一、人IL-15cDNA真核表达载体的构建及其在BEL-7402细胞中的表达（论文文献综述）
秦颖[1]（2014）在《人IL-15在K562细胞中的表达研究》文中提出白细胞介素15（Interleukin-15,IL-15）是一种多能的细胞因子，能够促进淋巴细胞和NK细胞的增殖且对免疫系统中各种免疫细胞都具有重要的调节作用。IL-15表现出与IL-2在抗肿瘤、免疫调节等方面相似的生物学作用而备受关注。本实验利用RT-PCR技术从人外周血单个核细胞中克隆了人IL-15cDNA部分序列，并以其为模板分别扩增出IL-15编码序列（coding sequence，CDS）以及引入CD8α跨膜肽的IL-15编码序列，利用基因组技术构建分泌型人IL-15克隆载体pMD–T-IL-15、表达载体pVITRO2-IL-15以及膜结合型IL-15克隆载体pMD–T-mbIL-15、表达载体pVITRO2-mbIL-15。分别将表达载体转染K562细胞，检测分泌型IL-15在K562细胞中表达情况，并通过细胞流式技术鉴定，以期获得能稳定表达的膜结合IL-15的K562细胞株。对进一步研究其在免疫系统中的重要作用，并为其在肿瘤基因治疗、免疫治疗等奠定了基础。结果表明，本实验成功克隆了人IL-15CDS序列，在此基础上正确构建了重组人IL-15分泌型真核表达载体pVITRO2-IL-15和重组人IL-15跨模型真核表达载体pVITRO2-mbIL-15。最后通过将重组真核表达载体分别转染K562细胞，检测了分泌型IL-15在K5625细胞中的表达，并获得稳定表达膜结合IL-15蛋白的重组K562细胞株。
何谦,陈钜豪,房红莹,卢俊鹏,张欣,崔敏,曾小娜,刘健,罗满林[2]（2011）在《猪IL-15 cDNA真核表达载体的构建、表达及其免疫佐剂效应》文中研究表明参考GenBank发表猪IL-15mRNA序列设计引物,用RT-PCR方法扩增猪IL-15cDNA,并克隆到pMD18-T载体中,通过PCR、酶切和测序验证克隆正确,再亚克隆到真核表达载体pcDNA-3.1（+）上,得到重组质粒pcD-NA-pIL-15。在脂质体介导下,重组质粒pcDNA-pIL-15转染AD-293细胞。以鼠抗猪IL-15为一抗,用间接免疫荧光分析表明猪IL-15基因均在AD-293细胞中成功进行了瞬时表达。小鼠免疫试验表明,pcDNA-pIL-15作为免疫佐剂,能够有效提高小鼠的脾T细胞增殖,加强pcDNA-ORF2（PCV2）质粒免疫过程中的特异性中和抗体的产生,为进一步研制猪IL-15基因佐剂疫苗及进行临床实验奠定基础。
石娜[3]（2010）在《猪IL-15与PRRSV ORF5基因真核表达质粒的构建及其免疫原性分析》文中进行了进一步梳理本实验分别将（猪繁殖与呼吸综合征病毒）PRRSV ORF5基因与猪IL-15基因亚克隆至pVAX1真核表达载体中,构建了两个重组真核表达质粒pVAX1-PRRSV ORF5和pVAX1-pIL-15。通过脂质体转染法将pVAX1-PRRSV ORF5和pVAX1-pIL-15转入Vero细胞中进行了表达,试验结果表明,两个基因都可以在体外进行表达,且表达的蛋白可以被PRRSV ORF5和pIL-15多克隆抗体所检测。以pVAX1-PRRSV ORF5和pVAX1-pIL-15重组真核表达质粒免疫小鼠,分为7个组,分别是pVAX1-PRRSV ORF5单独免疫组、pVAX1-pIL-15单独免疫组、pVAX1-PRRSV ORF5（100μg）与pVAX1-pIL-15（100μg）联合免疫组、pVAX1-PRRSV ORF5（100μg）与pVAX1-pIL-15（200μg）联合免疫组、pVAX1-PRRSV ORF5（100μg）与pVAX1-pIL-15（50μg）联合免疫组、pVAX1空载体对照组和PBS对照组。利用淋巴细胞转化试验、酶联免疫吸附试验、流式细胞仪技术对不同处理组小鼠的各项免疫指标进行了检测。试验结果表明,各免疫组小鼠的各项免疫指标均比pVAX1空载体对照组和PBS对照组高,加入pIL-15的结果尤为显着。在淋巴细胞转化试验和CD4+、CD8+细胞数量的变化及小鼠血液中IFN-γ的检测试验中,加pIL-15中剂量（100μg）组的效果最为明显,其次是加pIL-15小剂量（50μg ）组,加pIL-15大剂量（200μg）组的效果差于以上两组,但也比pVAX1-PRRSV ORF5单独免疫组效果明显。而酶联免疫吸附试验检测抗PRRSV ORF5 IgG的结果显示,加pIL-15大剂量（200μg）组的免疫效果优于其他各组。同时在不同时间点收集组织样品,通过PCR检测pVAX1-PRRSV ORF5质粒在小鼠体内的动态分布情况。结果表明,肌肉注射核酸疫苗后,pVAX1-PRRSV ORF5迅速分布到小鼠其他组织器官中,在免疫后3 h即可在脑组织、心脏、肝脏、肺脏、肾脏中检测到,一直持续到免疫后42天。本实验还构建了二个pGEX-6p-pIL-15原核表达质粒,二个质粒分别缺失了pIL-15 N端29 aa和48 aa信号肽序列。在大肠杆菌中获得了高效表达的pIL-15蛋白。纯化后蛋白免疫新西兰大白兔获得兔源多克隆抗体。酶联免疫吸附试验和免疫荧光结果表明pIL-15蛋白与多克隆抗体均具有生物学活性。综上,本研究首次将pIL-15基因与PRRSV ORF5基因质粒联合免疫。实验结果表明pIL-15基因作为PRRSV ORF5抗原基因分子佐剂,不但能促进机体的细胞免疫应答,而且能够提高机体体液免疫应答,进而提高了机体的免疫反应。为进一步研究pIL-15生物活性提供了数据,同时为新型免疫增强型抗病毒疫苗的研究提供了理论基础。
韩国全[4]（2009）在《含沙门菌内源启动子新型双功能表达载体的构建及其在猪瘟病毒疫苗研究中的应用》文中认为为适应以减毒胞内寄生菌为运载体的兽用基因疫苗研究发展趋势,研究构建含有减毒胞内寄生菌自身内源性诱导启动子的新型双功能基因疫苗表达载体,以增强基因疫苗诱导有效保护性免疫。基于以上考虑,本课题研究旨在研制含猪霍乱沙门菌内源性诱导启动子的新型双功能基因疫苗通用表达载体,既能够在运载体原核细胞中可调控表达携带抗原基因,又能够在真核细胞中启动表达携带抗原基因,以期与S.C500合用开发适于粘膜免疫的猪群重组活菌疫苗。为此,本研究首先扩增出猪霍乱沙门菌nirB、pagC两基因启动子区域片段,然后分析其启动活性,进一步构建新型双功能表达载体pCB-neo、pCC-neo,系统研究表达载体的启动活性特点,检验S.C500运送以pCB-neo、pCC-neo基础构建的基因疫苗的可行性。本课题研主要研究内容包括:Ⅰ.猪霍乱沙门菌nirB、pagC基因启动子区域分子克隆及其生物信息学分析为获得沙门菌nirB、pagC两基因启动子区域片段,利用PCR技术从猪霍乱沙门菌疫苗株S.C500基因组DNA中扩增出启动子PnirB、PpagC基因区域片段,经TA克隆筛选及测序鉴定,成功构建克隆重组质粒pUCX-PnirB、pUCX-PpagC。序列分析结果显示启动子PnirB、PpagC与其它沙门菌相关序列核苷酸同源性较高,分别为96%～100%、93%～99%,其中与霍乱沙门菌SC-B67核苷酸同源性分别高达100%、99%,说明两启动子基因区域高度保守。生物信息学网络软件NNPP分析结果显示,PnirB启动子基因区域序列有3个较强的启动子Promotor序列,PpagC启动子基因序列有12个较强的启动子Promotor序列,说明试验所扩增的两个基因启动子区域片段具有启动基因表达的基本元件。Ⅱ.沙门菌nirB、pagC基因启动子启动活性研究为考察沙门菌启动子的启动表达能力及特点,运用基因工程技术构建携带有沙门菌内源性启动子PnirB、Ppagc的单一启动子表达载体pPB、pPC,进一步构建其报告基因载体pPB-EGFP、pPC-EGFP,并转化到S.C500中进行相应的诱导性表达。通过表达菌液荧光观察、菌细胞表达荧光检测、SDS-PAGE检测,确证EGFP的获得成功表达,证实克隆获得的启动子PnirB、PpagC区域基因片段在S.C500中具有启动活性。Ⅲ.新型双功能基因疫苗通用表达载体的构建及表达活性研究为研制含沙门菌内源启动子的新型双功能基因疫苗表达载体,利用PCR技术亚克隆启动子必需区域基因片段PnirB（CB）（190bp）、PpagC（CC）（490bp）,并设计添加SD-Kozak杂合序列,替换pCI-neo启动子Pcmv下游的Chimeric intron基因区域,构建双功能疫苗表达载体pCB-neo、pCC-neo。进一步构建报告基因载体pCB-EGFP、pCC-EGFP。实现EGFP在S.C500中表达,证实PnirB（CB）、PpagC（CC）可以在S.C500中驱动外源基因的表达;实现EGFP在Vero细胞中表达,证实原载体中启动子Pcmv可以在Vero中驱动外源基因的表达,说明下游新插入的启动子不影响其启动活性:实现EGFP在小鼠体外培养巨噬细胞中表达,进一步证实S.C500运送以pCB-neo、pCC-neo为表达载体构建的新型基因疫苗的可行性。Ⅳ.内江猪白细胞介素15基因的分子克隆、表达及免疫佐剂作用研究为获得内江猪白细胞介素15基因序列片段,利用RT-PCR技术从经由Con A刺激的内江猪PMBC扩增了pIL-15基因,经TA克隆筛选及测序鉴定,成功构建克隆重组克隆质粒pUCX-njpIL-15。构建原核表达载体pMAL-pmIL-15,实现pIL-15在大肠杆菌中高效表达。MTT法试验显示融合产物MBP-pmIL-15经初步纯化、透析复性后,可明显增强淋巴细胞增殖。构建真核表达载体pCI-pIL-15,与pCI-gD（PRV）联合肌注免疫BALB/c雌性小鼠试验显示,pCI-pIL15能够促进小鼠脾脏CD4+T、CD8+T细胞数量增殖,加强基因疫苗pCI-gD（PRV）特异性中和抗体的产生:试验证实内江猪IL-15具有免疫佐剂作用。Ⅴ.猪瘟病毒E2蛋白主要抗原区编码基因的分子克隆与原核表达研究为获CSFV-E2基因片段,利用RT-PCR技术从PK-15细胞增殖的CSFV四川分离株中成功分子克隆E2基因,含有编码E2蛋白完整基因序列,共1119 bp,编码373 aa。构建原核表达载体pET-mE2（pe）、pET-E2（pe）,转化到宿主菌E.coli Rosetta-gami-TM（DE3）plysS进行表达研究,SDS-PAGE电泳检测及Western blot分析结果显示,试验成功表达的mE2（pe）、E2（pe）均具有一定的生物学免疫反应活性。CSFV-E2主要抗原位点区域（mE2）的成功原核表达,为进一步研究新型猪瘟病毒基因疫苗奠定理论基础。Ⅵ.猪IL-15与CSFV-E2双基因融合表达载体的构建及表达研究运用分子生物学实验技术将内江猪IL-15成熟肽基因与CSFV-E2主要抗原位点区域基因有机连接,构建融合双基因的克隆重组质粒pUCX-ME2-IL-15。构建真核表达载体pEGFP-ME2-IL-15,转染到Vero细胞中,荧光检测证实表达出增强型绿色荧光蛋白融合蛋白,证实试验构建的目的融合双基因ME2-IL-15可以在真核Vero细胞中获得表达,为进一步研究融合双基因ME2-IL-15奠定理论基础。构建融合双功能重组表达载体pCB-ME2-IL-15、pCC-ME2-IL-15及对照真核重组表达载体pCI-ME2-IL-15,分别将pCB-ME2-IL-15、pCC-ME2-IL-15转化到S.C500,SDS-PAGE电泳及Western-blott检测显示融合双基因ME2-IL-15在S.C500中成功表达,证实PnirB（CB）、PpagC（CC）可以在S.C500中驱动融合双基因ME2-IL-15的表达:将pCB-ME2-IL-15、pCC-ME2-IL-15、pCI-ME2-IL-15转染到哺乳动物Vero细胞中,mRNA转录、间接免疫荧光及夹心ELISA检测结果证实Pcmv可以在Vero中驱动外源基因ME2-IL-15的表达。为进一步研究S.C500运载双基因融合表达基因疫苗奠定试验基础。Ⅶ.融合双基因疫苗在S.C500中的稳定性及其对运载菌侵袭力影响的研究为了考察融合双基因疫苗表达载体在运载菌S.C500中的稳定性及其对运载菌侵袭力的影响,试验对构建的重组工程活菌苗进行系统研究。结果显示,双功能表达载体pCB-ME2-IL-15、pCC-ME2-IL-15及对照pCI-ME2-IL-15存在与否不影响运载菌S.C500的生物学特性,对其生化鉴定特性亦不影响,除Amp抗性外,重组菌与运载菌的药敏性一致;基因疫苗表达载体所插入的融合双基因ME2-IL-15增加其在运载菌S.C500体内的稳定性;基因疫苗的存在使运载菌S.C500对ST细胞的粘附能力、侵袭能力及其在ST细胞体内的增殖能力均有一定程度的下降,对运载菌本身的免疫效应有一定影响;口服免疫28日龄BALB/c雌性小鼠具有一定的稳定性和免疫安全性,可以有效的将基因疫苗运载至免疫小鼠机体细胞;为研究S.C500运载基因疫苗的免疫应答奠定前提。Ⅷ.融合双基因疫苗重组S.C500活菌苗口服接种家兔的免疫应答初步研究为检测家兔血清中S.C500抗体水平,建立猪霍乱沙门菌血清抗体间接ELISA检测方法,确立抗原最佳包被浓度为0.305μg/mL,血清最适稀释度为1:40,试验测定血清样品的D492 nm值,判定标准通过标准阴性血清按照P/N比值公式进行判断,P/N≥2.1为阳性,1.5＜P/N≤2.1为可疑,1.5＜P/N为阴性;可以间接反应抗体水平的高低。家兔血清CSFV抗体检测结果显示对照A组（口服PBS缓冲液对照）无CSFV抗体,B组（口服S.C500/pCB-ME2-IL-15）、C组（口服S.C500/pCC-ME2-IL-15）、D组（口服S.C500/pCI-ME2-IL-15）、E组（口服S.C500/pCI-ME2）首免后14天即已产生CSFV抗体,第二、三次均呈上升趋势,B、C组免疫效果优于D、E组,B、C组之间相比C组免疫效果稍好,D、E组之间相比D组免疫效果稍好,试验研制的双功能疫苗通用表达载体pCB-neo、pCC-neo具有一定优势;S.C500抗体检测结果显示,试验构建的四个重组工程菌组经灌服均产生了较高的抗体水平,对照灌服PBS缓冲液组未能检测到抗S.C500特异性抗体的存在。免疫家兔T淋巴细胞增殖检测分析显示,对照A组家兔三次T淋巴细胞增殖率均低于15%,之间差异亦不大;B、C、D、E四个口服免疫组T淋巴细胞增殖率均高于18%以上,末次免疫后14d,B组增殖率有小幅度下降,C、D、E三组增殖率均有不同程度的增强提高。于末次免疫后14d,用4头份猪瘟兔化弱毒脾淋苗肌肉注射进行攻毒,以热反应为判定标准,保护率依次为0%、40%、60%、40%、25%,说明S.C500为运载体的猪瘟基因疫苗能够诱导家兔产生一定抗CSFV的保护性特异抗体,其中试验研制的基因疫苗通用表达pCC-neo携带的抗原基因保护率较高,具有一定优势。采用4×1010 CFU/只剂量的猪伤寒沙门菌野毒株口服接种攻毒试验,结果表明试验所构建的四个重组工程菌均能够诱导家兔产生一定水平的抗猪伤寒沙门菌野毒株的保护性特异抗体。
