原可增强CR~(2+)细胞（B 细胞，FDC 等）对抗原的摄取 |
| 4.2 C3d/C3dg 包裹的抗原被 BCR 特异性识别产生抗原刺激信号,同时又与 B 细胞表面的CR2 结合形成交联桥，提供共刺激活化信号，促进B 细胞活化，降低B细胞的活化阈 |
| 4.3 C3d 通过结合CR2、上调IL-4 和转录因子的表达、促进抗体亲合力成熟来增强基因免疫诱导的HBV 特异性免疫应答 |
| 4.4 分子佐剂C3d 上调Raji 细胞协同刺激分子B7-1 和B7-2 的表达 |
| 4.5 C3d 的佐剂作用依赖B 细胞CR2 受体，且相应的抗原必须与C3d 偶联在一起才能发挥作用 |
| （六） 本研究的目的及意义 |
| 第二部分 试验研究部分 |
| 一 不同畜禽补体C3d 基因的克隆及序列分析 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株 |
| 1.1.2 载体 |
| 1.1.3 试剂及试剂盒 |
| 1.1.4 试验动物 |
| 1.1.5 主要仪器 |
| 1.1.6 试验所用溶液及其配制 |
| 1.1.7 RT-PCR 相关物品的处理 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 肝脏总RNA 的提取 |
| 1.2.2 引物设计 |
| 1.2.3 RT- PCR 扩增C3d cDNA |
| 1.2.4 制作感受态细胞 |
| 1.2.5 PCR 产物与pMD18-T 的连接 |
| 1.2.6 连接物的转化 |
| 1.2.7 重组质粒的鉴定 |
| 1.2.8 测序 |
| 1.2.9 补体C3d 基因序列分析 |
| 1.2.10 补体C3d 基因蛋白质结构分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 RT-PCR 扩增C3d cDNA |
| 2.2 pMD18-T-C3d 的PCR 及酶切鉴定 |
| 2.3 补体C3d cDNA 的测序及序列分析 |
| 2.3.1 测序结果递交GenBank |
| 2.3.2 利用DNASTAR 软件进行C3d 基因序列比较分析 |
| 2.3.3 DNAMAN 及Vector NTI 软件进行CR2 结合区氨基酸同源性比较 |
| 2.4 蛋白序列结构及功能特征预测 |
| 2.4.1 ProtParam tool 程序对C3d 基因编码的蛋白质进行理化性质分析 |
| 2.4.2 ProtFun 2.2 程序对C3d 基因编码的蛋白质进行蛋白功能推测分析 |
| 2.4.3 补体C3d 基因编码的蛋白质二级结构预测分析 |
| 2.4.4 补体C3d 基因编码的蛋白质三级结构预测分析 |
| 3 讨论 |
| 二 鸡补体C3d 原核表达载体的构建及其重组蛋白的纯化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 载体与受体菌 |
| 1.1.2 试验动物 |
| 1.1.3 试剂 |
| 1.1.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）试剂 |
| 1.1.5 包涵体纯化的有关试剂 |
| 1.1.6 免疫转印有关试剂和材料 |
| 1.1.7 仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 鸡肝脏总RNA 的提取 |
| 1.2.2 RT-PCR 及C3d cDNA 的克隆、测序 |
| 1.2.3 C3d 原核表达载体的构建 |
| 1.2.4 重组质粒的提取与初步筛选 |
| 1.2.5 pET-C3d 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达 |
| 1.2.6 重组菌表达条件的优化 |
| 1.2.7 聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 1.2.8 表达产物的Western-blotting 检测 |
| 1.2.9 重组表达蛋白的纯化 |
| 2 结果 |
| 2.1 C3d cDNA 的克隆及其PCR、酶切鉴定 |
| 2.2 pET-32a-C3d 表达载体的PCR 及酶切鉴定 |
| 2.3 重组蛋白的表达 |
| 2.4 IPTG 诱导表达最佳浓度的确定 |
| 2.5 IPTG 诱导表达最佳作用时间的确定 |
| 2.6 目的蛋白的表达量分析 |
| 2.7 Western-Blotting 结果 |
