一、Expression of Human Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF_(165)) in Pichia pastoris and Its Biological Activity（论文文献综述）
周伟杰,吴凤梅,姚冬生,谢春芳[1]（2021）在《通过毕赤酵母表达系统获得高纯度的重组人血管内皮生长因子（rhVEGF165）》文中指出血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF165）是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子,高纯度的VEGF165对于抗肿瘤药物和生物标志物研发检测试剂必不可少。目前关于VEGF165的异源表达方法,纯化步骤多且产物纯度不高。以毕赤酵母表达系统为基础,构建人血管内皮生长因子（VEGF165）多拷贝的表达载体。按照酵母密码子偏好性优化人血管内皮生长因子基因（vegf165）的密码子,在毕赤酵母BBPB表达载体基础上,用Biobrick生物积块的方法,构建以Pgap为启动子的五拷贝rh VEGF165表达载体,同时添加组氨酸标签。利用His标签和VEGF165自身的肝素结合结构域,仅用两步亲和层析纯化得到纯度高于98%的rh VEGF165蛋白。rh VEGF165纯化后浓度为0.45 mg/m L,且具有生物学活性。该异源表达策略简化了rh VEGF165的纯化步骤,rh VEGF165具有天然VEGF165的生物学活性,且纯度达到目前文献报道的最高水平。
于在林,富岩[2]（2017）在《更优生物创新药——长效重组人血清白蛋白融合蛋白》文中认为更优生物药是指治疗用生物制品蛋白质药物,其可通过生物药经化学分子修饰、或蛋白质与小分子药物化合价偶联,形成新的物理结构或改善构象,或通过生物药物与蛋白质、生物药物之间的基因融合以达到延长生物药物在体内半衰期、或达到生物药物可定向作用于药靶为目的所研制的创新生物药。白蛋白与生物药形成的融合蛋白,抗体、抗体片段（Fc）与生物药形成的融合蛋白的研制都属于更优生物药研发领域。生物药基因融合形成二聚体融合蛋白,白蛋
贾恩朝,夏文娇,路臣桂,张会勇,朱武凌[3]（2017）在《人血管内皮生长因子189在毕赤酵母中的表达、纯化及其活性》文中进行了进一步梳理目的在毕赤酵母中表达人血管内皮生长因子189（vascular endothelial growth factor 189,VEGF189）,并进行纯化,同时检测其在体外的生物活性。方法以人VEGF183为模板,经重叠PCR法获得VEGF189基因,亚克隆至pPIC9K中,获得重组表达质粒pPIC9K-VEGF189。将其转化至E.coli DH5α中进行扩增,提取质粒,用SacⅠ酶线性化,电转至毕赤酵母GS115中,经4 mg/ml G418-YPD平板筛选高拷贝克隆。采用甲醇进行诱导表达,并通过肝素琼脂糖树脂亲和层析进行纯化。血管通透性试验检测其生物活性。结果经PCR鉴定证明重组表达质粒pPIC9K-VEGF189构建正确。VEGF189蛋白的表达及纯化产物均可与兔抗人VEGF183多克隆抗体发生特异性结合,纯化蛋白纯度达95%以上,浓度为0.291 1 mg/ml,可增加血管的通透性。结论本实验通过酵母表达系统获得了具有活性的VEGF189蛋白,为在体外探讨该蛋白在血管生成中的作用奠定了基础。
谭成成[4]（2016）在《2种不同分泌信号对犬干扰素在毕赤酵母中分泌表达的影响》文中研究表明干扰素（Interferon IFN）不仅具有抗病毒作用,它还具有抗肿瘤和免疫调节活性,并以多种不同途径影响细胞代谢、生长和分化。IFN分为Ⅰ型,Ⅱ型和Ⅲ型。而Ⅰ型干扰素包括的IFN-α至少有20种以上的亚型,它们已被用于治疗病毒性传染病和某些代谢性疾病或变态反应性疾病。毕赤酵母表达系统已被用于犬干扰素α1（Canine Interferon alpha Ca IFN-α1）的表达,在醇氧化酶启动子（Alcohol Oxidase 1 promoter,p AOX1）的紧密调控下,外源蛋白可在胞内表达或在α-因子分泌信号引导下表达在细胞外。酿酒酵母的α-因子分泌信号分为前后两区,前区负责信号识别,引导初生蛋白进入内质网并折叠,随后它被信号肽酶切掉,后区则负责将蛋白质从内质网转运到高尔基复合体,随后在KR位点被内切蛋白酶Kex2p切掉,最后2个EA重复序列被STE13基因产物修剪。