王衡[5]（2009）在《鸡传染性支气管炎免疫增强型核酸疫苗的构建与免疫保护机理的研究》文中认为本研究首先对IBV S、IBV S1及ChIL-15基因进行修饰改造,并构建了三段修饰后基因的真核表达载体质粒。在此基础上,利用一段编码（G4S）3多肽的碱基linker将ChIL-15分别与IBV S和IBV S1基因进行连接,并成功构建了两个融合基因真核表达载体质粒,即pcDNA3.1-IBV S1-linker-ChIL-15及pcDNA3.1-IBV S-linker-ChIL-15质粒。两个融合基因质粒的体外瞬时转染试验表明,融合基因能够在细胞内进行表达,同时表达后的融合蛋白可以被ChIL-15单克隆抗体和IBV全病毒粒子多克隆抗体检测出来,进一步证明了融合基因表达的蛋白保留了融合前两段基因各自的生物活性,为后续动物免疫试验提供了理论基础。在动物免疫试验中设计了7个处理组,即S组（免疫IBV S基因真核表达质粒）、S1组（免疫IBV S1基因真核表达质粒）、S+IL-15组（混合免疫IBV S基因与ChIL-15真核表达质粒）、S1+IL-15组（混合免疫IBV S1基因与ChIL-15真核表达质粒）、S-IL-15组（免疫IBV S与ChIL-15融合基因真核表达质粒）、S1-IL-15组（免疫IBV S1与ChIL-15融合基因真核表达质粒）,以及1个空质粒对照组组（C组）。同时,利用淋巴细胞转化试验、酶联免疫吸附试验、实时荧光定量PCR技术及流式细胞仪技术对不同处理龄雏鸡的各项免疫指标进行了检测,最后应用病毒攻击试验进一步比较了不同质粒之间保护率的差别。试验结果表明,6组免疫组各日龄多数免疫指标都高于C组,其中有ChIL-15基因参与的S+IL-15、S1+IL-15、S-IL-15及S1-IL-15四组免疫组免疫效果尤为突出。具体表现为:T、B淋巴细胞增殖功能,CD4+、CD8+、、TCRαβ+及TCRγδ+T细胞数量,外周血液中抗IBV特异性抗体水平以及免疫器官中IL-2 mRNA的表达量与C组相比较都有明显的提高,而且以S1-IL-15组最为显着。对S组及S1组比较时发现,S1组的最明显优势在于其可以较早地诱导机体产生细胞免疫及体液免疫应答。攻毒后对各试验组IBV靶器官进行了病理组织学研究,同时还对不同免疫组之间的免疫保护率进行了比较,结果进一步证明了ChIL-15能够很好地提高机体的免疫保护能力,尤其是S1-IL-15抵御病毒感染的能力更为突出,这也表明在linker帮助下融合基因能够在机体内更好地发挥二者的生物学协同作用,而且ChIL-15能够更有效地展示其免疫增强作用的优势。综上所述,通过本试验研究表明,ChIL-15基因在配合IBV抗原基因免疫过程中,不但能够促进机体的细胞免疫应答能力,而且能够提高机体体液免疫应答的能力,进而促进机体产生较强的免疫力以抵抗病毒的攻击。本试验首次构建的ChIL-15基因与病毒抗原基因融合基因质粒以及试验结果为进一步研究ChIL-15的生物活性提供了试验依据,同时为探讨开发研制新型免疫增强型抗病毒疫苗提供了理论基础。
孟庆玲[6]（2008）在《减毒鼠伤寒沙门氏菌介导的斯氏艾美耳球虫DNA疫苗研究》文中指出兔球虫病是由艾美耳科的球虫引起的一种寄生性原虫病,随着规模养兔的迅速发展,该病对我国养兔业的危害日益严重。目前,报道的感染家兔的艾美耳属球虫有15个种,其中斯氏艾美耳球虫（Eimeria stiedai,Es）的致病力最强、危害最大,它寄生于兔的肝胆管上皮细胞,能引起严重的肝球虫病。尽管化学药物是目前控制兔球虫病的常用手段,但随着耐药虫株的不断出现和化学药物残留问题的日益凸现,越来越多的学者寻求用免疫学方法来防控该病。本研究应用无球虫兔和单卵囊分离技术进行了Es LZ株的分离,运用RT-PCR技术成功扩增出Es LZ株微线蛋白5（MIC-5）基因,并进行了原核表达和纯化;克隆了兔IL-15基因;以含有双启动子的pBudCE4.1为载体,构建了真核表达质粒pBMIC-5-IL-15,通过脂质体转染BHK-21细胞,证实该真核表达质粒能正确表达重组蛋白Es MIC-5和IL-15。在上述研究的基础上,根据载体-宿主平衡致死系统的原理,将asd基因引入真核表达质粒pBMIC-5-IL-15中,相继电转化asd基因缺陷型减毒鼠伤寒沙门氏菌X3730和X4550,从而构建了pBMIC-5-IL-15-asd载体-沙门氏菌平衡致死系统。遗传稳定性试验表明,该载体能稳定存在于减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550中。用携带重组质粒pBMIC-5-IL-15-asd的减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550在无球虫兔上进行了免疫试验。结果表明,重组菌X4550/pBMIC-5-IL-15-asd能诱导机体产生较高水平的抗球虫细胞免疫应答和体液免疫应答,有较好的免疫保护作用。以上试验为兔肝球虫病口服疫苗的研制奠定了基础。
杜娟[7]（2008）在《乙肝病毒核心抗原和截短型中蛋白对TRAIL诱导肝细胞凋亡的影响及分子机制研究》文中进行了进一步梳理乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）在感染肝细胞中极易发生基因片段的整合从而导致病毒在机体内长期存在不易被清除,如今已经成为世界性难题。目前关于乙肝及其所致肝癌的发病机制还不是很明确。但已有研究证实,HBV感染所致肝细胞凋亡失衡在乙肝患者肝细胞损伤及其乙肝患者不同的预后、转归中发挥着不容忽视的、甚至是决定性的作用。TNF相关的凋亡诱导配体（TNF related apoptosis inducing ligand,TRAIL）是继FasL之后被发现、命名的肿瘤坏死因子家族新成员。TRAIL区别于TNF家族其他凋亡分子的突出特点是可特异性诱导肿瘤细胞或病毒感染细胞凋亡,而不影响正常组织细胞的功能。现有的研究表明,TRAIL诱导的凋亡在机体清除巨细胞病毒（CMV）、脑心肌炎病毒（ECMV）等多种病毒感染细胞的过程中发挥重要作用。那么关于TRAIL在HBV的致病过程,及其在HBV相关肝癌中的作用机制至今尚不清楚。HBV病毒包含4个开放读码框架（open reading frame,ORF）,这些读码框架往往以基因片段的形式整合入肝细胞内,分别编码出相应的病毒蛋白。根据HBV感染这一特性,我们课题组提出HBV全基因组、各个基因片段所编码的病毒蛋白是否对TRAIL诱导的凋亡发挥作用呢?这些作用的后果是否造成了乙肝患者的病情不同转归呢?经过研究,我们首次提出HBV全基因组、HBx蛋白、截短型中蛋白（Truncated middle surface proteins,MHBs（t））能够上调TRAIL诱导的肝细胞凋亡,并且发现HBV全基因组、HBx蛋白通过上调凋亡通路分子Bax表达发挥上调机制。那么,截短型中蛋白（MHBs（t））上调TRAIL诱导的肝细胞凋亡的机制是什么呢?另一关键性基因区段编码蛋白HBV核心抗原蛋白（HBV core antigen,HBc）在TRAIL诱导凋亡发挥怎样的作用呢?在前期研究基础上,本课题率先开展了有关HBV核心抗原对TRAIL凋亡的影响及其分子机制的研究和截短型中蛋白上调TRAIL诱导的肝细胞凋亡的机制研究,并取得了一定的研究成果。目的:1.探讨HBV核心抗原（HBcAg）对TRAIL诱导肝细胞凋亡的影响及分子机制的研究。2.探讨截短型中蛋白（MHBs（t））上调TRAIL诱导肝细胞凋亡的分子机制。方法:1.HBc的表达对TRAIL诱导凋亡的影响1.1包含HBc基因真核表达载体的构建设计、合成针对HBc基因的特异性引物,以pUC19/3HBV（adr亚型）为模板,PCR扩增获得相应的基因片段。PCR反应产物经酶切定向克隆入真核表达载体pcDNA3.0内,转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,经抗性筛选、酶切、DNA测序鉴定获得阳性重组子,并被分别命名为pcDNA-HBc。1.2稳定表达HBc蛋白肝癌细胞模型的建立pcDNA-HBc及空载体对照pcDNA3.0以阳离子脂质体介导的方式分别转染肝癌细胞BEL7402,SMMC7721。经G418筛选4周后,获得阳性细胞克隆。传代扩增,获得稳定细胞株,并分别命名为BEL7402-HBc、BEL7402-pcDNA3,及SMMC7721-HBc、SMMC7721-pcDNA3细胞。半定量RT-PCR分别检测HBcmRNA的表达,Western blot检测HBc蛋白质的表达。1.3尾静脉高压注射建立HBc在体内肝细胞表达模型BALB/c小鼠通过尾静脉高压注射法注射pcDNA3.0、pcDNA-HBc、pcDNA-HBV1.1以及pcDNA-HBV1.1+pcDNA-HBc四种不同质粒组合。48h后,免疫组织化学检测小鼠肝组织内HBc的表达,HE染色,血清ALT水平检测肝脏炎症。1.4 HBc的表达对TRAIL诱导凋亡的影响细胞模型检测:不同浓度TRAIL分别作用BEL7402、BEL7402-pcDNA3、BEL7402-HBc:SMMC7721、SMMC7721-pcDNA3、SMMC7721-HBc细胞,24h后CCK-8法检测不同浓度TRAIL对各组细胞的生长抑制情况,确定最佳作用浓度。以10ng/mL TRAIL作用于BEL7402各组细胞,24h后TUNEL流式细胞术检测各组细胞的凋亡率;caspase 3活化水平检测试剂盒检测caspase 3活化水平。以100ng/mL TRAIL作用于SMMC7721各组细胞,24h后TUNEL流式细胞术检测各组细胞的凋亡率。同时设计合成针对HBc的反义寡核苷酸,TUNEL检测反义封闭BEL7402-HBV1.1细胞中HBc的表达对TRAIL诱导凋亡的影响。另外,TUNEL检测BEL7402-HBx细胞中转染HBc对TRAIL诱导凋亡效应的影响。动物体内模型检测:尾静脉高压注射法注射pcDNA3.0、pcDNA-HBc、pcDNA-HBV1.1以及pcDNA-HBV1.1+pcDNA-HBc四种不同质粒组合。48h后,TUNEL原位标记法检测各组小鼠模型肝切片中肝细胞凋亡情况。TUNEL流式细胞术检测各组小鼠模型肝细胞凋亡率。2.HBc的表达影响TRAIL诱导凋亡的机制研究1)胞膜受体水平:细胞模型检测:半定量RT-PCR分别检测BEL7402、BEL7402-pcDNA3、BEL7402-HBc;SMMC7721、SMMC7721-pcDNA3、SMMC7721-HBc细胞中TRAIL受体mRNA水平的表达,Western blot、流式细胞术检测各组细胞TRAIL受体蛋白质水平的表达。动物体内模型检测:尾静脉高压注射法注射pcDNA3.0、pcDNA-HBc、pcDNA-HBV1.1以及pcDNA-HBV1.1+pcDNA-HBc四种不同质粒组合。48h后,分别通过免疫组织化学、流式细胞术以及Western blot检测各组小鼠模型中DR5蛋白水平的表达情况。临床标本检测:取110例慢性乙肝病人血清,分别检测血清中乙肝病毒核心抗原阳性率和血清中sDR5表达。免疫组化检测慢性乙肝患者肝穿刺标本免疫组化检测DR4、DR5的表达。2)胞浆凋亡通路水平细胞模型检测:Western blot分别检测10ng/mL TRAIL作用24h后,BEL7402、BEL7402-pcDNA3、BEL7402-HBc细胞procaspase3、8、9,Bid的表达水平。RT-PCR、Western blot检测各组细胞Bax、FLIP的表达水平。动物体内模型检测:尾静脉高压注射法注射pcDNA3.0、pcDNA-HBc、pcDNA-HBV1.1以及pcDNA-HBV1.1+pcDNA-HBc四种不同质粒组合。48h后,Western blot检测各组小鼠肝细胞Procaspase 3,8,9及其Bid的表达。3)基因转录水平HBc对DR5启动子活性的影响:BEL7402-pcDNA3、BEL7402-HBc细胞中同时转染DR5启动子的报告质粒pDR5PF。48h后,采用双荧光素酶报告基因（Dual Luciferase Reporter,DLR）检测系统检测荧光素酶活性。3.HBc转染前后BEL7402肝癌细胞系基因芯片研究稳定转染细胞BEL7402-pcDNA3、BEL7402-HBc经Trizol法提取总RNA。经RNA纯化与质检,质检合格后RNA送检进行芯片实验。4.截短型中蛋白上调肝癌细胞凋亡的分子机制Western blot检测BEL7402、BEL7402-pcDNA3及BEL7402-MHBs（t）细胞中ERK2的磷酸化水平。PD98059抑制ERK2磷酸化以后:TUNEL流式细胞术检测BEL7402-pcDNA3及BEL7402-MHBs（t）细胞在TRAIL作用下的凋亡情况;Western blot检测BEL7402-pcDNA3及BEL7402-MHBs（t）细胞中procaspase 3、8、9表达情况。结果:1.HBc的表达下调TRAIL诱导的肝细胞凋亡1.1成功构建pcDNA-HBc真核表达载体以pUC19/3.0HBV为模板,PCR成功扩增HBc基因片段,酶切、连接构建重组载体,并成功转化宿主菌,经Ampr抗性筛选、酶切鉴定、DNA序列分析获得阳性重组质粒pcDNA-HBc。1.2成功建立稳定表达HBc的肝癌细胞模型pcDNA-HBc或pcDNA3.0转染肝癌细胞BEL7402、SMMC7721获得稳定细胞株,分别命名为BEL7402-HBc、BEL7402-pcDNA3及SMMC7721-HBc、SMMC7721-pcDNA3细胞。半定量RT-PCR及Western blot可在细胞中检测到HBc mRNA和蛋白的表达。1.3尾静脉高压注射法成功建立HBc在体内肝细胞表达模型尾静脉高压注射法注射pcDNA3.0、pcDNA-HBc、pcDNA-HBV1.1以及pcDNA-HBV1.1+pcDNA-HBc四中不同质粒组合。48h后,免疫组织化学法可检测到小鼠肝组织内有明显的HBc的表达,而在对照组肝组织未检测到表达。HE染色结果显示,pcDNA-HBV1.1+pcDNA-HBc注射组比pcDNA-HBV1.1注射组炎症反应的程度明显降低。血清ALT水平检测显示pcDNA-HBV1.1+pcDNA-HBc组ALT值明显低于pcDNA-HBV1.1（P＜0.01）。1.4 HBc的表达下调TRAIL诱导的肝细胞凋亡细胞模型检测CCK-8检测结果显示,相同浓度TRAIL作用下,BEL7402-HBc细胞较对照组细胞的生长抑制率明显降低,当作用浓度为10ng/mL时,差异最为显着,因此将该浓度作为其后实验的作用浓度。同样,SMMC7721-HBc细胞较对照组细胞的生长抑制率明显降低,当作用浓度为100ng/mL时,差异最为显着,因此将该浓度作为其后实验的作用浓度。