一、喉癌NF-κB信号转导通路的免疫组化研究（论文文献综述）
王洋[1]（2021）在《小檗碱在心脏外科术后早期预防新发房颤的作用及机制研究》文中认为目的:本研究通过网络药理学方法预测小檗碱防治房颤的作用靶点、生物过程及信号通路、通过小檗碱预防非体外循环冠状动脉旁路移植术后早期新发房颤的单中心、前瞻性临床研究,以及通过动物实验、组织样本转录组测序与分析,观察小檗碱通过TLR4/NF-κB,PPAR-α,AMPK信号通路在兔快速心房起搏诱导心肌纤维化模型中抑制纤维化,减轻心房重构,预防房颤的心脏保护作用,进一步明确炎症导致心房纤维化在房颤发生和维持中的作用机制,为探明小檗碱对房颤的防治作用及机制、进而为预防心外科术后早期新发房颤的临床应用提供新的见解和理论支持。材料与方法:1.通过Gene Cards、Swiss Target Prediction、TCMSP数据库检索小檗碱作用靶点。通过Dis Ge NET、OMIMD、TTD数据库筛选房颤相关疾病靶点。将共同作用靶点输入STRING平台构建蛋白-蛋白（PPI）互作网络模型,进而使用DAVID平台及Cytoscape软件对相应靶点进行GO分析和KEGG信号通路富集分析,分析小檗碱治疗心房颤动的作用靶点及通路。2.我们随机分配200例窦性心律患者,安排他们进行择期单纯非体外循环冠状动脉旁路移植手术,并接受围手术期小檗碱（每天1.2克的剂量）或安慰剂,术后持续7天动态心电图监测。主要的结果是术后7天内发生的持续大于30秒的房颤发生率。次要结果包括术后7天内发生的持续大于30秒的房颤的起始时间、房颤时最大心室率、房颤期间平均心室率、房颤负荷,血液生物标志物及心率变异性（HRV）相关指标。采用SPSS23.0统计学软件进行分析。计数资料采用频数和百分比进行统计描述;计量资料若符合正态分布的用均数±标准差表示,非正态分布的用中位数（P25,P75）或最大值、最小值进行统计描述。对于主要结局指标的统计分析,当记录为时依性结局事件时则采用Kaplan-Meier曲线来描述其发生率,采用Log-rank检验比较其在两组间的差异,对于两组间发生率的比较采用χ2检验。两组组间基线资料的均衡性分析和次要结局指标以及安全性指标的组间比较,采用非参数Wilcoxon秩和检验。对于分类资料,采用卡方检验。统计检验均为双尾,检验水准α=0.05,即P<0.05时,差异具有统计学意义。3.体重2.8-3.2kg的雄性普通级新西兰大耳白兔30只。随机分为5组:（1）左心房快速起搏组（RAP组,n=6）;（2）左心房快速起搏+小檗碱组（RAP+BBR,n=6）;（3）假手术组（SHAM,n=6）;（4）假手术+小檗碱组（SHAM+BBR,n=6）;（5）空白对照组（Control,n=6）。适应性、分笼饲养1周,不限食水。RAP+BBR组及SHAM+BBR组兔手术前给予每日1次小檗碱100mg/（kg·d）灌胃,持续1周。其余组给予等量生理盐水灌胃,每日1次,持续1周。动物处理符合《护理和使用实验动物指南》（美国国家卫生研究院2011年出版,第8版）。之后给予造模,左侧开胸,制作皮袋放入植入子,四根电极导线经皮下隧道延伸,两个心电采集电极分别缝合留置于左上肢和右上肢腋下皮下用于观察心电图,两个刺激电极分别缝合于左心耳和左心房上。术后给予青霉素钠40万单位/日,连续3日,肌肉注射,预防感染。3日后开启动物遥测刺激系统,通过无线收发采集和刺激信号;实现利用Power Lab生理记录仪连续监测体表I导联心电信号,并通过专用计算机程序刺激软件,发放间歇（刺激2 s,暂停2 s）高频（频率20 Hz）阈上（强度2 m A,脉宽1 ms）刺激,刺激2周。