应用酿酒酵母的α-因子作为分泌信号引导犬干扰素α1在毕赤酵母中的表达已在多篇文献中所见,但是,对α-分泌信号进行突变后对毕赤酵母表达Ca IFN-α1的影响尚未见到相关报道,本文比较了2种不同分泌信号的重组犬干扰素Ca IFN-α1在毕赤酵母中的分泌表达,以确认2种不同分泌信号表达载体的孰优孰劣。毕赤酵母表达载体p PIC9K含有AOX1启动子和酿酒酵母α-因子分泌信号,本实验室曾经构建过犬干扰素α1的表达载体p PIC9K-Ca IFN-α1,在分泌信号的引导下,犬干扰素α1在细胞外分泌表达。本次研究在p PIC9K-Ca IFN-α1的基础上,通过突变手段,将酿酒酵母α-因子分泌信号末端的EAEA（Glu-Ala-Glu-Ala）重复序列删除,并将构建好的表达载体命名为p PIC9K-mu MFα-Ca IFNα1。将p PIC9K-Ca IFNα1与p PIC9K-mu MFα-Ca IFNα1均用SalⅠ限制性内切酶线性化,在相同条件下,各自电转化入Pichia pastoris GS115中,并筛选出同等浓度G418压力下2种带有不同分泌信号的酵母菌株。随后通过BMGY/BMMY培养重组菌株并诱导其表达,表达产物通过Lowry法测定了总蛋白含量,通过犬干扰素α检测试剂盒对靶蛋白进行了定性定量,将带有酿酒酵母α-因子分泌信号的重组菌称为r GS115A,将携带删除EAEA重复序列的的α-分泌信号的重组菌称为r GS115B。蛋白质含量检测结果表明,r GS115A和r GS115B两者的总蛋白分泌水平相近,前者为131mg/m L,后者为136mg/m L,两者无显着性差别（P>0.05）。但是,犬干扰素α1在2种菌株中的表达量却明显不同,在r GS115B的表达量为92mg/L,占总蛋白的67.7%,而在r GS115A的表达量为78mg/L,占总蛋白的59.5%,前者表达水平明显高于后者,两者相差具有显着性（P<0.05）。本研究进一步比较了2种菌株表达产物的生物学活性,主要是抗病毒活性,但也对其免疫学活性（通过E-玫瑰花环试验测T淋巴细胞百分率）进行了初步分析,并通过SDS-PAGE测定了表达产物的分子量。通过SDS-PAGE,测得两种携带不同分泌信号的毕赤酵母表达菌株分泌的Ca IFN-α1分子量约为25k Da,这与其理论值18.5k Da不符,分析其原因,犬干扰素α1含有两个N端糖基化位点,推测酵母表达的犬干扰素α1发生了糖基化修饰。通过VSV-MDCK微量病变抑制法,测得两种菌株的分泌产物其抗病毒效价分别为2.58×107 u/mg（携带未突变分泌信号）和1.01×108 u/mg（携带突变分泌信号）,后者的活性明显高于前者。通过E-玫瑰花环试验,测得两者均有促进犬外周血T淋巴细胞增殖的作用,但两者之间并无显着差别。综上所述,就本研究而言,删除EAEA重复序列的α-分泌信号引导的犬干扰素α1在毕赤酵母的分泌表达上,无论是其表达量还是其生物学活性,效果均明显高于携带未突变型α-分泌信号的重组犬干扰素α1毕赤酵母菌株。
王芙蓉,杜艳涛,刘海雄[5]（2015）在《人血清白蛋白融合技术在药物长效化改造中的应用》文中提出人血清白蛋白（human serum albumin,HSA）融合技术是蛋白质药物长效化改造的一种通用技术,也是目前国内外生物制药研究的热点。在HSA融合技术的研究中,不同融合方式的融合蛋白活性的差异,提高HSA融合蛋白的表达产量以及HSA融合蛋白在表达过程中所出现的降解问题成为制约该技术发展的关键。现就人血清白蛋白融合技术在药物长效化改造应用中所涉及的融合方式以及融合蛋白的高效表达和降解问题进行了综述,希望为HSA融合技术的广泛应用提供一定的技术参考。
王晓,黄晓平,周宇,刁勇[6]（2014）在《重组人VEGF165蛋白在毕赤酵母中高效表达与多克隆抗体的制备》文中研究说明构建pPIC9K-VEGF165分泌型载体,线性化后电击转化至GS115（his4）中,经最小葡萄糖培养基（MD平板）筛选出阳性表达菌株并进行聚合酶链式反应（PCR）验证.菌株发酵上清液经Sephadex G-25,Heparin Sepharose FF和Sephacryl S-100层析介质分离纯化,目的蛋白纯度达到95%,相对分子质量约为24ku.结果表明:重组人VEGF165蛋白能诱导人脐静脉内皮细胞（HUVEC）增殖,提高HUVEC细胞的活性;重组人VEGF165蛋白免疫小鼠,制备多克隆抗体,间接酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测抗体效价达1:51 200.