TUNEL流式细胞术结果显示,10ng/mL和100ng/mL TRAIL分别BEL7402-HBc和SMMC7721-HBc细胞后,与对照组细胞相比凋亡率明显降低（P＜0.01）。化学底物显色实验结果显示,在10ng/mLTRAIL作用下,BEL7402-HBc的caspase 3活化水平明显低于对照组（P＜0.01）。同时设计合成针对HBc的反义寡核苷酸,TUNEL检测反义封闭BEL7402-HBV1.1细胞中HBc的表达对TRAIL诱导凋亡的影响。TUNEL结果显示,反义封闭HBc后,BEL7402-HBV1.1细胞的凋亡率明显上调（P＜0.01）。另外,BEL7402-HBx细胞中转染HBc后,凋亡率明显下调（P＜0.01）。动物体内模型检测TUNEL原位标记法显示:pcDNA-HBV1.1注射组肝细胞显示凋亡的绿色荧光强且密集,而pcDNA-HBV1.1+pcDNA-HBc注射组凋亡信号明显减弱。TUNEL流式细胞术显示,pcDNA-HBV1.1+pcDNA-HBc注射组肝细胞凋亡率显着低于pcDNA-HBV1.1注射组（P＜0.01）。2.HBc的表达下调TRAIL诱导凋亡的机制研究1)胞膜受体水平:细胞模型检测:半定量RT-PCR、real-time PCR、Western blot和流式细胞术结果显示,HBc转染组细胞和对照组细胞相比,仅DR5的表达明显降低（P＜0.01）,而TRAIL其他三个受体在mRNA水平和蛋白质水平的表达均无显着性差异（P＞0.05）。动物体内模型检测:流式细胞术、Western blot以及免疫组织化学检测DR5蛋白水平的表达,结果显示:pcDNA-HBc注射组DR5表达明显低于pcDNA3.0注射组;同样,pcDNA-HBV1.1+pcDNA-HBc注射组DR5表达明显低于pcDNA-HBV1.1注射组（P＜0.01）。临床标本检测:对110例慢性乙肝病人血清中检测,结果显示:81%的患者血清中乙肝病毒核心抗原为阳性。慢性乙肝患者血清中sDR5水平明显低于正常体检人群（P＜0.01）。免疫组化检测结果显示,慢性乙肝患者肝穿刺标本DR5的表达明显低于正常对照组（P＜0.01）。2)胞浆凋亡通路水平:细胞模型检测:10ng/mL TRAIL作用下,BEL7402-HBc细胞中procaspase 3、8、9、Bid的表达水平显着高于对照组细胞（P＜0.01）。FLIP和Bax的表达无显着性差异（P＞0.05）。动物体内模型检测:Western blot检测小鼠肝组织Procaspase3,8,9及其Bid的表达结果显示,以上四个分子的表达在pcDNA-HBV1.1+pcDNA-HBc注射组的表达明显高于pcDNA-HBV1.1注射组（P＜0.01）。3)HBc降低DR5启动子活性:双荧光素酶报告基因系统检测结果显示,DR5启动子相对活性在BEL7402-HBc细胞中的明显低于BEL7402-pcDNA3中（P＜0.01）。说明HBc能够明显降低DR5启动子活性。3.HBc转染前后BEL7402肝癌细胞系基因芯片研究基因芯片结果显示:DR5表达在BEL7402-HBc细胞组明显低于BEL7402-pcDNA3细胞组。另外,综合分析结果表明,获得的差异表达基因中,35%左右的基因为癌基因或者是抑癌基因。10%左右基因与肝癌发生相关。我们选择了文献已经有明确报道的与肝癌发生相关的四个基因Sulf-2、ATIP1、LOXL1、DLC-1,进行实时定量PCR检测,结果与芯片检测结果一致。4.截短型中蛋白上调肝癌细胞凋亡的分子机制4.1截短型中蛋白促进ERK2分子的活化Western blot结果显示,BEL7402-MHBs（t）细胞中可以检测到磷酸化ERK2,而对照组中均未检测到。4.2 ERK2的磷酸化是MHBs（t）上调凋亡的关键因素PD98059抑制ERK2磷酸化后,TUNEL流式细胞术检测TRAIL诱导的肝细胞凋亡,结果显示:BEL7402-MHBs（t）细胞凋亡明显受到抑制,说明磷酸化ERK2在MHBs（t）上调TRAIL诱导肝细胞凋亡过程中起到关键作用（P＜0.01）。4.3抑制ERK2磷酸化可逆转MHBs（t）上调凋亡的的分子机制Western blot检测PD98059抑制ERK2磷酸化后对TRAIL诱导的procaspase 3、8、9活化的影响。结果显示:10ng/mL TRAIL作用下,BEL7402-MHBs（t）细胞procaspase 3、9的活化水平明显降低。从而进一步证明磷酸化ERK2在MHBs（t）上调TRAIL诱导肝细胞凋亡过程中起到关键作用。结论:1.HBc表达可降低TRAIL诱导肝细胞凋亡的敏感性,证实HBc具有抵抗TRAIL诱导凋亡的生物学活性。2.HBc的表达可通过抑制DR5启动子活性来下调DR5蛋白的表达水平,并且可降低TRAIL传导通路中procaspase 3,8,9、Bid的活化水平,而TRAIL其他受体的表达和胞浆FLIP、Bax蛋白的表达无明显变化。3.HBc转染前后BEL7402肝癌细胞系基因芯片研究显示:HBc的表达可能与HBV相关肝癌的发生有一定的相关性。4.MHBs（t）可促使ERK2磷酸化,并且在MHBs（t）上调肝细胞凋亡过程中发挥关键作用。创新点及意义:1.本研究分别通过建立稳定转染肝癌细胞模型和硫代反义寡核苷酸封闭的方法,正、反向论证了HBV基因片段HBc在影响TRAIL诱导凋亡中的作用,并率先报道了HBc的表达可下调肝癌细胞对TRAIL诱导凋亡的敏感性,为进一步深入阐明HBV感染相关疾病的发病机制提供实验依据,为临床治疗提供新的靶点。2.本研究从TRAIL凋亡通路的胞膜受体水平、胞浆凋亡通路水平及线粒体依赖途径和线粒体非依赖途径,深入探讨了HBc影响TRAIL诱导凋亡的分子机制,提出HBc可能通过调节线粒体依赖途径和非依赖途径凋亡信号的传导来影响TRAIL诱导的细胞凋亡。3.应用尾静脉高压注射法,在小鼠肝细胞内表达HBc基因,并在体内进一步证实HBc的表达可下调TRAIL诱导的肝细胞凋亡,为HBc基因功能的体内研究建立了一种有价值的实验模型。4.应用双荧光报告载体系统首次提出HBc能够下调DR5启动子活性,为进一步的机制研究奠定基础。5.首次通过基因芯片的研究,提出HBc的表达与HCC发生的相关性研究是一项很有价值的研究课题。6.运用肝癌细胞模型率先报道了MHBs（t）可通过活化ERK2分子的表达,从而上调肝癌细胞对TRAIL诱导凋亡的敏感性,为MHBs（t）在肝细胞凋亡中作用机制的研究奠定基础。
胡慧琼[8]（2006）在《四川山地乌骨鸡IL-2、15、18、IFN-γ基因克隆测序及分子佐剂效应研究》文中研究说明鸡白细胞介素2（IL-2）、IL-15、IL-18及干扰素-γ（IFN-γ）是鸡体内重要的细胞因子，在鸡抗病和免疫应答反应中有重要作用。四川山地乌骨鸡是地方优良品种，具有生长快，适应性广、抗病力强等特点。目前有关四川山地乌骨鸡的IL-2、IL-15、IL-18及IFN-γ及其免疫学特性的研究，国内外均未见报道。克隆四川山地乌骨鸡IL-2、IL-15、IL-18及IFN-γ基因，研制分子免疫佐剂及其对疫苗的佐剂效应，提高疫苗免疫应答，有重要学术价值和应用前景。 1．本试验用RT-PCR方法从conA刺激的四川山地乌骨鸡的外周血淋巴细胞总RNA扩增了鸡白细胞介素2及γ-干扰素基因的cDNA。将分离的cDNA片段克隆到PMD18-T载体，进行序列测定分析。结果表明：鸡IL-2基因全部的开放阅读框432bp，与Genbank数据库中的序列进行同源性比较发现：山地乌骨鸡IL-2基因与其他品种鸡IL-2基因核苷酸同源性为98.4-99.5％。鸡IFN-γ基因全部的开放阅读框495bp，与GeneBank上报道的核苷酸序列同源性为97.4％-100％。四川山地乌骨鸡IL-2和IFN-γ克隆在国内外尚未见报道，本试验所克隆的鸡IL-2及IFN-γ基因，丰富了IL-2及IFN-γ基因的资源库，为进一步研究提供了基础材料。 2．用RT-PCR方法从conA刺激四川山地乌骨鸡的脾淋巴细胞总RNA扩增了鸡白细胞介素15基因的cDNA。将分离cDNA片段的克隆到PMD18-T载体，进行序列测定分析。结果表明：鸡IL-15基因基因全部的开放阅读框564bp，与Genbank上序列比较发现，山地乌骨鸡IL-15与其他序列同源性为98.9-99.8％。目前很少关于鸡IL-15的研究报道，四川山地乌骨鸡IL-15克隆在国内外尚未见报道，本试验为进一步研究鸡IL-15的疫苗佐剂效应奠定的基础。 3．本研究应用RT-PCR方法从conA刺激2h后四川山地乌骨鸡的脾脏组织总RNA扩增了IL-18基因的cDNA，将分离cDNA片段的克隆到PMD18-T载体，进行序列测定分析。结果表明：鸡IL-18基因全部的开放阅读框597bp，与GeneBank上报道的核苷酸序列同源性为96.5-100％。其中与Schneider等报道的序列完全一致。四川山地乌骨鸡IL-18克隆在国内外尚未见报道，本研究为鸡IL-18疫苗佐剂效应的研究提供了物质基础。 4．分别双酶切得到IL-2、IFN-γ、IL-15、IL-18 DNA片段，将其亚克隆入真核
梁晓红[9]（2006）在《HBV感染影响TRAIL诱导凋亡关键基因片段的筛选及其分子机制的研究》文中提出乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）感染肝细胞所致肝炎、肝硬化甚至肝癌是危及全世界，尤其是我国人民健康的重要原因。尽管到目前为止，HBV的确切致病机制尚存在争议，但已有研究证实，HBV感染所致肝细胞凋亡失衡不仅是乙肝患者肝细胞损伤的重要分子机制之一，而且在乙肝患者不同的预后、转归中发挥着不容忽视的、甚至是决定性的作用。 众多研究表明，TNFα、FasL等凋亡诱导分子在HBV感染所致肝细胞损伤中发挥重要作用。肿瘤坏死因子凋亡诱导配体（Tumor necrosis factor-relatedapoptosis-inducing ligand，TRAIL）是于1994年被克隆、命名的肿瘤坏死因子家族成员，其最为显着的特点是：可选择性地诱导肿瘤细胞或者病毒感染细胞的凋亡，而对正常组织细胞无明显毒性。研究发现，许多因素（病毒／病毒编码蛋白、射线、药物等）可改变细胞对TRAIL诱导凋亡的敏感性。我室在前期研究中首次提出并报道了，HBV感染可提高肝癌细胞对TRAIL诱导凋亡的敏感性，可能在HBV感染所致肝细胞损伤中发挥一定的作用。但是，HBV全基因组至少包含四个开放性读码框架（Open reading frame，ORF），编码合成相应病毒蛋白质，那么究竟哪一个片段是导致HBV影响TRAIL诱导凋亡的关键性基因区段呢?这些关键性基因区段在TRAIL诱导凋亡通路中的关键性作用位点又是什么呢?因此，在前期工作的基础上，本课题在国内外率先开展了有关HBV影响TRAIL诱导凋亡的机制研究，并取得了一定的研究成果。
赵欣[10]（2007）在《人白细胞介素15 cDNA协同优化的人乳头瘤病毒16型E7核酸疫苗治疗宫颈癌的初步研究》文中认为宫颈癌是妇女因恶性肿瘤而死亡的第二位死因，是威胁妇女健康的大敌。高危型人乳头瘤病毒（HPV），尤其是HPV 16型是宫颈癌的主要致病因子，99％以上的宫颈癌病例都可检测到HPV感染。晚期宫颈癌的治疗除了手术放化疗以外尚无良策。那么针对宫颈癌的病因——HPV感染来研制预防和治疗宫颈癌的疫苗来战胜宫颈癌已成为人们的普遍共识，并已取得了一定成果。其中治疗性疫苗多选用HPV的两个早期基因E6和E7基因作为抗原基因。这两个基因的表达产物是引起细胞恶性转化的主要癌蛋白。疫苗的形式多种多样，包括微生物载体疫苗，蛋白疫苗，DNA疫苗等。大多数疫苗在动物实验中都取得了较好的抗瘤效果，部分已进入临床实验。但目前得到的临床实验的结果并不尽如人意。所以提高治疗性疫苗的免疫原性从而增强疫苗的免疫效果十分必要。本研究是关于宫颈癌治疗性疫苗的研究。研究选用了DNA疫苗这一形式，采用HPV16 E7基因作为抗原靶基因，从增强疫苗免疫原性并消除抗原蛋白转化活性这一角度出发，对抗原基因进行了一系列优化，并将优化后的基因与结核分枝杆菌热休克蛋白70（MtHSP70）基因相融合作为宫颈癌治疗性疫苗的主体，为了增强免疫效果，还选用人白细胞介素15（hIL-15）基因作为分子佐剂协同免疫。研究首先构建了一系列重组真核表达质粒，使用Western blot，免疫荧光以及ELISA方法验证了这些质粒的体外表达后，对动物进行了分组免疫，并对该疫苗激发机体产生免疫反应的可能机制进行了探讨。具体的疫苗优化策略和实验结果如下：1．对HPV16 E7基因进行系列优化。首先对E7基因进行gene shuffle，即基因切割重排。将E7基因分成a，b，c三个部分，将中间部分b重复一次，得到abbc序列，并在该序列的两端各添加一个HLA*A0201表位，得到重排的HPV16 E7基因（ShE7）。基因重排后，用哺乳动物偏爱的密码子对HPV16 ShE7病毒基因进行优化，并突变了与转化活性相关的Rb位点和锌指结合区，期望通过这样的优化策略来提高表位剂量，增加蛋白表达量并消除抗原蛋白的转化活性。基因优化后，采用人工合成的方法合成了HPV16 E7基因。2．选用VR1012作为疫苗的真核表达载体，将优化的HPV16 ShE7与MtHSP70基因相融合，构建了以HPV16 ShE7／MtHSP70融合基因为主体的DNA疫苗VR1012-HPV16 ShE7／MtHSP70，同时构建了野生型HPV16 E7基因，单独HPV16 ShE7基因和MtHSP70基因的真核表达质粒—VR1012-WE7，VR1012-SHE7，VR1012-MtHSP70。另外还构建了两个人IL-15的真核表达质粒—VR1012-hIL-15和VR1012-hIL-2S／hI1-15。将上述重组质粒分别瞬时转染COS-7细胞，通过Western blot和免疫荧光的方法鉴定了WE7，ShE7，ShE7／MtHSP70以及Mt HSP70蛋白在细胞中的表达与定位，通过ELISA的方法鉴定了IL-15在细胞中的分泌性表达。3．选用PGEX-4T1作为原核表达载体，构建了HPV16 E7基因的原核表达载体，在E.Coli（BL21／DE3）中表达了GST-E7融合蛋白并使用亲和层析的方法对该蛋白进行了纯化。该蛋白拟用于检测疫苗免疫后产生的特异性E7抗体，根据凝胶薄层扫描结果显示，蛋白纯度达到75％以上，可以满足体外免疫检测实验的要求。4．用上述构建的真核表达质粒对小鼠进行了免疫。将6-8周龄C57BL／6小鼠随机分为六组：WE7免疫组，ShE7免疫组，ShE7／MtHSP70免疫组，ShE7／MtHSP70+hIL-15免疫组，hIL-15免疫组和空载体VR1012对照组。双侧股四头肌注射接种三次，肌肉注射后进行体内电穿孔以增强基因转染效率。在WE7免疫组内增加2只小鼠未进行体内电穿孔，用于比较体内电穿孔的效果。每次每种质粒接种100μg，间隔2周。作为宫颈癌治疗性疫苗的研究，免疫原性的检测，体内抗瘤实验以及抗瘤免疫机制的深入研究十分必要。本研究所作的工作为后续进一步深入研究人IL-15协同HPV16 ShE7／MtHSP70核酸疫苗的免疫原性，体内抗瘤活性以及免疫机制奠定了基础。