| 2.8 融合蛋白的纯化 |
| 2.8.1 硫酸铵盐析 |
| 2.8.2 Sephadex G-200 凝胶过滤层析 |
| 2.8.3 蛋白质纯度的鉴定 |
| 2.8.4 蛋白浓度的测定 |
| 3 讨论 |
| 3.1 重组C3d 原核表达系统的选择 |
| 3.2 重组C3d 目的蛋白的表达 |
| 3.3 重组C3d 目的蛋白的复性 |
| 3.4 重组C3d 目的蛋白的检测鉴定 |
| 3.5 重组C3d 目的蛋白的分离提纯 |
| 三 鸡补体C3d 重组蛋白对大肠杆菌疫苗的免疫增强作用研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 抗C3d 21 肽抗体 |
| 1.1.2 SPF 鸡血清及SPF 鸡 |
| 1.1.3 菌株 |
| 1.1.4 新西兰白兔 |
| 1.1.5 1%致敏绵羊红细胞 |
| 1.1.6 主要试剂 |
| 1.2 C3d 佐剂大肠杆菌疫苗的制备 |
| 1.2.1 重组C3d 蛋白的分离纯化 |
| 1.2.2 大肠杆菌抗原的制备 |
| 1.2.3 C3d 与大肠杆菌抗原的连接 |
| 1.3 C3d 佐剂疫苗的作用效果试验 |
| 1.3.1 动物试验免疫方案 |
| 1.3.2 抗体效价的检测（间接ELISA 方法） |
| 1.3.3 总补体活性测定（微量板溶血法） |
| 2 结果 |
| 2.1 不同佐剂疫苗的效果比较 |
| 2.2 疫苗注射对补体总活性的影响 |
| 3 讨论 |
| 四 鸡补体C3d 重组蛋白对新城疫病毒灭活油乳苗的免疫增强作用研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 新城疫油乳剂灭活苗 |
| 1.1.2 重组C3d 佐剂新城疫油乳剂灭活苗的制备 |
| 1.1.3 血清和抗原 |
| 1.1.4 攻毒用新城疫病毒 |
| 1.1.5 实验用鸡 |
| 1.1.6 主要试剂及其配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 重组C3d 蛋白的纯化制备 |
| 1.2.2 试验动物分组免疫及样品采集 |
| 1.2.3 血清HI 抗体的检测 |
| 1.2.4 淋巴细胞增殖试验（MTT 法） |
| 1.2.5 攻毒保护试验 |
| 1.2.6 数据处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 三组试验鸡在免疫接种后不同时期HI 抗体的检测结果 |
| 2.2 三组试验鸡在免疫接种后不同时期法氏囊B 淋巴细胞增殖情况 |
| 2.3 三组试验鸡在免疫接种后不同时期胸腺T 淋巴细胞增殖情况 |
| 2.4 攻毒保护试验结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 C3d 分子佐剂与淋巴细胞增值试验（MTT 法） |
| 3.2 重组C3d 蛋白和灭活油乳苗的免疫协同作用 |
| 3.3 重组C3d 分子佐剂研究意义及现状 |
| 五 鸡补体C3d-p29 多聚体与新城疫 F 基因真核表达重组质粒的构建及其表达 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验材料及仪器设备 |
| 1.1.1 试验材料 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 P29 串联体的构建 |
| 1.2.2 pcDNA-P29.n(n=2，4，6)的构建 |
| 1.2.3 RT-PCR 扩增新城疫(F48E9 株)F 基因 |
| 1.2.4 插入抗原基因 |
| 1.2.5 重组真核表达质粒转染鸡胚成纤维细胞(CEF) |
| 2 结果 |
| 2.1 新城疫C3d-P29 分子佐剂F 基因疫苗的构建 |
| 2.2 构建P29 串联体 |
| 2.2.1 单拷贝P29 基因克隆 |
| 2.2.2 P29 串联体的构建 |
| 2.3 RT-PCR 扩增新城疫F48E9 株F 基因 |
| 2.4 抗原基因的插入 |
| 2.5 转染细胞中pcDNA-F-C3d-P29.n F 表达蛋白的检测结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 DNA 疫苗佐剂研究的意义 |
| 3.2 抗原基因的选择及C3d-P29 多聚体的构建 |
| 3.3 脂质体及影响其转染CEF 细胞的因素 |