RAP+BBR组及SHAM+BBR组兔手术后继续给予小檗碱灌胃（剂量,方式同术前）,持续2周。其余组予以生理盐水灌胃（同术前）。整个实验过程中所有兔均处于清醒及自由活动状态,饮食、睡眠等生活习惯均未改变。各组兔均在术后2周处死,摘取整个左心房组织,用冰生理盐水进行清洗,摘除血栓、纤维素等多余的组织。部分心房组织应用4%的多聚甲醛浸泡固定,后期脱水包埋蜡块。部分心房组织经液氮速冻后置于-80℃的冰箱中保存备用。委托北京博奥晶典生物技术有限公司以高通量测序技术（全转录组测序）为主要手段,应用RNA-seq技术对不同条件下兔快速心房起搏诱导心肌纤维化模型组织样本的m RNA进行转录组测序,并对测序结果进行差异基因表达、基因功能与信号通路富集分析,为小檗碱对房颤预防和治疗的可能作用机制提供实验依据。心房石蜡切片行免疫组化、Masson染色、H-E染色检测。心房组织行Western Blot检测,包括p-p65、p65、IKBα、TLR4、PPAR-α、p-AMPK、AMPK、α-SMA蛋白表达。采用SPSS 23.0统计软件,各组数据均用（?）±s表示,组间的比较采用单因素方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义。结果:1.网络药理学预测小檗碱防治房颤的作用靶点及通路基于网络药理学方法,我们共筛选得到小檗碱与房颤共同作用靶点50个,IL-6、TNF、VEGFA、NOS3、MMP9、STAT3等核心靶点较为重要。在DAVID数据库中对筛选出的50个小檗碱-房颤共同作用靶点进行GO功能富集分析得到GO条目1644个（P<0.05）,其中生物过程（BP）条目1544个,细胞组成（CC）条目31个,分子功能（MF）条目69个。进行KEGG通路富集分析,筛选得到128条信号通路（P<0.05）,其中与房颤直接相关的有30个。可见多个生物学功能与房颤的发生发展关系密切,主要涉及小檗碱可能通过炎症反应、氧化应激、心房纤维化、血管生成等生物过程进行调节,通过调控TNF、PI3K-Akt、MAPK、IL-17、HIF-1、VEGF、TLR、TGF-β等信号通路来发挥治疗房颤的作用。2.小檗碱预防非体外循环冠状动脉旁路移植术后早期新发房颤的单中心、前瞻性临床研究2.1基线特征在本研究最终分析纳入200例患者中,所有患者均按要求完成该试验。两组患者的人口统计资料和术前变量汇总,差异无显着性统计学意义。两组患者术前心率变异性指标差异无显着性统计学意义。2.2主要结果OPCAB术后小檗碱组房颤的发生率为20%（20例）,安慰剂组的房颤发生率为35%（35例）,对照组（P=0.018）。在OPCAB术后,小檗碱组患者7天内发生POAF的风险为安慰剂组患者7天内发生POAF的0.5倍;95%的置信区间:0.29-0.87;P=0.0143。与安慰剂组相比,小檗碱组患者心脏手术后房颤发生率明显减低,可至少减低POAF 13%的发病风险。2.3次要结果和POAF相关测量两组术后房颤最长持续时间,房颤时最大心室率,房颤期间平均心室率等指标均有统计学意义（P<0.05）,小檗碱组均低于安慰剂组。两组房颤患者胺碘酮使用量差异有显着性统计学意义（P=0.013）,小檗碱组用量小于安慰剂组。所有使用胺碘酮的患者都恢复了窦性心律。血液生物标志物测量。