二、人IL-15cDNA真核表达载体的构建及其在BEL-7402细胞中的表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人IL-15cDNA真核表达载体的构建及其在BEL-7402细胞中的表达（论文提纲范文）
（1）人IL-15在K562细胞中的表达研究（论文提纲范文）
| 提要 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 第1章 前言 |
| 1.1 细胞因子概述 |
| 1.1.1 干扰素 |
| 1.1.2 肿瘤坏死因子 |
| 1.1.3 集落刺激因子 |
| 1.1.4 趋化性细胞因子 |
| 1.1.5 生长因子 |
| 1.1.6 白细胞介素 |
| 1.2 白细胞介素 15 概述 |
| 1.2.1 IL-15 的来源 |
| 1.2.2 IL-15 编码基因的特点 |
| 1.2.3 IL-15 蛋白质结构 |
| 1.2.4 IL-15 受体及 IL-15/IL-15R 的信号传导 |
| 1.2.5 IL-15 的生物学功能 |
| 1.2.6 临床意义 |
| 1.3 立题依据 |
| 1.4 研究方案 |
| 第2章 重组人 IL-15 克隆载体构建 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第3章 重组人 IL-15 表达载体构建、转染及表达鉴定 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 表达载体的选择 |
| 3.3.2 脂质体转染的特点 |
| 3.3.3 转染细胞的选择 |
| 3.3.4 阳性转染细胞的筛选 |
| 研究总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（2）猪IL-15 cDNA真核表达载体的构建、表达及其免疫佐剂效应（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 引物设计 |
| 1.2.2 外周血单核淋巴细胞总RNA提取 |
| 1.2.3 RT-PCR体外扩增及纯化 |
| 1.2.4 猪IL-15基因TA克隆、序列测定和分析 |
| 1.2.5 猪IL-15真核表达载体的构建和鉴定 |
| 1.2.6 pcDNA- pIL-15质粒抽提并转染AD-293细胞 |
| 1.2.7 pIL-15在AD-293细胞上的瞬时表达鉴定 |
| 1.2.8 免疫佐剂活性 |
| 2 结果 |
| 2.1 pIL-15的RT-PCR扩增、克隆及序列分析 |
| 2.2 真核表达载体pcDNA- pIL-15的鉴定 |
| 2.3 重组质粒pcDNA-pIL-15的转染和鉴定 |
| 2.4 免疫血清中PCV-2中和抗体的检测 |
| 2.5 免疫小鼠脾脏T淋巴细胞增殖 (MTT) 试验 |
| 3 讨论 |
（3）猪IL-15与PRRSV ORF5基因真核表达质粒的构建及其免疫原性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 猪繁殖与呼吸综合征 |
| 1.2 PRRS 的危害及流行病学 |
| 1.3 PRRSV 的病原特性 |
| 1.3.1 PRRSV 的分类 |
| 1.3.2 PRRSV 的一般特性 |
| 1.3.3 PRRSV 的培养特性 |
| 1.4 PRRSV 的分子生物学研究进展 |
| 1.4.1 PRRSV 的基因组结构 |
| 1.4.2 PRRSV 基因组编码的蛋白 |
| 1.5 PRRSV 的免疫学研究进展 |
| 1.5.1 PRRSV 的体液免疫研究 |
| 1.5.2 PRRSV 的细胞免疫研究 |
| 1.5.3 PRRSV 的免疫调节和免疫逃避 |
| 1.6 PRRS 的疫苗研究进展 |
| 1.6.1 PRRS 的常规疫苗 |
| 1.6.2 PRRS 的新型疫苗 |
| 1.6.3 免疫佐剂 |
| 1.7 研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 质粒、工程菌、细胞株 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 主要工具酶、抗体及分子生物学试剂盒 |
| 2.1.4 主要生化试剂 |
| 2.1.5 主要实验仪器设备 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 PRRSV ORF5 基因、pIL-15 基因的亚克隆及其真核表达质粒的构建 |
| 2.2.2 pIL-15 原核表达载体的构建 |
| 2.2.3 重组质粒pGEX-6p-pIL-15-48 和pGEX-6p-pIL-15-29 的诱导表达及纯化 |
| 2.2.4 抗pIL-15 多克隆抗体的制备及鉴定 |
| 2.2.5 pVAX1-pIL-15和pVAX1-PRRSV ORF5重组质粒体外瞬时表达及其表达产物的检测 |
| 2.2.6 pVAX1-pIL-15和pVAX1-PRRSV ORF5重组质粒在小鼠体内的应用及其免疫效果的检测 |
| 2.3 数据处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 PRRSV ORF5 基因及pIL-15 基因的亚克隆及其真核表达质粒的构建及鉴定 |
| 3.1.1 PRRSV ORF5 重组真核表达质粒的构建与鉴定 |
| 3.1.2 pIL-15 重组真核表达质粒的构建与鉴定 |
| 3.2 pGEX-6p-pIL-15-48 和pGEX-6p-pIL-15-29 重组蛋白的诱导表达及纯化 |
| 3.2.1 pGEX-6p-pIL-15-48 和pGEX-6p-pIL-15-29 重组蛋白的诱导表达 |
| 3.2.2 pGEX-6p-pIL-15-48 重组蛋白的纯化 |
| 3.3 抗pIL-15 多克隆抗体的制备及鉴定 |
| 3.3.1 酶联免疫吸附实验（ELISA）检测多抗效价 |
| 3.4 真核表达质粒体外转染及其表达产物的检测 |
| 3.4.1 PRRSV ORF5 基因真核表达质粒体外转染及其表达产物的检测 |
| 3.4.2 pIL-15 基因真核表达质粒体外转染及其表达产物的检测 |
| 3.5 小鼠脾脏及外周血T 淋巴细胞增殖功能动态变化 |
| 3.5.1 小鼠脾脏T 淋巴细胞增殖功能动态变化 |
| 3.5.2 小鼠外周血T 淋巴细胞增殖功能动态变化 |
| 3.6 小鼠脾脏及外周血不同亚型T 淋巴细胞动态变化 |
| 3.6.1 小鼠脾脏及外周血CD4~+T 淋巴细胞动态变化 |
| 3.6.2 小鼠脾脏及血液 CD8~+T 淋巴细胞动态变化 |
| 3.7 小鼠外周血抗 PRRSV ORF5 IgG 抗体含量动态变化 |
| 3.8 小鼠外周血 IFN-γ 的检测 |
| 3.9 PRRSV-ORF5 在小鼠体内动态分布的检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 PRRSV ORF5 和 pIL-15 的重组质粒联合免疫设计 |
| 4.2 真核表达载体的选择 |
| 4.3 pIL-15 原核表达载体的构建及其在原核细菌中的表达 |
| 4.4 细胞因子对DNA 疫苗的佐剂效应及其接种剂量对免疫效果的影响 |
| 4.4.1 细胞因子对DNA 疫苗的佐剂效应 |
| 4.4.2 细胞因子接种剂量对免疫效果的影响 |
| 4.5 真核载体表达质粒体外瞬时转染结果分析 |
| 4.6 小鼠免疫pVAX1-PRRSV ORF5 与pVAX1-pIL-15 基因疫苗后脾脏和外周血T 淋巴细胞转化效果 |
| 4.7 小鼠免疫 pVAX1-PRRSV ORF5 与 pVAX1-pIL-15 基因疫苗后脾脏和外周血 CD4~+和 CD8~+淋巴细胞数量的动态变化 |
| 4.8 小鼠免疫pVAX1-PRRSV ORF5 与pVAX1-pIL-15 基因疫苗后抗PRRSV ORF5 IgG 抗体含量动态变化 |
| 4.9 小鼠免疫pVAX1-PRRSV ORF5 与pVAX1-pIL-15 基因疫苗后IFN-γ的动态变化分析 |
| 4.10 小鼠免疫pVAX1-PRRSV ORF5 与pVAX1-pIL-15 基因疫苗后PRRSV-ORF5 基因在小鼠体内动态分布的分析 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（4）含沙门菌内源启动子新型双功能表达载体的构建及其在猪瘟病毒疫苗研究中的应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 目录 |
| 前言 |
| 1 研究背景、基础和目的意义 |
| 2 拟解决的问题 |
| 3 主要研究内容 |
| 4 整体技术路线 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 减毒猪霍乱沙门菌作为基因疫苗运载体研究进展 |
| 1 沙门菌的特征 |
| 2 沙门菌的侵染机制 |
| 3 沙门菌的减毒 |
| 4 减毒沙门菌的胞内定位及对基因疫苗的运送 |
| 5 运送基因疫苗减毒沙门菌诱发机体免疫应答的机制 |
| 6 减毒猪霍乱沙门菌作为疫苗的应用 |
| 7 减毒猪霍乱沙门菌作为基因疫苗载体的应用 |
| 8 减毒猪霍乱沙门菌作为基因疫苗载体的优点及潜在的威胁 |
| 第二章 猪瘟病毒研究进展 |
| 1 猪瘟病毒概述 |
| 2 猪瘟病毒的病原学研究 |
| 3 猪瘟病毒分子生物学研究 |
| 4 猪瘟病毒致细胞病变型的研究 |
| 5 猪瘟病毒疫苗研究 |
| 6 猪瘟病毒与动物性食品安全 |
| 7 小结 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第一章 猪霍乱沙门菌nirB、pagC基因启动子区域分子克隆及其生物信息学分析 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 技术路线 |
| 1.2.2 引物的设计与合成 |
| 1.2.3 S.C500细菌活化培养 |
| 1.2.4 S.C500细菌基因DNA的提取制备 |
| 1.2.5 S.C500 nirB、pagC基因启动子区域PCR扩增 |
| 1.2.6 S.C500 nirB、pagC基因启动子区域扩增产物的TA克隆 |
| 1.2.7 S.C500 nirB、pagC基因启动子区域PCR产物的TA克隆质粒初步鉴定 |
| 1.2.8 S.C500 nirB、pagC基因启动子区域TA克隆质粒测序鉴定 |
| 1.2.9 S.C500 nirB、pagC基因启动子扩增区域的序列分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 S.C500 nirB、pagC基因启动子区域PCR扩增 |
| 2.2 S.C500 nirB、pagC基因启动子序列TA克隆质粒鉴定 |
| 2.3 S.C500 nirB、pagC基因启动子序列测定及结果分析 |
| 2.4 S.C500 nirB、pagC基因启动子序列的序列分析 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第二章 沙门菌nirB、pagC基因启动子启动活性研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 技术路线 |
| 1.2.2 引物设计与合成 |
| 1.2.3 报告基因EGFP的质粒PCR扩增及TA克隆 |
| 1.2.4 基因片段PnirB、PpagC的质粒PCR扩增及TA克隆 |
| 1.2.5 含启动子PnirB、PpagC表达载体的构建 |
| 1.2.6 含报告基因EGFP重组载体的构建 |
| 1.2.7 报告基因EGFP在S.C500中的表达研究 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 报告基因克隆质粒pUCX-EGFP构建 |
| 2.2 目的基因克隆质粒pUCX-PnirB(PB)、pUCX-PpagC(PC)构建 |
| 2.3 表达载体pPB、pPC构建 |
| 2.4 报告基因载体pPB-EGFP、pPC-EGFP构建 |
| 2.5 重组菌S.C500/pPB-EGFP、S.C500/pPC-EGFP的表达研究 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第三章 新型双功能通用表达载体的构建及启动活性研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 技术路线 |
| 1.2.2 引物设计与合成 |
| 1.2.3 启动子基因PnirB(CB)、PpagC(CC)的PCR扩增及TA克隆 |
| 1.2.4 新型基因疫苗表达载体的构建 |
| 1.2.5 新型基因疫苗报告载体的构建 |
| 1.2.6 新型基因疫苗报告载体在S.C500中表达研究 |
| 1.2.7 新型基因疫苗报告载体在Vero细胞中瞬时表达研究 |
| 1.2.8 重组菌S.C500/pCB-EGFP、S.C500/pCC-EGFP的稳定性分析 |
| 1.2.9 重组菌S.C500/pCB-EGFP、S.C500/pCC-EGFP在体外培养小鼠巨噬细胞中表达研究 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 克隆质粒pUCX-PnirB(CB)、pUCX-PpagC(CC)的构建 |
| 2.2 新型双功能基因疫苗通用表达载体的构建 |
| 2.3 新型基因疫苗报告载体的构建 |
| 2.4 新型基因疫苗报告载体在S.C500中表达研究 |
| 2.5 新型基因疫苗报告载体在Vero细胞中表达研究 |
| 2.6 重组菌体外培养稳定性 |
| 2.7 重组菌感染体外培养小鼠巨噬细胞的荧光观察 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第四章 内江猪白细胞介素15基因的分子克隆、表达及免疫佐剂作用研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 技术路线 |
| 1.2.2 引物的设计与合成 |
| 1.2.3 内江猪IL-15基因的克隆和序列分析 |