马炳南[7]（2014）在《人核心聚糖蛋白真核表达系统构建及其活性评价》文中指出核心聚糖蛋白（Decorin）存在于细胞外基质中,含有大量亮氨酸,1978年由美国国立卫生研究院骨科研究所的Fisher教授首次分离,其分子量为39KD,具有多种重要的生物活性。核心聚糖蛋白通过与细胞外基质蛋白、细胞因子、细胞表面受体相互作用,可以抑制肿瘤细胞的发生、发展和生长。早期研究发现,Decorin的缺失会促进肿瘤的发生。研究发现,DCN能与TGF-β结合,DCN竞争性地和TGF-β结合,使TGF-β的生物活性受到抑制,并且能够影响TGF-β结构的稳定性。核心聚糖蛋白还能和EGFR结合,可使EGFR/ErbB的受体酪氨酸激酶表达受到抑制,这种抑制是由于EGFR酪氨酸激酶的持续丧失活性造成的,这种抑制还会导致细胞内钙离子增加,p21,p27（细胞周期调节蛋白依赖性激酶抑制剂）基因被诱导开放,p21,p27蛋白上调,最终引起肿瘤生长抑制。也有研究发现,DCN是Met受体的一个竞争型配体,它可以跟Met受体结合,诱导其表达从而引发其泛素化进而被降解,同时引起其下游效应分子之一的p-catenin的显着降解下调。最新研究发现Decorin可能通过诱导不同的EGFR反应,有选择性的激活受体自身磷酸化区域的磷酸酪氨酸来产生与EGF不同的信号连锁反应,并通过自身降解来抑制ErbB2和ErbB4受体的活性,最终达到抑制肿瘤细胞增殖的目的;Decorin也会通过诱导内皮细胞形成及激活细胞内途径来影响肿瘤血管生成;同时,Decorin在体外、体内和异种移植模型条件下均参与同E-cadherin结合的因子p-catenin的下调活动,所以有理由认为Decorin在肿瘤转移过程中发挥着重要作用。在前期研究基础上,本研究利用基因工程技术,制备Decorin的真核细胞（毕赤酵母）蛋白表达系统。经G-75分子筛纯化蛋白,利用划痕愈合实验和MTT法确定其抑制肿瘤细胞生长及迁移的活性,以Western Blot研究Decorin蛋白抑制肿瘤细胞生长的分子机制,研究结果如下:1)表达载体构建:通过PCR得到Decorin基因,将其与pPICZαA酵母表达质粒连接构建真核表达载体pPICZαA-decorin,将得到的载体转化大肠杆菌DH5α,经酶切和测序确认得到表达载体pPICZαA-decorin。将pPICZαA-decorin线性化后电转化进入毕赤酵母X-33中与酵母基因整合,完成Decorin酵母表达载体的构建。2)重组蛋白诱导表达和纯化:将重组质粒大量提取后线性化,通过电转化方法使其与毕赤酵母基因整合,将转化后的酵母接种到含博来霉素（Zeocin）和山梨醇的YPD固体培养基上30℃培养3～5天,当长出菌落时,将每个菌落接种到含高浓度博来霉素（Zeocin）的YPD固体培养基上30℃培养3～5天,直到长出单菌落。挑选生长良好的单菌落接种到20ml YPD液体培养基中37℃摇床过夜培养,第二天按3%接种于100ml YPD液体培养基中37℃摇床培养,直到OD600≈ 1.0时加入0.5%甲醇诱导重组蛋白表达,每隔24小时补加一次甲醇,4天后收集培养基1O000rpm离心15min收集上清液,过G-75分子筛,经洗脱、浓缩除盐和冷冻干燥,得到重组蛋白。3)生物学活性分析:以细胞划痕愈合实验和MTT法分析重组蛋白在体外抑制肿瘤细胞生长与迁移的活性。结果表明,所得到重组蛋白具有抑制结肠癌细胞生长于迁移的活性。4)分子机制研究:以Westem Blot检测蛋白表达量变化,通过实验结果发现真核表达的重组Decorin蛋白下调了CDK4、Cyclin D1和β-catenin表达水平,上调了 E-cadherin表达水平。综上所述,本研究所构建重组蛋白具有抑制结肠癌肿瘤细胞生长及迁移的作用,并且通过毕赤酵母表达重组蛋白能对Decorin基因的表达产物进行正确的折叠和翻译后加工修饰,使表达产物更接近于目的蛋白的天然结构,有效保持了其生物学活性。同时,本研究将为研制新型结肠癌治疗药物奠定良好的基础。
戴惠云,朱瑞宇,雷楗勇,侯颖,陈蕴,金坚[8]（2013）在《重组人血管内皮生长因子165b在毕赤酵母中的表达及纯化》文中提出目的在毕赤酵母中表达重组人血管内皮生长因子（recombinant human vascular endothelial growth factor,rhVEGF）165b（rhVEGF-165b）,并进行纯化。方法 PCR扩增hVEGF165b基因,插入毕赤酵母表达载体pPIC9k,构建重组表达质粒pPIC9k-VEGF165b,SalⅠ酶切线性化后,电击转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达。表达产物经Ni-NTA sephrose镍柱纯化后,进行Western blot鉴定。结果重组表达质粒pPIC9k-VEGF165b经双酶切和测序,证明构建正确;表达的rhVEGF165b蛋白相对分子质量约为23 000,纯化后纯度达90%以上,具有人VEGF的抗原性。结论成功在毕赤酵母中表达了rhVEGF165b蛋白,纯化的蛋白纯度较高,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。