| 六 鸡C3d-P29 重组质粒特异性增强鸡补体总活性与C3 含量的初步研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 主要仪器设备 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 试验动物分组及免疫注射 |
| 1.2.2 不同试验组鸡血清补体总活性的测定 |
| 1.2.3 各试验组鸡血清中总补体活性测定（微量板溶血法） |
| 1.2.4 抗鸡C3 21 肽抗体的制备 |
| 1.2.5 抗鸡C3 21 肽抗体工作浓度的确定 |
| 1.2.6 C3 含量标准曲线的绘制 |
| 1.2.7 各试验组鸡血清补体C3 含量的测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 各试验组鸡血清中补体总活性 |
| 2.1.1 溶血素效价的测定 |
| 2.1.2 各试验组鸡血清中补体总活性的测定 |
| 2.2 兔抗鸡C3 21 肽IgG 抗体工作浓度的确定 |
| 2.3 溶液中C3 含量与OD 值关系的标准曲线 |
| 2.4 各试验组鸡血清中补体C3 的含量、 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 微量板溶血法测定动物血清补体的效价 |
| 3.2 影响补体效价测定的因素 |
| 3.3 补体总活性与动物的抗病力 |
| 3.4 C3 21 肽的合成及抗C3 21 肽抗体的制备 |
| 3.5 补体C3 与动物的抗病力 |
| 七 新城疫补体C3d 分子佐剂疫苗免疫效果的研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 常用试剂配制 |
| 1.1.2 制备新城疫油乳剂灭活苗用佐剂 |
| 1.1.3 新城疫油乳剂灭活苗的制备 |
| 1.1.4 ELISA 常用试剂 |
| 1.1.5 主要仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 重组质粒的大量提取 |
| 1.2.2 质粒的安全性检验 |
| 1.2.3 质粒疫苗的体液免疫效果检测 |
| 1.2.4 攻毒保护试验 |
| 1.2.5 病毒排放的检测 |
| 1.2.6 解剖检查 |
| 1.2.7 重组质粒疫苗的细胞免疫效果检测 |
| 1.2.8 重组鸡补体C3d 质粒（pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6）及原核表达重组C3d 蛋白（rChC3d）对外周血T 淋巴细胞增殖效果对比试验 |
| 2 结果 |
| 2.1 安全性检验结果 |
| 2.2 血凝抑制抗体变化 |
| 2.3 间接ELISA 法检测NDV 抗体最佳工作浓度的确定结果 |
| 2.4 NDV 核酸疫苗在SPF 雏鸡体内诱导抗体的检测结果 |
| 2.5 攻毒保护试验结果 |
| 2.6 免疫鸡攻毒后的病毒分离结果 |
| 2.7 重组质粒疫苗细胞免疫效果的检测结果 |
| 2.8 pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6 与rChC3d对外周血T淋巴细胞增殖效果对比试验结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 新城疫核酸疫苗研究的意义 |
| 3.2 疫苗注射部位、注射方式和免疫剂量的选择 |
| 3.3 采用淋巴细胞转化试验（MTT 法）进行外周血T 淋巴细胞增殖实验效果的讨论 |
| 3.4 本源动物补体C3d 及抗原基因的选择 |
| 3.5 C3d 的CR2 结合域P29 的特殊性 |
| 3.6 C3d 分子佐剂作用的可能机制 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录一 C3d 基因编码的蛋白质二级结构预测 |
| 附录二 使用garnier 软件对C3d 二级结构预测结果 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表论文情况 |
（5）镉对小鼠精母细胞凋亡及附睾内精子质量的影响（论文提纲范文）
| 上海交通大学学位论文答辩决议书 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 镉的简介 |
| 1.2 镉污染现状 |
| 1.3 动物体内镉的代谢 |
| 1.3.1 镉进入机体的途径 |
| 1.3.2 镉在动物体内的分布 |