| 1.2.4 内江猪IL-15基因的原核表达研究 |
| 1.2.5 原核表达产物的活性检测 |
| 1.2.6 内江猪IL-15基因的免疫佐剂作用研究 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 内江猪IL-15基因的RT-PCR扩增及TA克隆 |
| 2.2 内江猪IL-15基因序列分析 |
| 2.3 原核表达载体DMAL-pmIL15的构建 |
| 2.4 原核表达条件优化及其产物Western blot分析 |
| 2.5 融合表达产物的生物活性检测 |
| 2.6 pIL-15基因的免疫增强作用 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第五章 猪瘟病毒E2基因的分子克隆与原核表达研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 技术路线 |
| 1.2.2 引物设计与合成 |
| 1.2.3 CSFV-E2基因的分子克隆与序列分析 |
| 1.2.4 CSFV-E2蛋白主要抗原区编码基因的TA克隆质粒构建 |
| 1.2.5 原核重组表达载体pET-mE2(pe)、pET-E2(pe)的构建 |
| 1.2.6 pET-mE2(pe)、pET-E2(pe)在大肠杆菌中的表达 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 CSFV-E2基因的分子克隆 |
| 2.2 CSFV-E2基因的序列分析 |
| 2.3 克隆质粒pUCX-mE2(pe)、pUCX-E2(pe)的构建 |
| 2.4 原核表达载体pET-mE2(pe)、pET-E2(pe)的构建 |
| 2.5 R/pET-mE2(pe)、R/pET-E2(pe)表达产物的SDS-PAGE分析 |
| 2.6 R/pET-mE2(pe)、R/pET-E2(pe)表达产物的Western Blot分析 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第六章 猪IL-15与CSFV-E2双基因融合表达载体的构建及表达研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 技术路线 |
| 1.2.2 引物设计与合成 |
| 1.2.3 CSFV-E2与pIL-15双基因的融合 |
| 1.2.4 融合双基因重组表达载体的构建 |
| 1.2.5 pEGFP-dME2-IL-15在Vero细胞中的表达 |
| 1.2.6 pCB-ME2-IL-15、pCC-ME2-IL-15在S.C500中表达 |
| 1.2.7 pCB-ME2-IL-15、pCC-ME2-IL-15、pCI-ME2-IL-15在Vero细胞中的瞬时表达研究 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 CSFV-E2与pIL-15双基因的融合 |
| 2.2 融合双基因重组表达载体的构建 |
| 2.3 pEGFP-ME2-IL-15在Vero细胞中的表达 |
| 2.4 pCB-ME2-IL-15、pCC-ME2-IL-15在S.C500中表达 |
| 2.5 pCB-ME2-IL-15、pCC-ME2-IL-15、pCI-ME2-IL-15在Vero细的瞬时表达 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第七章 融合双基因疫苗表达载体在运载菌S.C500中的稳定性及免疫安全性研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 引物设计与合成 |
| 1.2.2 重组菌生长特性、生化特性、药敏特性及血清学特性鉴定 |
| 1.2.3 重组菌体外增殖中重组质粒的稳定性 |
| 1.2.4 携质粒SC500对ST细胞的粘附、侵袭力和增殖 |
| 1.2.5 携质粒S.C500口服免疫BALB/c小鼠 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 重组工程菌体外培养特性检测 |
| 2.2 S.C500体外培养中质粒的稳定性 |
| 2.3 携质粒S.C500对ST细胞的粘附、侵袭和增殖能力的影响 |
| 2.4 携质粒S.C500免疫BALB/c小鼠 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第八章 融合双基因表达载体重组S.C500活菌疫苗口服接种家兔的体内免疫应答初步研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 重组工程菌的S.C500/pCI-ME2制备 |
| 1.2.2 双基因融合表达载体重组工程菌的活化培养 |
| 1.2.3 猪霍乱沙门菌血清抗体间接ELISA检测方法的建立 |
| 1.2.4 口服免疫重组工程菌菌液的制备 |
| 1.2.5 试验家兔的口服免疫接种 |
| 1.2.6 免疫家兔血清抗体水平检测 |
| 1.2.7 免疫家兔T淋巴细胞增殖检测 |
| 1.2.8 免疫后家兔猪瘟兔化弱毒株攻毒试验 |
| 1.2.9 免疫后家兔猪伤寒沙门菌野毒株攻毒研究 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 重组工程菌的S.C500/pCI-ME2制备 |
| 2.2 猪霍乱沙门菌血清抗体间接ELISA检测方法的建立 |
| 2.3 免疫家兔抗CSFV特异性抗体的检测 |
| 2.4 免疫家兔抗S.C500特异性抗体的检测 |
| 2.5 免疫家兔T淋巴细胞增殖能力检测 |
| 2.6 免疫家兔猪瘟兔化弱毒株攻毒研究 |
| 2.7 免疫家兔猪伤寒沙门菌野毒株攻毒研究 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第三部分 全文总结论 |
| 第四部分 本研究的创新点 |
| 第五部分 本研究的不足之处 |
| 第六部分 本研究的展望与建议 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（5）鸡传染性支气管炎免疫增强型核酸疫苗的构建与免疫保护机理的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 前言 |
| 1.1 鸡传染性支气管炎研究进展 |
| 1.1.1 IBV 早期发现及研究 |
| 1.1.2 IBV 分子生物学特征 |
| 1.1.3 IBV 结构蛋白及其生物学功能 |
| 1.1.4 IBV 分型研究 |
| 1.1.5 IB 疫苗研究 |
| 1.2 禽类细胞因子研究进展 |
| 1.2.1 白细胞介素－1β（Interluekin-1β，IL-1β） |
| 1.2.2 白细胞介素－2（IL-2） |
| 1.2.3 白细胞介素－6 家族（IL-6 Family） |
| 1.2.4 白细胞介素－8（IL-8） |
| 1.2.5 白细胞介素－18（IL-18） |
| 1.2.6 干扰素－γ（Interferon γ, IFN-γ） |
| 1.2.7 干扰素－α（IFN-α） |
| 1.2.8 肿瘤坏死因子（Tumor Necrosis Factor, TNFs） |
| 1.3 鸡白细胞介素15（INTERLEUKIN-15, IL-15）研究进展 |
| 1.3.1 鸡IL-15 概述 |
| 1.3.2 鸡IL-15 分子结构 |
| 1.3.3 鸡IL-15 受体研究 |
| 1.3.4 鸡IL-15 生物学功能 |
| 小结 |
| 1.4 研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 病毒株 |
| 2.1.2 试验动物 |
| 2.1.3 细胞株、菌株、载体及质粒 |
| 2.1.4 主要工具酶、抗体及分子生物学试剂盒 |
| 2.1.5 主要生化试剂 |
| 2.1.6 主要实验仪器设备 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 IBV S 基因、IBV 51 基因及ChIL-15 基因的亚克隆及其真核表达质粒的构建 |
| 2.2.2 IBV S/ChIL-15 及IBV 51/ChIL-15 融合基因真核表达质粒的构建 |
| 2.2.3 抗IBV H120 株病毒多克隆抗体的制备及鉴定 |
| 2.2.4 pcDNA3.1-IBV S-linker-ChIL-15 及pcDNA3.1-IBV 51-linker-Ch IL-15 重组质粒体外瞬时表达及其表达产物的检测 |
| 2.2.5 pcDNA3.1-IBV S-linker-ChIL-15 及pcDNA3.1-IBV 51-linker-Ch IL-15 重组质粒在雏鸡体内的应用及其免疫效果的检测 |
| 2.3 数据处理 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 IBV S 基因、IBV 51 基因及CHIL-15 基因的亚克隆及其真核表达质粒的构建及鉴定 |
| 3.1.1 pcDNA3.1-IBV S-TAA 重组质粒的构建与鉴定 |
| 3.1.2 pcDNA3.1-IBV 51-TGA 重组质粒的构建与鉴定 |
| 3.1.3 pcDNA3.1-ATG-ChIL-15 重组质粒的构建与鉴定 |
| 3.2 PCDNA3.1-IBV S-CHIL-15 融合基因真核表达质粒构建及鉴定 |
| 3.2.1 pcDNA3.1-IBV S-ChIL-15 基因推测表达蛋白特性软件预测结果 |
| 3.2.2 重组质粒的PCR 及双酶切鉴定 |
| 3.2.3 重组质粒的测序鉴定 |
| 3.3 PCDNA3.1-IBV 51-CHIL-15 融合基因真核表达质粒的构建及鉴定 |
| 3.3.1 pcDNA3.1-IBV 51-ChIL-15 基因推测表达蛋白特性软件预测结果 |
| 3.3.2 重组质粒的PCR 及酶切鉴定 |
| 3.3.3 重组质粒的测序鉴定 |
| 3.4 抗IBV H120 株全病毒多克隆抗体的制备及鉴定 |
| 3.3.1 琼脂扩散实验检测多抗效价 |
| 3.3.2 酶联免疫吸附实验（ELISA）检测多抗效价 |
| 3.5 真核表达质粒体外转染及其表达产物的检测 |
| 3.5.1 pcDNA3.1-IBV S-ChIL-15 融合基因真核表达质粒体外转染及其检测 |
| 3.5.2 pcDNA3.1-IBV 51-ChIL-15 融合基因真核表达质粒体外转染及其检测 |
| 3.6 雏鸡免疫器官IL-2 MRNA 表达水平REAL TIME RT-PCR 检测方法的建立 |
| 3.6.1 ChIL-2 和ChGAPDH 目的片段的RT-PCR 扩增 |
| 3.6.2 ChIL-2 和ChGAPDH 重组质粒的PCR 及酶切鉴定 |
| 3.6.3 ChIL-2 和ChGAPDH 重组质粒测序鉴定结果 |
| 3.6.4 标准曲线的制作 |
| 3.6.5 标准曲线的重复性检测 |
| 3.7 雏鸡免疫器官及血液T、B 淋巴细胞增殖功能动态变化 |
| 3.7.1 雏鸡胸腺T 淋巴细胞增殖功能动态变化 |
| 3.7.2 雏鸡外周血液T 淋巴细胞增殖功能动态变化 |
| 3.7.3 雏鸡脾脏T 淋巴细胞增殖功能动态变化 |
| 3.7.4 雏鸡血液B 淋巴细胞增殖功能动态变化 |
| 3.7.5 雏鸡脾脏B 淋巴细胞增殖功能动态变化 |
| 3.8 雏鸡免疫器官及血液不同亚型T 淋巴细胞动态变化 |
| 3.8.1 雏鸡免疫器官及血液CD4+T 淋巴细胞动态变化 |
| 3.8.2 雏鸡免疫器官及血液CD8+T 淋巴细胞动态变化 |
| 3.8.3 雏鸡免疫器官及血液TCRγδ+T 淋巴细胞动态变化 |
| 3.9 雏鸡外周血液抗IBV IGG 抗体含量动态变化 |
| 3.10 雏鸡免疫器官IL-2 MRNA 表达水平动态变化 |
| 3.10.1 雏鸡胸腺IL-2 mRNA 表达水平动态变化 |
| 3.10.2 雏鸡脾脏IL-2 mRNA 表达水平动态变化 |
| 3.11 IBV 攻击试验雏鸡后病理学观察结果 |
| 3.11.1 临床症状及病理剖检观察结果 |
| 3.11.2 病理组织学观察结果 |
| 3.12 感染率及保护率计算结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 融合基因真核载体表达质粒的设计与构建 |
| 4.2 多克隆抗体的制备及其效价鉴定结果分析 |
| 4.3 融合基因真核载体表达质粒体外瞬时转染鉴定结果及分析 |
| 4.4 雏鸡进行核酸免疫的讨论与分析 |
| 4.5 雏鸡免疫后T 淋巴细胞增殖功能变化结果分析 |
| 4.6 雏鸡免疫后B 淋巴细胞增殖功能动态变化结果分析 |
| 4.7 雏鸡免疫后不同亚型T 细胞动态变化结果分析 |
| 4.7.1 雏鸡免疫后免疫器官及血液CD4+T 细胞动态变化结果分析 |
| 4.7.2 雏鸡免疫后免疫器官及血液CD8+T 细胞动态变化结果分析 |
| 4.7.3 雏鸡免疫后TCRαβ+T（TCR-2 T）细胞动态变化结果分析 |
| 4.7.4 雏鸡免疫后TCRγδ+T（TCR-1 T）细胞动态变化结果分析 |
| 4.8 雏鸡外周血液抗IBV IGG 抗体含量动态变化结果分析 |
| 4.9 雏鸡免疫器官IL-2 MRNA 表达水平动态变化结果分析 |
| 4.10 IBV 攻击试验雏鸡后病理学观察结果、感染率及保护率计算结果的讨论与分析 |
| 4.11 IBV S 基因与IBV 51 基因免疫效果比较分析 |
| 小结 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录I：融合基因质粒构建路线 |
| 附录II：主要溶液的配制 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（6）减毒鼠伤寒沙门氏菌介导的斯氏艾美耳球虫DNA疫苗研究（论文提纲范文）
| 内容摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 兔球虫病研究进展 |
| 第二章 白细胞介素15 的结构、功能及免疫佐剂活性 |
| 第三章 减毒沙门氏菌作为疫苗活载体的研究进展 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 斯氏艾美尔球虫单卵囊的分离及孢子生殖过程 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 单卵囊技术分离E. stiedai 球虫纯株 |