戴惠云[9]（2013）在《VEGF165与VEGF165b的类似物表达及其功能初步评价》文中进行了进一步梳理VEGF-A家族包括两类蛋白VEGF×××和VEGF×××b，其中VEGF165及VEGF165b是典型的代表，两者均是由165个氨基酸组成的糖蛋白，结构相似但功能相反。VEGF165具有促进内皮细胞的增殖、迁移及成管等，因此在促血管治疗某些疾病方面具有很大的应用前景。VEGF165b能够抑制VEGF165介导的上述功能，故在抗血管治疗某些疾病方面具有潜在的应用价值。尽管VEGF165及VEGF165b在临床上的前景良好，但VEGF165体内较短的半衰期及VEGF165b与受体VEGFR2较低的结合力限制了其应用。本课题针对VEGF165和VEGF165b这两个主要的应用上的问题开展研究。为延长VEGF165在体内的半衰期，本文采用了白蛋白（HSA）融合技术。本文成功构建了重组表达载体pPIC9K-HSA-VEGF165。该重组表达质粒经Sall线性化后电击转化入毕赤酵母GS115，通过MD平板筛选获得GS115/HSA-VEGF165工程菌。该工程菌的表达产物经Blue柱亲和层析和SP阳离子交换两步纯化， SDS-PAGE结果显示该融合蛋白的分子量约为89KD，产物纯度达95%以上。Western Blot结果显示该融合蛋白具有良好的HSA及VEGF165免疫原性。体外HUVEC细胞增殖实验表明融合蛋白HSA-VEGF165能明显促进HUVEC细胞增殖，在血清浓度6.6%和10%条件下，EC50分别为262.2ng/ml和25ng/ml，活性与单体相似。小鼠体内实验显示该融合蛋白HSA-VEGF165的半衰期与单体相比延长了近5倍。为提高VEGF165b与受体VEGFR2结合力，借鉴了VEGF165与VEGFR2受体结合位点分析的数据进行定点突变。通过重叠PCR的方法进行了E44R、E67R及EE7273RR的定点突变，成功构建了VEGF165b突变体的表达质粒pPIC9K-VEGF165bmut（VEGF165bmut分别为E44R、E67R和EE7273RR）；重组表达质粒经SaI1线性化后电击转化入毕赤酵母GS115中，通过MD平板筛选获得GS115/VEGF165bmut工程菌。表达产物经镍柱纯化后，SDS-PAGE和Western Blot结果显示VEGF165bmut的分子量约2023KD，纯度达95%以上且具有良好的免疫原性。结合力ELISA测定结果显示：与VEGF165b相比，VEGF165bE67R对内皮细胞及受体VEGFR2的结合力得到了较好的提高，而E44R与EE7273RR的突变不能明显增加其与受体的亲和力。进一步对VEGF165bE67R细胞活性评价显示：VEGF165bE67R浓度为640ng/mL时，抑制VEGF165介导的内皮细胞增殖的抑制率可达100%；此外，当VEGF165bE67R浓度为360ng/mL时，还能明显地抑制肿瘤细胞A549的迁移，抑制率约为45%。本论文的研究工作在一定程度上解决了VEGF165体内半衰期较短及VEGF165b与受体VEGFR2结合力较低等问题，为VEGF165及VEGF165b在临床上的更为广泛的应用提供理论研究基础。
王友同,吴文俊,李谦,高美风[10]（2013）在《近年来我国生物技术药物研究进展和趋势》文中进行了进一步梳理生物技术是21世纪世界各国竞相发展的经济、技术的制高点,作者站在世界生物技术药物发展总趋势的高度上,具体而微地调查和总结了我国近5年来生物技术药物研究所取得的成果,内容包括:细胞因子、其它蛋白质和多肽药物、融合蛋白、穿膜肽、酶、基因治疗、干细胞、单克隆抗体、治疗性疫苗及多糖药物等。调查发现,在攻克人类顽疾、保障人民身体健康、提高生活质量和发展我国生物技术药物产业方面,由于国内成批有创见的研究成果持续涌现,发展前景一片光明。该文可为有关部门科研规划、确定研究项目、企业锁定发展目标及生物制药人员选择专业发展方向提供参考。
二、Expression of Human Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF_(165)) in Pichia pastoris and Its Biological Activity（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Expression of Human Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF_(165)) in Pichia pastoris and Its Biological Activity（论文提纲范文）
（2）更优生物创新药——长效重组人血清白蛋白融合蛋白（论文提纲范文）
| 1 白蛋白融合蛋白作为更优生物创新药发展的轨迹 |
| 2 白蛋白融合蛋白创新药主要品种 |
| 2.1 注射用重组人血清白蛋白/胰高糖素类肽-1融合蛋白 |
| 2.2 重组人血清白蛋白/凝血因子-IX融合蛋白 |
| 2.3 重组人血清白蛋白/粒细胞刺激因子融合蛋白 |
| 2.4 重组人血清白蛋白/干扰素α融合蛋白 |
| 2.5 注射用重组人血清白蛋白/促红素融合蛋白 |
| 2.6 正在临床前研究阶段的几个具有成药性的注射用重组人血清白蛋白融合蛋白 |
| 2.6.1 重组人血清白蛋白/生长激素融合蛋白 |
| 2.6.2 重组人血清白蛋白/白介素-11融合蛋白 |
| 2.6.3 重组人血清白蛋白/尿酸氧化酶融合蛋白 |
| 2.6.4 重组人血清白蛋白/白介素-2融合蛋白 |
| 2.7 重组人血清白蛋白/皮肤生长因子融合蛋白外用药和滴眼液的研究 |
| 2.8 重组人血清白蛋白融合蛋白口服制剂的研究 |
| 3 目前国内外正在研究中的白蛋白融合蛋白创新药品种 |
| 4 问题与展望 |
（3）人血管内皮生长因子189在毕赤酵母中的表达、纯化及其活性（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 质粒及菌株 |
| 1.2 主要试剂及仪器 |
| 1.3 实验动物 |
| 1.4 VEGF189基因的扩增 |
| 1.5 重组质粒p PIC9K-VEGF189的构建 |
| 1.6 质粒的线性化及细胞转化 |
| 1.7 VEGF189高拷贝酵母克隆的筛选 |
| 1.8 VEGF189的表达及纯化 |
| 1.9表达及纯化产物的鉴定 |
| 1.10 VEGF189蛋白活性的检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 目的基因的鉴定 |
| 2.2 重组质粒p PIC9K-VEGF189的鉴定 |