选取术后约48小时及第七天2个时间点检测,术前hs CRP,IL-6,NLR,BNP,Hs-Tn T水平小檗碱组与安慰剂组均无明显差异（P>0.05）,术后48小时及第7天小檗碱组的hs CRP、IL-6水平,术后48小时小檗碱组的TNF-α、NLR、BNP血清浓度显着低于对照组,差异有显着性统计学意义（P<0.05）.术后48小时小檗碱组的SOD血清浓度显着高于安慰剂组,差异有显着性统计学意义（P<0.05）.术后48小时小檗碱组的Hs-Tn T,术后7天小檗碱组的NLR与对照组差异无显着性统计学意义（P>0.05）。术后一般情况。两组在呼吸机辅助时间、ICU停留时间、输血量及术后LVEF值上接近,无显着性统计学意义（P>0.05）。心率变异性（HRV）。两组术后HRV各项指标比较,小檗碱组SDNN,SDANN,RMSSD,TP,LF,HF,VLF各指标平均水平均显着高于安慰剂组SDNN,SDANN,RMSSD,TP,LF,VLF的平均水平（P<0.05）,然而两组间LF/HF的差异无显着性统计学意义（P>0.05）,两组间PNN50的差异可能有显着性统计学意义,P=0.067。两组△SDNN,△SDANN,△RMSSD,△HF差异有显着性,有统计学意义（P<0.05）,即两组术后HRV各项指标数值均较术前降低。安慰剂组较小檗碱组降低更为明显。采用重复测量计算HRV各指标,两组SDNN,SDANN术后24-48小时内有显着性差异（P<0.05）,且小檗碱组高于对照组。两组VLF,LF,HF术后第七天有显着性差异（P<0.05）,小檗碱组高于对照组.两组RMSSD,PNN50水平相似,无显着性差异（P>0.05）。2.4不良反应及并发症安全性方面,小檗碱组6例发生短暂的、轻微的不良反应（胃肠道反应,便秘）,不影响生活和治疗,血、尿常规及肝功能均无异常改变。两组在IABP使用率,二次开胸、围手术期心梗、脑血管意外发生率方面,两组之间没有显着差异（P>0.05）.两组在房颤以外心率失常发生率方面差异有统计学意义（P=0.047）,小檗碱组明显低于安慰剂组。3.小檗碱对兔快速心房起搏诱导心肌纤维化模型心房重构的影响及机制研究3.1小檗碱对兔快速心房起搏诱导心肌纤维化模型心房结构重构的影响应用免疫组化法,蛋白印迹（Western Blot）法检测各组兔左心房组织α-SMA蛋白表达,应用Masson染色,H-E染色法比较各组兔心房组织纤维化程度变化。可见心房肌细胞中不同程度的棕色或黄色斑点,表示各组α-SMA免疫组化阳性。RAP组阳性表达最明显,胞浆呈棕黄色,RAP+BBR组相对于RAP组胞浆染色明显减轻。SHAM与SHAM+BBR的作用相当,均低于RAP+BBR组。Control组仅可见极少量阳性染色。Western Blot检测提示RAP+BBR组兔心房组织α-SMA蛋白表达明显低于RAP组（P<0.05）。各组心房组织Masson染色结果显示胶原纤维呈蓝色,心肌细胞呈红色。RAP组心肌纤维化面积增多。RAP+BBR组心肌间质纤维化较RAP组明显减轻。SHAM组与SHAM+BBR组纤维化程度相当。Control组心肌纤维排列整齐,细胞核大小正常。胶原容积分数（CVF）定量分析显示与Control组相比,其于各组心肌间质纤维化明显增加（P<0.001）,ARP+BBR组胶原纤维数量较RAP组明显减少（P<0.001）,两组均高于SHAM组与SHAM+BBR组（P<0.001）,SHAM与SHAM+BBR两组胶原纤维数量相当（P>0.05）。小檗碱对各组兔左房质量/体重比值（LAM/BM）的影响。RAP组兔LAM/BM显着高于其他各组（P<0.001）,RAP+BBR组家兔的LAM/BM明显低于RAP组（P<0.001）。