| 2.2 E. stiedai 孢子生殖过程 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 斯氏艾美耳球虫LZ 株MIC-5 基因的克隆、序列分析及其表达研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 总RNA 的提取 |
| 2.2 Es MIC-5 基因RT-PCR 扩增 |
| 2.3 重组质粒pTMIC-5 的鉴定 |
| 2.4 Es MIC-5 基因cDNA 序列测定及推导的氨基酸序列 |
| 2.5 原核表达载体pETMIC-5 的鉴定 |
| 2.6 Es MIC-5 基因在 E. coli 中的表达及检测 |
| 2.7 重组蛋白MIC-5 的纯化 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 兔白介素-15 基因的克隆及其序列分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 兔IL-15 基因RT-PCR 扩增 |
| 2.2 重组质粒pTIL-15 的鉴定 |
| 2.3 兔IL-15 基因cDNA 序列测定结果及其推导的氨基酸序列 |
| 2.4 兔IL-15 成熟蛋白氨基酸序列二级结构与三级结构预测 |
| 2.5 不同物种IL-15 基因的遗传进化分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 重组表达载体pBud-MIC5-IL-15 的构建及其在真核细胞中的表达 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组表达载体pB-MIC-5 的鉴定 |
| 2.2 重组表达载体pBMIC-5-IL-15 的鉴定 |
| 2.3 重组表达载体pBMIC-5-IL-15 在BHK-21 细胞中的表达 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五章 重组表达载体 pBud-MIC5-IL-15-asd 的构建 及转化减毒沙门氏菌 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组表达载体pBMIC-5-IL-15-asd 的鉴定 |
| 2.2 pBMIC-5-IL-15-asd转化减毒沙门氏菌的鉴定 |
| 2.3 重组菌X4550 /pBMIC-5-IL-15-asd 的安全性 |
| 2.4 重组菌X4550/pBMIC-5-IL-15-asd 的遗传稳定性 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第六章 减毒鼠伤寒沙门氏菌介导的DNA 疫苗免疫效果研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 各试验组抗 E. stiedai ELISA 抗体检测 |
| 2.2 各试验组细胞免疫水平检测 |
| 2.3 攻虫试验 |
| 2.4 肝脏病理剖解变化 |
| 2.5 肝脏病理组织学变化 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第七章 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 个人简历及博士期间发表的学术论文 |
| 导师简介 |
（7）乙肝病毒核心抗原和截短型中蛋白对TRAIL诱导肝细胞凋亡的影响及分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| (一) HBV感染与肝细胞凋亡 |
| (二) HBV感染与TRAIL诱导的肝细胞凋亡 |
| (三) HBV关键性基因区段与TRAIL诱导的肝细胞凋亡 |
| 总体技术路线 |
| 第一部分 乙肝病毒核心抗原(HBc)对TRAIL诱导肝细胞凋亡的影响及机制探讨 |
| 第一章 含HBc基因片段真核表达载体的构建及表达 |
| 技术路线 |
| 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 质粒与菌株 |
| 1.2 细胞和细胞培养 |
| 1.3 生化试剂 |
| 1.4 一般试剂 |
| 1.5 主要实验仪器 |
| 2.方法 |
| 2.1 HBc基因片段的PCR扩增、回收及纯化 |
| 2.1.1 PCR扩增HBc基因片段 |
| 2.1.2 HBc基因片段的大量扩增、回收与纯化 |
| 2.2 目的基因与载体的连接和重组子的转化 |
| 2.2.1 目的基因与载体的酶切、回收与纯化 |
| 2.2.2 目的基因与载体的连接 |
| 2.2.3 重组质粒的转化 |
| 2.3 阳性重组子的筛选与鉴定 |
| 2.3.1 碱变性法小量抽提质粒 |
| 2.3.2 酶切筛选阳性重组子 |
| 2.3.3 DNA自动测序与序列分析鉴定阳性重组子 |
| 2.4 HBc重组质粒稳定转染肝癌细胞系的建立及其鉴定 |
| 2.4.1 BEL7402、SMMC7721细胞的传代培养 |
| 2.4.2 基因转染 |
| 2.4.3 克隆筛选 |
| 2.4.4 稳定筛选细胞的鉴定 |
| 2.4.4.1 半定量RT-PCR检测HBc基因mRNA的表达 |
| 2.4.4.2 Western blot检测HBc蛋白的表达: |
| 结果 |
| 1.HBc基因片段的PCR扩增、回收及纯化 |
| 1.1 PCR扩增HBc基因片段 |
| 1.2 回收、纯化PCR产物 |
| 2.pcDNA-HBc真核表达载体的构建及鉴定 |
| 2.1 目的基因和载体的酶切回收 |
| 2.2 目的基因与载体的连接、转化 |
| 2.3 阳性重组子的筛选和鉴定 |
| 3.HBc基因稳定转染肝癌细胞系的建立及其鉴定 |
| 3.1 试剂盒小量提取质粒 |
| 3.2 阳性细胞克隆的筛选 |
| 3.3 稳定筛选细胞的鉴定 |
| 3.3.1 HBc mRNA表达的检测 |
| 3.3.2 HBc蛋白表达的检测 |
| 讨论 |
| 第二章 HBc表达对TRAIL诱导肝细胞凋亡影响的体外研究 |
| 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 生物试剂 |
| 1.2 试剂盒 |
| 1.3 细胞和细胞培养 |
| 1.4 化学试剂 |
| 1.5 主要仪器设备及其它 |
| 2.方法 |
| 2.1 CCK-8检测TRAIL对细胞生长的抑制效应 |
| 2.2 TUNEL检测TRAIL诱导的凋亡效应 |
| 2.3 Caspase3的活性检测分析TRAIL诱导的细胞凋亡 |
| 2.4 反义封闭HBc的表达对TRAIL诱导凋亡的影响 |
| 2.4.1 PS-asODNs/HBc的设计、合成和溶解 |
| 2.4.2 PS-asODNs/HBc的反义封闭效率 |
| 2.4.3 TUNEL检测反义封闭BEL7402-HBV1.1细胞中HBc的表达对TRAIL诱导凋亡的影响 |
| 2.5 TUNEL检测BEL7402-HBx细胞中转染HBc对TRAIL诱导凋亡效应的影响 |
| 3.统计学处理 |
| 结果 |
| 1.HBc转染降低TRAIL对细胞的生长抑制效应 |
| 2.HBc转染抵抗TRAIL诱导的细胞凋亡 |
| 2.1 TUNEL检测结果 |
| 2.2 Caspase3活性检测的结果 |
| 3.反义封闭HBc的表达上调TRAIL诱导的凋亡 |
| 4.HBc转染逆转HBx对TRAIL诱导的凋亡效应 |
| 讨论 |
| 第三章 HBc表达对TRAIL诱导肝细胞凋亡影响的体内研究 |
| 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 动物和动物饲养 |
| 1.2 质粒和菌种 |
| 1.3 生化试剂和试剂盒 |
| 1.4 主要仪器设备 |
| 2.方法 |
| 2.1 试剂盒大量提取质粒pcDNA3、pcDNA-HBc、pcDNA-HBV1.1 |
| 2.2 小鼠尾静脉高压注射法建立体内实验模型 |
| 2.3 免疫组织化学方法检测HBc在肝组织中的表达 |
| 2.4 HBc的表达对肝脏损伤的影响 |
| 2.4.1 小鼠血清谷丙转氨酶水平的检测 |
| 2.4.2 病理切片观察小鼠肝组织病理学改变 |
| 2.4.3 TUNEL染色检测肝细胞凋亡率 |
| 3.统计学处理 |
| 结果 |
| 1.试剂盒大量提取质粒 |
| 2.HBc在小鼠肝组织内的表达 |
| 3.HBc的表达减轻乙肝病毒诱导的炎症反应和肝细胞凋亡 |
| 3.1 小鼠血清谷丙转氨酶水平 |
| 3.2 肝脏病理学改变 |
| 3.3 TUNEL检测肝细胞凋亡 |
| 讨论 |
| 第四章 HBc表达抵抗TRAIL诱导凋亡的分子机制研究(体外) |
| 技术路线 |
| 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 细胞和细胞培养 |
| 1.2 抗体 |
| 1.3 引物 |
| 1.4 生化试剂和试剂盒 |
| 1.5 主要仪器设备 |
| 2.方法 |
| 2.1 胞膜受体水平的检测 |
| 2.1.1 半定量RT-PCR检测TRAIL受体的表达 |
| 2.1.2 荧光定量RT-PCR检测DR5 mRNA水平的表达 |
| 2.1.3 流式细胞术检测细胞表面TRAIL受体的表达 |
| 2.1.4 Western blot检测DR5蛋白水平的表达 |
| 2.2 胞浆凋亡通路水平的检测 |
| 2.2.1 Western blot检测caspase3前体蛋白(procaspase 3)的表达 |
| 2.2.2 线粒体非依赖途径的检测 |
| 2.2.2.1 Western blot检测caspase 8前体蛋白(procaspase 8)的表达 |
| 2.2.2.2 FLIP表达水平的检测 |
| 2.2.3 线粒体依赖途径的检测 |
| 2.2.3.1 Western blot检测caspase 9前体蛋白(procaspase 9)的表达 |
| 2.2.3.2 Western blot检测Bid分子的活化 |
| 2.2.3.3 Bax表达水平的检测 |
| 3.统计学处理 |
| 结果 |
| 1.HBc可降低DR5 mRNA和蛋白水平的表达 |
| 1.1 半定量和荧光定量PCR检测TRAIL受体mRNA水平的表达 |
| 1.2 流式细胞术检测TRAIL受体蛋白质水平的表达 |
| 1.3 Western blot检测DR5蛋白水平的表达 |
| 2.HBc抑制TRAIL诱导的procaspases-3,8,9及Bid的降解 |
| 2.1 Western blot检测Caspase 3活化水平 |
| 2.2 线粒体非依赖途径 |
| 2.2.1 Western blot检测Caspase 8活化水平 |
| 2.2.2 FLIP表达水平检测 |
| 2.3 线粒体依赖途径 |
| 2.3.1 Western blot检测Caspase9活化水平 |
| 2.3.2 Western blot检测Bid活化水平 |
| 2.3.3 Bax表达水平检测 |
| 讨论 |
| 第五章 HBc表达抵抗TRAIL诱导凋亡的分子机制研究(体内) |
| 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 2.1 试剂盒大量提取质粒pcDNA3、pcDNA-HBc、pcDNA-HBV1.1 |
| 2.2 小鼠尾静脉高压注射法建立体内实验模型 |
| 2.3 小鼠肝脏DR5表达水平检测 |
| 2.4 Western blot检测小鼠肝细胞Procaspase3,8,9及其Bid的表达 |
| 3.统计学处理 |
| 结果 |
| 1.HBc下调肝细胞DR5的表达 |
| 1.1 流式细胞术检测DR5蛋白质水平的表达 |
| 1.2 Western blot检测DR5蛋白水平的表达 |
| 1.3 免疫组织化学检测小鼠肝组织DR5表达 |
| 2.HBc下调小鼠肝细胞Procaspase3,8,9及其Bid的活化水平 |
| 讨论 |
| 第六章 HBc对DR5启动子活性的调控作用 |
| 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 2.1 试剂盒大量提取质粒pcDNA3-HBc、pGL3-basic、pDR5PF |
| 2.2 双荧光素酶报告基因系统检测HBc对DR5启动子活性的影响 |
| 3.统计学处理 |
| 结果 |
| HBc抑制DR5启动子活性 |
| 讨论 |
| 第七章 临床标本检测HBc与DR5表达的相关性研究 |
| 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 生物试剂 |
| 1.2 抗体 |
| 1.3 血清标本 |
| 1.4 肝切片标本 |
| 2.方法 |
| 2.1 ELISA检测慢性乙肝患者血清中HBc表达 |
| 2.2 ELISA检测慢性乙肝患者和正常对照者血清中sDR5表达 |
| 2.3 免疫组织化学方法检测慢性乙肝患者和正常对照者肝细胞DR4、DR5的表达 |
| 3.统计学处理 |
| 结果 |
| 1.慢性乙肝患者血清中HBc表达 |
| 2.慢性乙肝患者血清中sDR5表达水平降低 |
| 3.慢性乙肝患者肝细胞DR5表达水平降低 |
| 讨论 |
| 第八章 利用基因芯片分析HBc转染前后基因表达谱的变化 |
| 材料和方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 细胞培养 |
| 1.2 引物 |
| 1.3 生化试剂和试剂盒 |
| 1.4 主要的仪器设备及其它 |
| 2.方法 |
| 2.1 组织RNA的提取 |
| 2.2 RNA纯化与质检 |
| 2.3 质检合格RNA送检 |
| 2.4 生物信息学分析 |
| 2.5 差异表达基因的Real-time PCR验证 |
| 3.统计学处理 |
| 结果 |
| 1.RNA定量与质控 |
| 2.基因芯片差异表达结果分析 |
| 3.Real-time PCR验证差异表达的基因 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 乙肝病毒截短型中蛋白【MHBS(t)】影响TRAIL诱导肝细胞凋亡的机制探讨 |
| 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 细胞和细胞培养 |