| 2.3 高拷贝酵母菌的筛选 |
| 2.4 纯化产物的鉴定 |
| 2.5 VEGF189蛋白的活性 |
| 3 讨论 |
（4）2种不同分泌信号对犬干扰素在毕赤酵母中分泌表达的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写词表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 研究的目的意义 |
| 1.2 研究的主要内容 |
| 1.3 研究的技术路线 |
| 第2章 文献综述 |
| 2.1 干扰素研究概况 |
| 2.1.1 IFN的起源、分布、发现和分类 |
| 2.1.2 IFN的理化性质和分子结构 |
| 2.1.3 IFN的活性与作用机制 |
| 2.1.4 IFN基因工程研究进展 |
| 2.1.5 重组犬IFN的研究进展 |
| 2.1.6 展望 |
| 第3章 毕赤酵母表达系统研究进展 |
| 3.1 PICHIA PASTORIS表达系统的优越性 |
| 3.2 PICHIA PASTORIS表达系统的组成和最新研究进展 |
| 3.3 PICHIA PASTORIS表达载体启动子与分泌信号的研究进展 |
| 3.4 PICHIA PASTORIS宿主菌株研究进展 |
| 3.5 PICHIA PASTORIS表达IFN的研究进展 |
| 3.6 展望 |
| 第4章 研究内容 |
| 前言 |
| 4.1 方法 |
| 4.1.1 α-分泌信号突变型表达载体构建策略与引物设计 |
| 4.1.2 PCR扩增目的基因 |
| 4.1.3 PCR扩增DNA片段的回收与鉴定 |
| 4.1.4 pPIC9K载体的扩增 |
| 4.1.5 扩增DNA片段的酶切与连接 |
| 4.1.6 连接产物的转化与鉴定 |
| 4.1.7 表达载体转化Pichia Pastoris GS115 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 PCR扩增CaIFN-a1及分泌信号DNA |
| 4.2.2 重组质粒的酶切鉴定 |
| 4.2.3 重组质粒测序结果 |
| 4.2.4 多拷贝插入重组子的筛选 |
| 4.2.5 转化子的PCR鉴定 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 方法 |
| 4.4.1 重组Pichia pastoris（His~+ Mut~+表型）的诱导表达 |
| 4.4.2 硫酸铵沉淀总蛋白 |
| 4.4.3 总蛋白浓度测定 |
| 4.4.4 靶蛋白（CaIFN-α1）含量测定 |
| 4.4.5 统计学处理 |
| 4.5 结果 |
| 4.5.1 表达产物的总蛋白浓度 |
| 4.5.2 靶蛋白（CaIFN-α1）含量 |
| 4.6 讨论 |
| 4.7 方法 |
| 4.7.1 SDS-PAGE分析 |
| 4.7.2 生物学活性分析 |
| 4.8 结果 |
| 4.8.1 SDS-PAGE结果 |
| 4.8.2 犬干扰素α1 的生物学活性 |
| 4.9 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 在学期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（5）人血清白蛋白融合技术在药物长效化改造中的应用（论文提纲范文）
| 1HSA与蛋白质/多肽药物的融合 |
| 1.1蛋白质药物与HSA直接融合 |
| 1.2蛋白质药物与HSA通过连接肽融合 |
| 2融合蛋白的高效表达 |
| 3融合蛋白表达过程中的降解 |
| 3.1在培养水平上 |
| 3.2在细胞水平上 |
| 3.3蛋白质水平上 |
| 4展望 |
（6）重组人VEGF165蛋白在毕赤酵母中高效表达与多克隆抗体的制备（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌种、细胞株和质粒 |
| 1.1.2 实验动物 |
| 1.1.3 主要酶和试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 VEGF165基因的扩增 |
| 1.2.2 重组表达载体的构建与鉴定 |
| 1.2.3 GS115-VEGF165工程菌株的构建与鉴定 |
| 1.2.4 重组人VEGF165蛋白分离纯化 |
| 1.2.5 重组人VEGF165蛋白对HUVEC活力的影响 |
| 1.2.6 重组人VEGF165蛋白对HUVEC增殖的影响 |
| 1.2.7 VEGF165多克隆抗体的制备 |
| 1.2.8 多克隆抗体效价的测定 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 重组表达质粒 (pPIC9K?VEGF165) 的构建与鉴定 |
| 2.2 重组人VEGF165蛋白的表达与鉴定 |
| 2.3 重组人VEGF165蛋白的纯化 |
| 2.4 重组人VEGF165蛋白对HUVEC活力的影响 |
| 2.5 重组人VEGF165蛋白对HUVEC细胞增殖的影响 |
| 2.6 VEGF165多克隆抗体效价测定 |
| 3 讨论 |
（7）人核心聚糖蛋白真核表达系统构建及其活性评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 0.1 核心聚糖蛋白研究进展 |
| 0.1.1 Decorin在肿瘤发生,发展中的作用 |
| 0.1.2 Decorin在肿瘤血管生成中的作用 |
| 0.1.3 Decorin在肿瘤迁移过程中的作用 |
| 0.1.4 Deconrin是潜在的有效抗癌剂 |
| 0.1.5 Decorin作为预后治疗的生物标记开发 |
| 0.2 毕赤酵母真核表达系统 |
| 0.2.1 毕赤酵母表达菌株 |