| 1.3.3 镉的代谢特点 |
| 1.4 镉的毒性及其研究进展 |
| 1.4.1 镉对骨骼的影响 |
| 1.4.2 镉对肾脏的影响 |
| 1.4.3 镉对肝脏的影响 |
| 1.4.4 镉与癌症 |
| 1.4.5 镉毒性研究的其他方面 |
| 1.5 镉的生殖毒性研究进展 |
| 1.5.1 对睾丸和附睾的影响 |
| 1.5.2 对附性腺的影响 |
| 1.5.3 对内分泌功能的影响 |
| 1.5.4 对繁殖性能的影响 |
| 1.6 细胞凋亡检测的主要方法及其特点 |
| 1.6.1 形态学检测 |
| 1.6.2 生物化学检测 |
| 1.6.3 免疫学检测方法 |
| 1.6.4 分子生物学检测 |
| 1.7 实验研究方法 |
| 1.7.1 投射电镜技术 |
| 1.7.2 流式细胞术 |
| 1.8 创新性及研究意义 |
| 1.8.1 创新性 |
| 1.8.2 研究意义及目的 |
| 第二章 实验材料和方法 |
| 2.1 实验材料、试剂和仪器 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 透射电镜实验和Annexin V-PI 双染色法流式细胞术实验试剂 |
| 2.1.3 Tunel 法流式细胞术实验试剂 |
| 2.1.4 试剂盒 |
| 2.1.5 主要仪器和设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 小鼠精细胞超微结构观察 |
| 2.2.2 Annexin V-PI 流式细胞术检测小鼠成熟精子成活率及凋亡率 |
| 2.2.3 Tunel 法流式细胞仪检测小鼠精子凋亡率和DNA 断裂情况 |
| 2.3 实验数据统计分析 |
| 第三章 实验结果和分析 |
| 3.1 镉对小鼠精母细胞超微结构的影响 |
| 3.2 镉对小鼠成熟精子活性及凋亡率的影响 |
| 3.3 镉对小鼠精子凋亡率和DNA 断裂的影响 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 镉对小鼠精母细胞超微结构和成熟精子凋亡的影响 |
| 4.1.1 镉对小鼠精母细胞超微结构的影响 |
| 4.1.2 镉对小鼠成熟精子凋亡率的影响 |
| 4.1.3 镉对小鼠睾丸和附睾内精子DNA 断裂的影响 |
| 4.2 关于实验方法的探索 |
| 4.2.1 形态学观察 |
| 4.2.2 DNA 断裂检测 |
| 4.2.3 流式细胞术 |
| 4.3 镉的生殖毒性机理 |
| 4.3.1 镉的氧化损伤作用 |
| 4.3.2 镉对酶活性的影响 |
| 4.3.3 镉对睾丸间质细胞的影响 |
| 4.3.4 镉-钙相互作用 |
| 4.3.5 镉对细胞凋亡基因的影响 |
| 第五章 结论 |
| 5.1 研究结论 |
| 5.2 下一步研究工作展望 |
| 参考文献 |
| 谢辞 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
（6）精浆游离mRNA一般特征及附睾液游离mRNA功能的初步研究（论文提纲范文）
| 前言 |
| 参考文献 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 人cfsRNA的提取及含量、种类、来源分析 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 人cfs-mRNA一般特性分析 |
| 实验一 人cfs-m RNA完整性及稳定性分析 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验二 人cfs-mRNA存在形式研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 小鼠附睾特异性mRNAs通过附睾小体递入精子的初步研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 研究创新、意义及展望 |
| 综述 |
| 附录 |
| 附录一 英文缩写词一览表 |
| 附录二 攻读博士期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（7）肝/造血共祖细胞的鉴定及Epimorphin调控肝干细胞分化的机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表(Abbreviations) |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 肝/造血共祖细胞的鉴定 |