| 1.2 抗体 |
| 1.3 生化试剂和试剂盒 |
| 2.方法 |
| 2.1 Western blot检测细胞外调控蛋白激酶2(ERK2)的活化 |
| 2.2 TUNEL流式细胞术检测PD98059抑制ERK2活化对MHBs(t)上调TRAIL诱导凋亡的影响 |
| 2.3 Western blot检测PD98059封闭ERK2对凋亡通路分子的影响 |
| 结果 |
| 1.MHBs(t)增强ERK2的活化 |
| 2.抑制ERK2活化可逆转MHBs(t)对TRAIL诱导凋亡的影响 |
| 3.抑制ERK2活化可逆转MHBs(t)对凋亡通路分子的影响 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 附图(FIGURES) |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 博士在读期间发表论文、论着目录及所获荣誉 |
| 一、主要发表及已录用论文 |
| 二、会议交流论文 |
| 三、参编论着 |
| 四、获得荣誉 |
| 五、成果鉴定及报奖 |
| 六、已发表及待发表英文论文全文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（8）四川山地乌骨鸡IL-2、15、18、IFN-γ基因克隆测序及分子佐剂效应研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 文献综述 |
| 细胞因子及其疫苗佐剂效应研究进展 |
| 1.细胞因子研究进展 |
| 2.细胞因子的免疫佐剂效应 |
| 3.细胞因子佐剂效应的机理 |
| 4.强化细胞因子免疫佐剂作用新途径 |
| 5.用于疫苗佐剂的禽细胞因子 |
| 6.细胞因子作为佐剂的展望 |
| 前言 |
| 第一章 四川山地乌骨鸡IL-2及IFN-γ基因的克隆与序列分析 |
| 摘要 |
| 1.引言 |
| 2.材料和方法 |
| 3.结果 |
| 3.1 总RNA的完整性鉴定 |
| 3.2 鸡脾淋巴细胞IL-2及IFN-γ基因的RT-PCR |
| 3.3 IL-2及IFN-γ基因菌落PCR及酶切鉴定 |
| 3.4 IL-2及IFN-γcDNA克隆片段序列分析 |
| 4.讨论 |
| 第二章 四川山地乌骨鸡IL-15基因的克隆与序列分析 |
| 摘要 |
| 1.引言 |
| 2.材料和方法 |
| 3.结果 |
| 3.1 总RNA的完整性鉴定 |
| 3.2 鸡脾淋巴细胞IL-15基因的RT-PCR |
| 3.3 IL-15基因菌落PCR及酶切鉴定 |
| 3.4 IL-15 cDNA克隆片段序列分析 |
| 4.讨论 |
| 第三章 四川山地乌骨鸡IL-18基因的克隆与序列分析 |
| 摘要 |
| 1.引言 |
| 2.材料和方法 |
| 3.结果 |
| 3.1 总RNA的完整性鉴定 |
| 3.2 鸡脾组织IL-18基因的RT-PCR |
| 3.3 IL-18基因菌落PCR及酶切鉴定 |
| 3.4 IL-18 cDNA片段序列分析 |
| 4.讨论 |
| 第四章 四川山地乌骨鸡IL-2、IL-15、IL-18及IFN-γ真核表达质粒构建 |
| 摘要 |
| 1.引言 |
| 2.材料和方法 |
| 3.结果 |
| 3.1 IL-2、IL-15、IL-18及IFN-γ基因基因的PCR获取 |
| 3.2 重组质粒pDNAIL-2、pDNAIL-15、pDNAINF-γ、pDNAIL-18双酶切鉴定 |
| 4.讨论 |
| 第五章 pDNAIL-2、pDNAIL-15、pDNAIL-18及pDNAIFN-γ分子佐剂制备及其对IBV DNA疫苗佐剂效应研究 |
| 摘要 |
| 1.引言 |
| 2.材料和方法 |
| 3.结果 |
| 3.1 分子佐剂制备 |
| 3.2 IBV DNA-pDNAIL2、IBV DNA-pDNAIL15、IBV DNA-pDNAIL18及IBV DNA-pDNAIFN-γ免疫后体液免疫测定结果 |
| 3.3 IBV DNA-pDNAIL2、IBV DNA-pDNAIL15、IBV DNA-pDNAIL18及IBV DNA-pDNAIFN-γ免疫后CD4+和CD8+淋巴细胞百分含量测定结果 |
| 3.4 IBV攻毒保护实验 |
| 4.讨论 |
| 第六章 分子佐剂pDNAIL-2和pDNAIL-15对禽流感灭活疫苗佐剂效应研究 |
| 摘要 |
| 1.引言 |
| 2.材料和方法 |
| 3.结果 |
| 3.1 分子佐剂制备 |
| 3.2 AI-pDNAIL2、AI-pDNAIL15免疫后HI抗体测定结果 |
| 3.3 AI-pDNAIL2、AI-pDNAIL15免疫后CD4+和CD8+淋巴细胞百分含量测定结果 |
| 4.讨论 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 在读期间发表论文 |
（9）HBV感染影响TRAIL诱导凋亡关键基因片段的筛选及其分子机制的研究（论文提纲范文）
| 中文部分 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 总体技术路线 |
| 第一部分 影响TRAIL诱导凋亡的HBV基因片段的筛选及其作用研究 |
| 第一节 反义封闭HBx、HBpreS2表达的体外抗病毒效应 |
| 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 2.1 PS-asODNs／HBx、PS-asODNs／preS2的设计、合成和溶解 |
| 2.2 PS-asODNs／HBx、PS-asODNs／preS2的体外抗病毒效应 |
| 结果 |
| 1.PS-asODNs／HBx、PS-asODNs／preS2对HBV抗原表达的影响 |
| 2.PS-asODNs／HBx、PS-asODNs／preS2对HBV DNA含量的影响 |
| 讨论 |
| 第二节 反义封闭HBx、HBpreS2的表达对TRAIL诱导细胞凋亡的影响 |
| 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 2.1 HepG2.2.15细胞对TRAIL敏感性的检测 |
| 2.2 反义封闭HBx、HBpreS2的表达对TRAIL诱导细胞凋亡的影响 |
| 结果 |
| 1.HepG2.2.15细胞对TRAIL敏感性的检测 |
| 1.1 倒置显微镜下观察形态学变化 |
| 1.2 MTT法检测细胞杀伤率 |
| 1.3 可溶性DR5蛋白阻断TRAIL的细胞毒效应 |
| 2.反义封闭HBx、HBpreS2的表达对TRAIL诱导细胞凋亡的影响 |
| 2.1 倒置显微镜下观察形态学变化 |
| 2.2 MTT法检测细胞杀伤率 |
| 2.3 TUNEL流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 讨论 |
| 第三节 反义封闭HBx、HBpreS2对TRAIL受体表达的影响 |
| 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 2.1 半定量RT-PCR检测TRAIL受体mRNA水平的表达 |
| 2.2 Western blot检测TRAIL受体蛋白质水平的表达 |
| 2.3 流式细胞术检测TRAIL受体蛋白质水平的表达 |
| 结果 |
| 1.半定量RT-PCR检测TRAIL受体mRNA水平的表达 |
| 2.Western blot检测TRAIL受体蛋白质水平的表达 |
| 3.流式细胞术检测TRAIL受体蛋白质水平的表达 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 HBx、MHBs(t)的表达对TRAIL诱导凋亡的影响及其机制的体外研究 |
| 第一节 含HBx、MHBs(t)基因片段真核表达载体的构建及表达 |
| 技术路线 |
| 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 2.1 HBx、MHBs(t)基因片段的PCR扩增、回收及纯化 |
| 2.2 目的基因与载体的连接和重组子的转化 |
| 2.3 阳性重组子的筛选与鉴定 |
| 2.4 HBx、MHBs(t)基因稳定转染肝癌细胞系的建立及其鉴定 |
| 结果 |
| 1.HBx、MHBs(t)基因片段的PCR扩增、回收及纯化 |
| 1.1 PCR扩增HBx、MHBs(t)基因片段 |
| 1.2 回收、纯化PCR产物 |
| 2.pcDNA-HBx、pcDNA-MHBs(t)真核表达载体的构建及鉴定 |
| 2.1 目的基因和载体的酶切回收 |
| 2.2 目的基因与载体的连接、转化 |
| 2.3 阳性重组子的筛选和鉴定 |
| 3.HBx、MHBs(t)基因稳定转染肝癌细胞系的建立及其鉴定 |
| 3.1 试剂盒小量提取质粒 |
| 3.2 肝癌细胞系BEL7402对TRAIL敏感性的检测 |
| 3.3 阳性细胞克隆的筛选 |
| 3.4 稳定筛选细胞的鉴定 |
| 讨论 |
| 第二节 HBx、MHBs(t)的表达对TRAIL诱导凋亡的影响 |
| 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 2.1 MTT法检测不同浓度TRAIL对细胞生长的抑制效应 |
| 2.2 倒置显微镜下观察形态学变化 |
| 2.3 TUNEL流式细胞术检测TRAIL诱导的凋亡效应 |
| 结果 |
| 1.MTT法检测细胞杀伤率 |
| 2.倒置显微镜下形态学观察 |
| 3.TUNEL流式细胞术检测细胞凋亡率 |
| 讨论 |
| 第三节 HBx、MHBs(t)的表达促进TRAIL诱导凋亡的机制研究 |
| 技术路线 |
| 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 2.1 胞膜受体水平的检测 |
| 2.2 胞浆凋亡通路水平的检测 |
| 结果 |
| 1.HBx、MHBs(t)的表达对TRAIL受体水平的影响 |
| 1.1 半定量RT-PCR检测TRAIL受体mRNA水平的表达 |
| 1.2 Western blot检测TRAIL受体蛋白质水平的表达 |
| 1.3 流式细胞术检测TRAIL受体蛋白质水平的表达 |
| 2.HBx、MHBs(t)的表达对TRAIL凋亡通路分子表达或活化的影响 |
| 2.1 Caspase 3活化水平的检测 |
| 2.2 线粒体非依赖途径 |
| 2.3 线粒体依赖途径 |
| 讨论 |
| 第四节 小干扰RNA封闭Bax的表达对HBx影响TRAIL诱导凋亡的逆转效应 |
| 技术路线 |
| 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 2.1 阳性对照小干扰RNA载体对GAPDH表达的抑制效率 |
| 2.2 有效封闭Bax表达的小干扰RNA载体的筛选 |
| 2.3 封闭Bax的表达对HBx上调TRAIL诱导凋亡的影响 |
| 2.4 封闭Bax的表达对TRAIL凋亡通路分子活化水平的影响 |
| 结果 |
| 1.阳性对照小干扰RNA载体有效抑制GAPDH的表达 |
| 1.1 成功构建GAPDH小干扰RNA载体和阴性对照载体 |
| 1.2 阳性对照小干扰RNA载体有效抑制GAPDH的表达 |
| 2.有效封闭Bax表达的小干扰RNA载体的筛选 |
| 2.1 Bax小干扰RNA载体的DNA测序结果及序列分析 |
| 2.2 小干扰RNA载体对Bax表达的抑制效应 |
| 3.封闭Bax的表达可逆转HBx对TRAIL诱导凋亡的影响 |
| 4.封闭Bax的表达对TRAIL凋亡通路分子活化水平的影响 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 HBx的表达影响TRAIL诱导凋亡的体内研究 |
| 技术路线 |
| 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 2.1 试剂盒大量提取质粒pcDNA3、pcDNA-HBx |
| 2.2 腺病毒的体外扩增、滴度测定及体外活性检测 |
| 2.3 HBx基因及TRAIL腺病毒在小鼠肝组织内的表达 |
| 2.4 HBx的表达对TRAIL腺病毒介导的肝脏损伤的影响 |
| 结果 |
| 1.试剂盒大量提取质粒 |
| 2.TRAIL腺病毒的体外扩增、滴度测定和体外活性检测 |
| 2.1 倒置显微镜下观察腺病毒感染后的细胞病变 |
| 2.2 空斑形成试验测定病毒滴度 |
| 2.3 TRAIL腺病毒体外活性检测 |
| 3.HBx在小鼠肝组织内的表达 |
| 3.1 半定量RT-PCR检测HBx mRNA水平的表达 |
| 3.2 Western blot检测HBx蛋白质水平的表达 |
| 4.HBx的表达增强TRAIL腺病毒诱导肝细胞凋亡 |
| 4.1 小鼠血清谷丙转氨酶水平 |
| 4.2 各器官组织病理学改变 |
| 4.3 PI流式细胞术检测肝细胞凋亡 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 英文部分 |
| Preface |
| Part I Preliminary screening and study of valuable HBV fragments for effects on TRAIL-induced apoptosis |
| Section 1 Effects of blocking HBx, HBpreS2 expression on HBV antigen synthesis and HBV DNA replication |
| Materials and methods |
| 1. Materials |
| 2. Methods |
| 2.1 Design,synthesis and preparation of PS-asODNs/HBx,PS-asODNs/preS2 |
| 2.2 Antiviral effects of PS-asODNs/HBx, PS-asODNs/preS2 in vitro |
| Results |
| 1. Inhibition of PS-asODNs/HBx, PS-asODNs/preS2 on the expression of HBsAg, HBeAg |
| 2. Inhibition of PS-asODNs/HBx, PS-asODNs/preS2 on HBV DNA 134 Discussion |