| 0.2.2 毕赤酵母的表达载体 |
| 0.2.3 毕赤酵母翻译后修饰 |
| 0.2.4 提高外源蛋白表达效率的方法 |
| 0.3 目的和意义 |
| 第1章 人核心聚糖蛋白真核表达载体构建 |
| 1.1 实验目的 |
| 1.2 方案设计与分析 |
| 1.3 实验试剂和材料 |
| 1.3.1 菌株类型、质粒类型和所用引物 |
| 1.3.2 限制性内切酶,连接酶和高保真酶 |
| 1.3.3 实验所用试剂 |
| 1.3.4 实验所用仪器 |
| 1.3.5 实验所用试剂盒及RIPA裂解液 |
| 1.3.6 实验室常规试剂配置方法 |
| 1.3.7 细菌培养用液体培养基和固体培养基 |
| 1.3.8 DNA和蛋白Marker |
| 1.4 实验方法 |
| 1.4.1 细菌的培养与保存 |
| 1.4.2 质粒小量提取 |
| 1.4.3 琼脂糖凝胶电泳 |
| 1.4.4 Decorin基因片段PCR扩增 |
| 1.4.5 限制性内切酶进行酶切实验 |
| 1.4.6 Decorin基因片段与载体pPICZαA连接 |
| 1.4.7 大肠杆菌感受态细胞制备 |
| 1.4.8 转化感受态细胞 |
| 1.4.9 质粒中量提取 |
| 1.4.10 pPICZαA-DCN重组质粒线性化 |
| 1.4.11 巴斯德毕赤酵母感受态制备 |
| 1.4.12 质粒电转化毕赤酵母 |
| 1.4.13 SDS-PAGE |
| 1.5 实验结果 |
| 1.5.1 重组质粒pPICZαA-DCN的构建 |
| 1.6 分析与讨论 |
| 第2章 DECORIN重组蛋白表达及纯化 |
| 2.1 实验目的 |
| 2.2 实验试剂和仪器 |
| 2.2.1 实验所用试剂 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.2.3 常用试剂配制 |
| 2.3 基本实验方法 |
| 2.3.1 Decorin重组蛋白真核表达的表达温度及表达时间优化 |
| 2.3.2 Decorin重组蛋白Sephadex G-75分子筛纯化 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 不同温度及表达时间对Decorin真核表达影响 |
| 2.4.2 Decorin分泌表达纯化后SDS-PAGE |
| 2.5 分析与讨论 |
| 第3章 人核心聚糖蛋白生物学活性研究 |
| 3.1 实验目的 |
| 3.2 方案设计与分析 |
| 3.3 实验材料与试剂 |
| 3.3.1 细胞系 |
| 3.3.2 细胞培养基 |
| 3.3.3 细胞实验所用试剂 |
| 3.3.4 实验仪器 |
| 3.3.5 细胞实验所用试剂配制方法 |
| 3.4 细胞实验方法 |
| 3.4.1 细胞培养 |
| 3.4.2 细胞的传代和培养 |
| 3.4.3 Decorin体外活性检测 |
| 3.4.4 细胞划痕愈合试验 |
| 3.5 实验结果 |
| 3.5.1 MTT检测Decorin抑制率 |
| 3.5.2 细胞划痕愈合实验 |
| 3.6 分析与讨论 |
| 第4章 人核心聚糖蛋白抑制肿瘤细胞生长机制研究 |
| 4.1 实验目的 |
| 4.2 方案设计与分析 |
| 4.3 实验所用抗体和试剂 |
| 4.3.1 实验所用抗体和试剂 |
| 4.3.2 实验仪器 |
| 4.3.3 常用溶液及缓冲液 |
| 4.4 基本实验方法 |
| 4.4.1 Decorin处理细胞后细胞总蛋白提取与定量 |
| 4.4.2 Western Blot检测 |
| 4.5 实验结果 |
| 4.5.1 western blot检测蛋白表达水平变化 |
| 4.6 分析与讨论 |
| 结论与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表论文以及参加科研情况 |
（8）重组人血管内皮生长因子165b在毕赤酵母中的表达及纯化（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 基因、菌株及质粒 |
| 1.2 主要试剂及仪器 |
| 1.3 引物设计及合成 |
| 1.4 VEGF165b基因的扩增 |
| 1.5 目的基因的克隆 |
| 1.6 重组表达质粒的构建 |
| 1.7 毕赤酵母的转化 |
| 1.8 目的基因的诱导表达 |
| 1.9 重组蛋白的纯化 |
| 2 结果 |
| 2.1 VEGF165b基因扩增产物的鉴定 |
| 2.2 重组克隆质粒的鉴定 |
| 2.3 重组表达质粒的鉴定 |
| 2.4 表达产物的鉴定 |
| 2.5 纯化产物的鉴定 |
| 2.5.1 SDS-PAGE分析 |
| 2.5.2 Western blot分析 |
| 3 讨论 |
（9）VEGF165与VEGF165b的类似物表达及其功能初步评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 VEGF 家族蛋白的研究概述 |
| 1.2.1 VEGF 家族 |
| 1.2.2 VEGF 受体及其生物学功能 |
| 1.3 VEGF165 研究概述 |
| 1.3.1 VEGF165 作用机制 |
| 1.3.2 VEGF165 表达方面的研究 |
| 1.3.3 VEGF165 生物学功能研究进展 |
| 1.3.4 VEGF165 稳定性研究 |
| 1.3.5 VEGF165 应用前景 |
| 1.4 VEGF165b 研究概述 |
| 1.4.1 VEGF165b 作用机制 |
| 1.4.2 VEGF165b 表达方面研究 |
| 1.4.3 VEGF165b 生物学功能研究进展 |
| 1.4.4 定点突变 |
| 1.4.5 VEGF165b 应用前景 |
| 1.5 立题意义 |
| 1.6 本课题研究的主要内容 |