| 前言 |
| 第一节 小鼠胎肝HPP-CFC 体系的建立及向肝系细胞分化 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 小结 |
| 第二节 小鼠胎肝细胞的分选 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 小结 |
| 第三节 小鼠胎肝HPP-CFC 单克隆源性的鉴定 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 小结 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 Epimorphin调控肝干细胞分化的机制研究 |
| 前言 |
| 第一节 EPM 蛋白诱导WB 细胞形成胆管样结构 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 小结 |
| 讨论 |
| 第二节 EPM 蛋白具有调控WB 细胞有丝分裂方向的能力 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 小结 |
| 讨论 |
| 第三节 应力纤维排布方向决定WB 细胞有丝分裂方向 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 小结 |
| 讨论 |
| 第四节 细胞黏附、SFO、MO 决定在i-EPM 诱导WB 细胞胆管样结构形成中的作用 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 小结 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 主要仪器 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（8）SEC-10在线虫细胞转运途径中的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 线虫概述 |
| 1.2 Clathrin依赖的胞吞 |
| 1.3 Exocyst复合物 |
| 2 实验原理和研究方法 |
| 2.1 线虫培养方法 |
| 2.2 线虫基因突变库的建立和使用 |
| 2.3 绿色荧光蛋白 |
| 2.4 共聚焦激光扫描显微镜 |
| 2.5 线虫电生理记录 |
| 2.6 线虫显微注射 |
| 2.7 线虫杂交技术 |
| 3 Sec-10对线虫神经肌肉接头处离子型乙酰胆碱受体影响的研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料和方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 4 Sec-10对腔胞的影响 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料和方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 5 Sec-10对产卵的影响 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料和方法 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.4 讨论 |
| 6 全文总结与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录1 攻读学位期间发表的论文目录 |
| 附录2 主要符号和缩略词表 |
（9）十足目甲壳动物精子发生过程碱性蛋白的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 组蛋白研究进展 |
| 1.1.1 染色质的概念 |
| 1.1.2 组蛋白的替代 |
| 1.1.3 精子形成过程染色质的变化 |
| 1.1.4 精子形成过程中核碱性蛋白的变化 |
| 1.1.5 十足目甲壳动物核碱性蛋白的研究进展 |
| 1.1.6 精子核碱性蛋白特征 |
| 1.2 中华绒螯蟹生殖生物学 |
| 1.2.1 中华绒螯螯的雄性生殖系统 |
| 1.2.2 中华绒螯蟹的精子发生过程 |
| 1.2.3 中华绒螯蟹的精子结构 |
| 1.3 对虾生殖生物学 |
| 1.3.1 对虾雄性生殖系统 |