| Section 2 Effects of blocking HBx, HBpreS2 expression on TRAIL-induced apoptosis |
| Materials and methods |
| 1. Materials |
| 2. Methods |
| 2.1 Sensitivity of HepG2.2.15 cells towards TRAIL |
| 2.2 Effects of blocking HBx, HBpreS2 expression on TRAIL-induced apoptosis |
| Results |
| 1. Sensitivity of HepG2.2.15 towards TRAIL |
| 1.1 Morphological changes |
| 1.2 Results of MTT assay |
| 1.3 Blockade of TRAIL cytotoxicity by sDR5 |
| 2. Effects of blocking HBx, HBpreS2 expression on TRAIL-induced apoptosis l40 |
| 2.1 Morphological changes |
| 2.2 Cytotoxicity rate detected by MTT assay |
| 2.3 Apoptosis rate detected by TUNEL |
| Discussion |
| Section 3 Effects of blocking HBx, HBpreS2 on the level of TRAIL receptors 142 Materials and methods |
| Materials and methods |
| 1. Materials |
| 2. Methods |
| 2.1 mRNA expression of TRAIL receptors |
| 2.2 Protein expression of TRAIL receptors detected by Western blot |
| 2.3 Protein expression of TRAIL receptors detected by FCM |
| Results |
| 1. mRNA expression of TRAIL receptors detected by RT-PCR |
| 2. Protein expression of TRAIL receptors detected by Western blot |
| 3. Protein expression of TRAIL receptors detected by FCM |
| Discussion |
| Conclusion |
| Part II Effects of HBx,MHBs(t) on TRAIL-indcued apoptosis and their molecular mechanisms in vitro |
| Section 1 Construction and expression of eukaryotic expression vectors containing HBx or MHBs(t) |
| Materials and methods |
| 1. Materials |
| 2. Methods |
| 2.1 Amplification, extraction and purification of HBx and MHBs(t) genes |
| 2.2 Ligation and Transformation |
| 2.3 Screening and identification of positive recombinants |
| 2.4 Establishment and identification of stably-transfected hepatoma cells |
| Results |
| 1. Amplification, retrieval and purification of HBx, MHBs(t) genes |
| 1.1 PCR amplification of HBx and MHBs(t) genes |
| 1.2 Retrieval and purification of PCR products |
| 2. Construction and identification of pcDNA-HBx and pcDNA-MHBs(t) |
| 2.1 Digestion and retrieval of interest genes and vectors |
| 2.2 Ligation and transformation |
| 2.3 Screening and identification of positive clones |
| 3. Establishment and identification of stably transfected hepatoma cells |
| 3.1 Extraction of recombinant plasmids |
| 3.2 Sensitivity of BEL7402 towards TRAIL |
| 3.3 Screening of postivie clones |
| 3.4 Identification of stably-transfected cells |
| Discussion |
| Section 2 Effects of HBx and MHBs(t) expression on TRAIL-induced apoptosis 161 Materials and methods |
| Materials and Methods |
| 1. Materials |
| 2. Methods |
| 2.1 Cytotoxicity of TRAIL |
| 2.2 Morphologic changes of cells induced by TRAIL |
| 2.3 Apoptosis rate detected by TUNEL |
| Results |
| 1. Cytotoxicity rate detected by MTT |
| 2. Morphorlogic changes under inverted microscope |
| 3. Apoptosis rates detected by TUNEL |
| Discussion |
| Section 3 Molecular mechanisms of HBx and MHBs(t) effects on TRAIL-induced apoptosis |
| Materials and methods |
| 1. Materials |
| 2. Methods |
| 2.1 Extracellular detection |
| 2.2 Intracellular detection |
| Results |
| 1. Effects of HBx and MHBs(t) on the expression of TRAIL receptors |
| 1.1 Semi-quantitative RT-PCR |
| 1.2 Western blot |
| 1.3 Flow cytometry |
| 2. Effects of HBx,MHBs(t) on TRAIL-pathway molecules |
| 2.1 Activation level of caspase 3 |
| 2.2 Mitochondria-independent pathway |
| 2.3 Mitochondria-dependent pathway |
| Discussion |
| Section 4 Reversion of Bax siRNA on HBx-enhanced TRAIL-induced apoptosis.178 Materials and methods |
| Materials and methods |
| 1. Materials |
| 2. Methods |
| 2.1 Inhibition of positive control siRNA vector on GAPDH |
| 2.2 Selection of effective siRNA vector for Bax |
| 2.3 Effects of Bax blockade on HBx-enhanced TRAIL-induced apoptosis |
| 2.4 Effects of Bax blockade on the activation of TRAIL-signaling molecules 183 Results |
| Results |
| 1. Inhibition of positive control siRNA vector on GAPDH |
| 1.1 Successful construction of positive and negative siRNA vectors |
| 1.2 Effective inhibition of GAPDH by positive control siRNA vector |
| 2. Selection of efficient siRNA vector for Bax |
| 2.1 DNA sequencing of Bax siRNA vectors |
| 2.2 Inhibition of Bax expression by siRNA vector |
| 3. Reversion of Bax siRNA on HBx-enhanced TRAIL-induced apoptosis |
| 4. Effects of Bax siRNA on the activation of apoptotic pathway molecules |
| Discussion |
| Conclusion |
| Part III Study of HBx effects on TRAIL-induced apoptosis in vivo |
| Materials and methods |
| 1. Materials |
| 2. Methods |
| 2.1 Extraction ofpcDNA3 and pcDNA-HBx in bulk |
| 2.2 In vitro amplification, titration, activity detection of adenovirus |
| 2.3 Expression of HBx and Ad-TRAIL in mouse liver |
| 2.4 Effects of HBx on the liver injury induced by TRAIL adenovirus |
| Results |
| 1. Extraction of plasmids in bulk |
| 2. Amplification, titration and activity detection of adenovirus |
| 2.1 Cytopathic effects of HEK293 cells infected with adenovirus |
| 2.2 Plaque formation assay |
| 2.3 Activity of TRAIL adenovirus |
| 3. Expression of HBx in mouse liver |
| 3.1 Semi-quantitative RT-PCR for HBx mRNA |
| 3.2 Western blot for HBx protein |
| 4. Effects of HBx expression on TRAIL-induced apoptosis in vivo |
| 4.1 ALT level in serum |
| 4.2 Pathological changes in different tissues |
| 4.3 Apoptosis of hepatocytes |
| Discussion |
| Conclusion |
| 中英文共用目录 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| Acknowledgements |
| 博士在读期间发表论文、论着目录及所获荣誉 |
| Publications and honors |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（10）人白细胞介素15 cDNA协同优化的人乳头瘤病毒16型E7核酸疫苗治疗宫颈癌的初步研究（论文提纲范文）
| 英文缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 致谢 |
四、人IL-15cDNA真核表达载体的构建及其在BEL-7402细胞中的表达（论文参考文献）
- [1]人IL-15在K562细胞中的表达研究[D]. 秦颖. 吉林大学, 2014(10)
- [2]猪IL-15 cDNA真核表达载体的构建、表达及其免疫佐剂效应[J]. 何谦,陈钜豪,房红莹,卢俊鹏,张欣,崔敏,曾小娜,刘健,罗满林. 中国兽医学报, 2011(08)
- [3]猪IL-15与PRRSV ORF5基因真核表达质粒的构建及其免疫原性分析[D]. 石娜. 东北农业大学, 2010(05)
- [4]含沙门菌内源启动子新型双功能表达载体的构建及其在猪瘟病毒疫苗研究中的应用[D]. 韩国全. 四川农业大学, 2009(07)
- [5]鸡传染性支气管炎免疫增强型核酸疫苗的构建与免疫保护机理的研究[D]. 王衡. 东北农业大学, 2009(03)
- [6]减毒鼠伤寒沙门氏菌介导的斯氏艾美耳球虫DNA疫苗研究[D]. 孟庆玲. 甘肃农业大学, 2008(08)
- [7]乙肝病毒核心抗原和截短型中蛋白对TRAIL诱导肝细胞凋亡的影响及分子机制研究[D]. 杜娟. 山东大学, 2008(12)
- [8]四川山地乌骨鸡IL-2、15、18、IFN-γ基因克隆测序及分子佐剂效应研究[D]. 胡慧琼. 四川农业大学, 2006(12)
- [9]HBV感染影响TRAIL诱导凋亡关键基因片段的筛选及其分子机制的研究[D]. 梁晓红. 山东大学, 2006(12)
- [10]人白细胞介素15 cDNA协同优化的人乳头瘤病毒16型E7核酸疫苗治疗宫颈癌的初步研究[D]. 赵欣. 中国协和医科大学, 2007(09)