| 第二章 VEGF165、VEGF165b 及类似物的构建与表达 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌种和质粒 |
| 2.1.2 引物 |
| 2.1.3 培养基 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.1.5 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 质粒构建 |
| 2.2.2 毕赤酵母转化 |
| 2.2.3 重组菌诱导表达 |
| 2.3 实验结果与讨论 |
| 2.3.1 重组表达质粒 pPIC9K-VEGF165 构建 |
| 2.3.2 重组表达质粒 pPIC9K-HSA-VEGF165 构建 |
| 2.3.3 重组表达质粒 pPIC9K-VEGF165b 的构建 |
| 2.3.4 重组表达质粒 pPIC9K-VEGF165bE44R 的构建 |
| 2.3.5 重组表达质粒 pPIC9K-VEGF165bE67R 的构建 |
| 2.3.6 重组表达质粒 pPIC9K-VEGF165bEE7273RR 的构建 |
| 2.3.7 pPIC9K-VEGF165 在毕赤酵母 GS115 中的表达 |
| 2.3.8 pPIC9K-HSA-VEGF165 在毕赤酵母 GS115 中的表达 |
| 2.3.9 VEGF165b 及其类似物在毕赤酵母中的表达 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 VEGF165、VEGF165b 及类似物的分离纯化与鉴定 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌种 |
| 3.1.2 培养基 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 单体 VEGF165 蛋白纯化步骤 |
| 3.2.2 融合蛋白 HSA-VEGF165 纯化步骤 |
| 3.2.3 VEGF165b 及其类似物的蛋白纯化步骤 |
| 3.2.4 重组蛋白 Western Blot 鉴定方法 |
| 3.3 实验结果与讨论 |
| 3.3.1 VEGF165 蛋白纯化结果 |
| 3.3.2 融合蛋白 HSA-VEGF165 纯化 |
| 3.3.3 VEGF165b 及其类似物的蛋白纯化 |
| 3.3.4 重组蛋白 Western Blot 鉴定结果 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 VEGF165、VEGF165b 及类似物的活性评价 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 细胞株 |
| 4.1.2 动物 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 主要试剂配制 |
| 4.1.5 主要仪器设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 细胞培养 |
| 4.2.2 MTT 法测定 VEGF165 和 HSA-VEGF165 蛋白对 HUVEC 细胞增殖实验 |
| 4.2.3 测定体内 VEGF165 和 HSA-VEGF165 血浆药物浓度-时间曲线实验 |
| 4.2.4 VEGF165b 及其类似物与细胞 EAhy926 结合活性实验 |
| 4.2.5 VEGF165b 及其类似物与 VEGF165 竞争结合受体 VEGFR2 实验 |
| 4.2.6 MTT 法测定 VEGF165bE67R 抑制 VEGF165 介导的 HUVEC 细胞增殖实验 |
| 4.2.7 VEGF165bE67R 抑制 A549 细胞迁移实验 |
| 4.3 实验结果与讨论 |
| 4.3.1 VEGF165 和 HSA-VEGF165 蛋白体外活性比较 |
| 4.3.2 VEGF165 和 HSA-VEGF165 体内活性比较 |
| 4.3.3 VEGF165b 及其类似物与细胞 EAhy926 结合活性情况 |
| 4.3.4 VEGF165b 及其类似物与 VEGF165 竞争结合受体 VEGFR2 情况 |
| 4.3.5 VEGF165bE67R 抑制 VEGF165 介导的 HUVEC 细胞增殖实验 |
| 4.3.6 VEGF165bE67R 抑制 A549 细胞迁移实验 |
| 4.4 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 存在问题及展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文 |
（10）近年来我国生物技术药物研究进展和趋势（论文提纲范文）
| 1 细胞因子[3-9] |
| 1.1 白细胞介素 (IL) |
| 1.1.1 h IL-10 |
| 1.1.2 h IL-31 |
| 1.1.3 h IL-32 |
| 1.2 干扰素 (IFN) |
| 1.2.1 新型人复合IFNα |
| 1.2.2 集成IFNα突变体Ⅱ (IFN2-Con-m2) |
| 1.2.3 人共同IFNα (IFN-Con1) |
| 1.3 人干细胞生长因子-α (rhSCGF-α) |
| 1.4 人胰岛素样生长因子1 (hIGF-1) |
| 1.5 人血管内皮生长因子 (h VEGF165) |
| 1.6 人内皮抑素 (rhEndostatin) |
| 1.7 人血管能抑素 (canstatin) |
| 2 蛋白质、多肽[10-12] |
| 2.1 水蛭素Ⅲ (HVⅢ) |
| 2.2 人胰高血糖素样肽-2类似物[ (PP-h|Gly 2|GLP-2 (1-35) ] |
| 2.3 人β-2 glycoprotein I |