| 1.3.2 对虾精子发生过程 |
| 1.3.3 中国明对虾精子特征 |
| 1.4 日本沼虾生殖生物学 |
| 1.4.1 日本沼虾雄性生殖系统 |
| 1.4.2 日本沼虾精子发生过程 |
| 1.5 研究目的及意义 |
| 第2章 石蜡切片观察十足目甲壳动物精子发生过程碱性氨基酸的变化 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 仪器 |
| 2.2.3 溶液配制 |
| 2.2.4 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 精子发生过程赖氨酸的变化 |
| 2.3.2 精子发生过程精氨酸的变化 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 半薄切片法观察十足目甲壳动物精子发生过程中赖氨酸的变化 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 中华绒螯蟹精子发生过程碱性蛋白的提取和电泳分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.1.1 组蛋白的提取 |
| 4.1.2 组蛋白的电泳分析方法 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 材料 |
| 4.2.2 仪器 |
| 4.2.3 方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳系统 |
| 4.3.2 酸性-尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳系统 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 核碱性蛋白制备 |
| 4.4.2 碱性蛋白的电泳分析 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 图版说明 |
| 图版 |
| 致谢 |
（10）‘新高’梨花粉败育的细胞学和生理特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.花药和花粉的发育 |
| 1.1 花药的发育 |
| 1.2 花粉的发育 |
| 2.植物雄性不育的表现及细胞学研究进展 |
| 2.1 植物雄性不育的表现 |
| 2.2 败育发生的主要时期及特点 |
| 2.3 绒毡层的发育与雄性不育的关系 |
| 2.4 胼胝质异常与雄性不育 |
| 2.5 花粉败育过程中超微结构的变化 |
| 3.ATP酶细胞化学定位与雄性不育的关系 |
| 3.1 ATP酶细胞化学定位的基本原理 |
| 3.2 植物ATP酶的细胞化学定位研究 |
| 4.钙与花粉发育的关系 |
| 4.1 钙在细胞中的分布及其调控机制 |
| 4.2 钙与花粉败育的关系 |
| 5.生长调节物质与雄性不育的关系 |
| 5.1 多胺与植物雄性不育的关系 |
| 5.2 激素与植物雄性不育的关系 |
| 6.果树雄性不育研究进展 |
| 7.立论的依据和意义 |
| 第二章 ‘新高’梨花粉不育性的鉴定及其发育的细胞学研究 |
| 第一节 梨花粉萌发率的分析及‘新高’梨花粉不育性的鉴定 |
| 1.材料和方法 |
| 2.结果与分析 |
| 2.1 梨花粉萌发率的比较 |
| 2.2 ‘新高’梨花粉不育性的鉴定 |
| 3.讨论与结论 |
| 图版说明 |
| 第二节 ‘新高’梨花粉败育的时期及其细胞形态特征的研究 |
| 1.材料与方法 |
| 2.观察结果 |
| 2.1 ‘新高’花粉母细胞减数分裂行为的观察 |
| 2.2 小孢子发育的形态观察 |
| 3.讨论与结论 |
| 图版说明 |
| 第三节 ‘新高’花粉败育过程的细胞学观察 |
| 1.材料与方法 |
| 2.观察结果 |
| 2.1 绒毡层和小孢子形成前的细胞学观察 |
| 2.2 绒毡层和小孢子发育的细胞学观察 |
| 2.3 表皮、花药内壁和中层细胞的形态变化 |
| 3.讨论与结论 |
| 图版说明 |
| 本章小结 |
| 第三章 ‘新高’花粉败育过程中超微结构的特征及荧光物质的消长变化 |
| 第一节 ‘新高’小孢子发生和败育过程中细胞超微结构的变化 |
| 1.材料与方法 |
| 2.观察结果 |
| 2.1 ‘丰水’小孢子的发生及其发育过程中超微结构的观察 |
| 2.2 ‘新高’小孢子的发生及其败育过程中超微结构的观察 |
| 3.讨论与结论 |