| 2.4 MAP30蛋白 |
| 2.5 Exendin-4类似物 |
| 2.6 新型Ⅱa类细菌素 |
| 2.7 截短肠毒素C2 |
| 2.8 胰生定多肽 (EXf) |
| 2.9 CKLF-C19 |
| 2.10 人胰岛新生相关蛋白 (INGAP) |
| 2.11 人源肝星状激活相关蛋白 (STAP) |
| 2.12 人凋亡素α-配体 (rh-Apoα) |
| 2.13 人胸腺素β16 |
| 2.14 神经保护肽 ([Gly-14]-Humanin) |
| 2.15 鲨肝活性蛋白 (rSHAP) |
| 2.16 抗癌多肽A38 |
| 2.17 抗纤维化小肽AcSDKP |
| 2.18 血管紧张素1-7改构体 |
| 2.19 抗肿瘤多肽AP25 |
| 2.20 酪丝亮肽 |
| 3 融合蛋白[13-17] |
| 3.1 双 (多) 功能融合蛋白 |
| 3.2 HSA修饰的融合蛋白 |
| 3.3 穿膜肽修饰的融合蛋白[18] |
| 3.4 蛋白质分子PEG后修饰[19] |
| 4 穿膜肽 (CPPs) |
| 5 酶 |
| 5.1 重组蛇毒纤溶酶 (ralfimeprase, ALF) |
| 5.2 蛇毒类凝血酶 (ancrod) |
| 5.3 蚯蚓纤溶酶 (EFE) |
| 5.4 嗜血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂 (Bat-PA) |
| 5.5 人过氧化氢酶 (CAT) |
| 5.6 海刺参i型溶菌酶 (rSjLys) |
| 5.7 人纤溶酶原 |
| 5.8 含精-甘-天冬酰胺三肽人纤溶酶原K区缺失突变体 (RGD-hPLG-K) |
| 5.9 人溶菌酶 (hLYZ) |
| 5.10 尿酸氧化酶 (Uricase) [21] |
| 5.11 人源基质蛋白酶-2 (MMP-2) 的C端类血红素结合域片段 (PEX) |
| 5.12 β-内酰胺酶[22] |
| 6 基因治疗 |
| 6.1 siRNA[23-27] |
| 6.2 反义核酸 |
| 6.3 治疗基因 |
| (1) 抑瘤素M (OSM) 重组腺病毒载体 (Ad-OSM) |
| (2) miR29C重组腺病毒 (Ad5F11p-miR29C) |
| (3) 人肝细胞生长因子重组质粒 (pUDK-HGF) [30] |
| (4) 腺病毒Ela基因-P1b抑癌基因 (AdCMV-P16) |
| (5) 新型增殖型腺病毒 (CNHK500-hγ) [31] |
| 7 干细胞 |
| 7.1 国家SFDA批准临床的干细胞项目 |
| 7.2 干细胞治疗是一种医疗技术还是细胞药物 |
| 7.3 用于临床的干细胞 |
| 7.4 我国近期干细胞临床和药理学药效学研究 |
| 7.4.1 临床研究[32-35] |
| 7.4.2 药理药效学研究 |
| 8 单克隆抗体 |
| 8.1 我国批准的单抗 |
| 8.2 正在临床研究的单抗 |
| 8.3 正在进行临床前研究的单抗 |
| 8.4 单抗阶段性研究[36-38] |
| 9 治疗性疫苗 |
| 9.1 10个世界上正在开发的热点治疗性疫苗 |
| 9.2 我国治疗性疫苗的进展 |
| 9.2.1 口服幽门螺旋杆菌疫苗 |
| 9.2.2 乙肝治疗性疫苗 |
| 9.2.3 子宫颈癌治疗疫苗 |
| 9.2.4 艾滋病疫苗 |
| 9.2.5 疟原虫感染与肺癌DNA疫苗联用 |
| 9.2.6 其它的基因疫苗的研究成果[39-42] |
| 9.2.7 细胞疫苗 |
| 10 多糖 |
| 10.1 毛细管电泳法分析肝素 |
| 10.2 低分子硫酸皮肤素 (LMWDS) [44] |
| 10.3 羧甲基壳聚糖钙 |
| 10.4 低分子壳聚糖衍生物 |
| 10.5 海参岩藻聚糖硫酸酯 (SC-FUC) |
| 10.6 海洋硫酸多糖 |
| 10.7 岩藻硫酸酯 |
四、Expression of Human Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF_(165)) in Pichia pastoris and Its Biological Activity（论文参考文献）
- [1]通过毕赤酵母表达系统获得高纯度的重组人血管内皮生长因子（rhVEGF165）[J]. 周伟杰,吴凤梅,姚冬生,谢春芳. 生物工程学报, 2021(11)
- [2]更优生物创新药——长效重组人血清白蛋白融合蛋白[J]. 于在林,富岩. 中国医药生物技术, 2017(03)
- [3]人血管内皮生长因子189在毕赤酵母中的表达、纯化及其活性[J]. 贾恩朝,夏文娇,路臣桂,张会勇,朱武凌. 中国生物制品学杂志, 2017(04)
- [4]2种不同分泌信号对犬干扰素在毕赤酵母中分泌表达的影响[D]. 谭成成. 吉林大学, 2016(09)
- [5]人血清白蛋白融合技术在药物长效化改造中的应用[J]. 王芙蓉,杜艳涛,刘海雄. 生命科学, 2015(09)
- [6]重组人VEGF165蛋白在毕赤酵母中高效表达与多克隆抗体的制备[J]. 王晓,黄晓平,周宇,刁勇. 华侨大学学报(自然科学版), 2014(06)
- [7]人核心聚糖蛋白真核表达系统构建及其活性评价[D]. 马炳南. 辽宁大学, 2014(04)
- [8]重组人血管内皮生长因子165b在毕赤酵母中的表达及纯化[J]. 戴惠云,朱瑞宇,雷楗勇,侯颖,陈蕴,金坚. 中国生物制品学杂志, 2013(07)
- [9]VEGF165与VEGF165b的类似物表达及其功能初步评价[D]. 戴惠云. 江南大学, 2013(02)
- [10]近年来我国生物技术药物研究进展和趋势[J]. 王友同,吴文俊,李谦,高美风. 药物生物技术, 2013(01)
标签：毕赤酵母论文; 血管内皮生长因子论文; 融合蛋白论文; 血清白蛋白论文; 重组蛋白论文;