| 图版说明 |
| 第二节 ‘新高’小孢子细胞壁发育及自发荧光物质的特征和胼胝质壁变化 |
| 1.材料与方法 |
| 2.观察结果 |
| 2.1 小孢子发育过程中细胞壁的变化 |
| 2.2 小孢子形成过程中胼胝质的动态变化 |
| 2.3 小孢子形成过程中荧光物质的动态变化 |
| 3.讨论与结论 |
| 图版说明 |
| 第三节 ‘新高’花药绒毡层超微结构变化及其分泌荧光物质的特性 |
| 1.材料与方法 |
| 2.观察结果 |
| 2.1 绒毡层超微结构的观察 |
| 2.2 绒毡层分泌自发荧光物质的特性 |
| 3.讨论与结论 |
| 图版说明 |
| 本章小结 |
| 第四章 ‘新高’梨花蕾中矿质元素的变化及细胞化学定位的研究 |
| 第一节 ‘新高’梨花粉败育与矿质元素含量变化的关系 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果分析 |
| 2.1 梨花粉发育过程中微量元素含量的变化 |
| 2.2 梨花粉发育过程中大量元素含量的变化 |
| 3.讨论与结论 |
| 第二节 ‘新高’花药中Ca~(2+)细胞化学定位与其花粉败育的关系 |
| 1.材料与方法 |
| 2.观察结果 |
| 2.1 ‘丰水’花药中Ca~(2+)的分布 |
| 2.2 ‘新高’花药中Ca~(2+)的分布 |
| 3.讨论与结论 |
| 图版说明 |
| 第三节 ‘新高’花药发育过程中Ca~(2+)-ATPase分布与其花粉败育的关系 |
| 1.材料与方法 |
| 2.观察结果 |
| 2.1 ‘丰水’花药中Ca~(2+)-ATPase的分布 |
| 2.2 ‘新高’花药中Ca~(2+)-ATPase的分布 |
| 3 讨论与结论 |
| 图版说明 |
| 本章小结 |
| 第五章 ‘新高’梨花粉败育与生长调节物质的变化的关系 |
| 第一节 ‘新高’梨花粉败育与激素变化的关系 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果分析 |
| 2.1 花粉发育过程中生长素含量的变化 |
| 2.2 花粉发育过程中IAA氧化酶和POD活性的变化 |
| 2.3 花粉发育过程中Zn和Mn含量的变化 |
| 2.4 花粉发育过程中ABA含量的变化 |
| 3.讨论与结论 |
| 第二节 ‘新高’梨花粉败育与内源多胺含量变化的关系 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果分析 |
| 2.1 花粉发育过程中不同形态腐胺含量的变化 |
| 2.2 花粉发育过程中不同形态亚精胺含量的变化 |
| 2.3 花粉发育过程中不同形态精胺含量的变化 |
| 3.讨论与结论 |
| 本章小结 |
| 第六章 综合讨论 |
| 1.‘新高’花粉败育的细胞学机制 |
| 2.‘新高’花粉败育与Ca~(2+)分布的关系 |
| 3.‘新高’花粉败育与生长调节物质变化的关系 |
| 全文结论及创新点 |
| 1、全文结论 |
| 2、论文创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在校期间发表和送审的论文 |
四、北京鸭精子发生过程若干超微结构的冷冻蚀刻电镜观察（论文参考文献）
- [1]红细胞冷冻保存的历史、机理与研究进展[J]. 沈凌霄,赵刚. 临床输血与检验, 2021(03)
- [2]豆状带绦虫不同发育阶段的结构特征及其致病机理的研究[D]. 范希萍. 甘肃农业大学, 2013(07)
- [3]衣藻纤毛长度调控机制的研究[D]. 曹木青. 清华大学, 2013(08)
- [4]畜禽补体C3d基因克隆及序列分析和重组鸡C3d免疫佐剂效果研究[D]. 刘栋. 山东农业大学, 2010(05)
- [5]镉对小鼠精母细胞凋亡及附睾内精子质量的影响[D]. 戴成吉. 上海交通大学, 2010(10)
- [6]精浆游离mRNA一般特征及附睾液游离mRNA功能的初步研究[D]. 黄诗韵. 华中科技大学, 2010(11)
- [7]肝/造血共祖细胞的鉴定及Epimorphin调控肝干细胞分化的机制研究[D]. 周军年. 中国人民解放军军事医学科学院, 2009(09)
- [8]SEC-10在线虫细胞转运途径中的功能研究[D]. 章雷. 华中科技大学, 2009(11)
- [9]十足目甲壳动物精子发生过程碱性蛋白的初步研究[D]. 邢丽丽. 河北大学, 2008(S1)
- [10]‘新高’梨花粉败育的细胞学和生理特性研究[D]. 李六林. 南京农业大学, 2007(09)