SHAM与SHAM+BBR两组情况无显着性差异（P>0.05）,与Control组比较差异有显着性（P<0.001）HE染色可见Control组心肌纤维排列整齐致密,细胞核清晰,ECM减少,而RAP组心肌纤维萎缩、排列紊乱,并有大量炎症细胞浸润。与RAP组比较,RAP+BBR组上述病理改变明显减轻。SHAM组与SHAM+BBR组病理改变程度相当,介于RAP+BBR组与Control组之间。3.2兔快速心房起搏诱导心肌纤维化模型组织样本转录组测序与分析通过对RAP组和RAP+BBR组进行比较的基因功能富集分析,发现小碱可以干扰功能和通路的变化,例如炎症,代谢,细胞生长和发育等。在信号通路分析中,发现176条有差异的信号通路,选取其中富集结果校正P值最小的相关信号通路,主要包括PPAR、AMPK、Cancer、PI3K-Akt、Fatty acid metabolism、NF-κB、m TOR、TNF、JAK-STAT等多条信号通路。尤其对PPAR信号通路、AMPK信号通路的调节非常活跃。既为阐明小檗碱作用机制提供新的研究切入点,又同时为寻找房颤的治疗新靶点提供参考。3.3小檗碱对兔快速心房起搏诱导心肌纤维化模型炎症信号通路TLR4/NF-κB,PPAR-α,AMPK的影响免疫组化可见心房肌细胞中不同程度的棕黄色或黑色斑点,表示p-65,p-AMPK免疫组化阳性。RAP组中p-65阳性表达明显,表达细胞数明显增多,核黑色胞浆呈棕黄色,p-AMPK表达阳性,细胞数明显增多,核蓝色,胞浆呈棕黄色。RAP+BBR组相对于RAP组均表达阳性,核和胞浆阳性染色显着减轻。SHAM与SHAM+BBR的作用相当,均低于RAP+BBR组。对照组仅可见极少量阳性染色。Western Blot检测提示RAP+BBR组兔心房组织p-p65,TLR4蛋白表达明显低于RAP组（P<0.05）,IKBα蛋白表达明显高于RAP组（P<0.05）。RAP+BBR组兔心房组织PPAR-α、p-AMPK蛋白表达明显高于RAP组（P<0.05）。结论:1.基于网络药理学的方法预测出小檗碱的功效物质基础和对房颤的分子作用机制,挖掘了许多潜在的治疗靶标,充分体现出小檗碱的多靶点-多通路的作用特点,系统揭示了小檗碱防治房颤的药理作用机制,为临床应用提供了一个全新的、深入的参考,也为中医药精准治疗靶点的现代化研究提供了科学依据。2.围手术期应用小檗碱,与安慰剂组相比,患者心脏手术后POAF的发生率明显减低,可至少减低13%的发病风险。同时明显改善了房颤最长持续时间,房颤时最大心室率,房颤期间平均心室率指标,明显减少了POAF患者胺碘酮的使用量,明显降低了炎症细胞因子及氧化应激反应对心肌的损伤。在减轻HRV下降的程度,改善心脏自主神经功能方面具有一定的疗效,且安全性髙。3.小檗碱通过TLR4/NF-κB,PPAR-α,AMPK信号通路有效地抑制炎性递质的产生及释放,减轻炎症反应,减轻心肌纤维化、减轻心肌细胞肥大作用,改善兔快速心房起搏诱导心肌纤维化模型心房结构重构,进而产生预防房颤的作用。
李娜[2]（2021）在《基于网络药理学的白僵蚕治疗瘢痕的分子通路机理研究和临床研究》文中进行了进一步梳理目的:目前对白僵蚕治疗瘢痕疾病的机制研究匮乏,应用网络药理学、生物信息学分析、分子靶向对接,研究白僵蚕治疗瘢痕的作用靶点、化合物、KEGG信号通路,以揭示白僵蚕治疗瘢痕疙瘩或增生性瘢痕的分子通路、作用机制。进一步将白僵蚕（0.5%薄荷醇为透皮促渗透剂基质）用于肛瘘患者的术后创面局部换药,观察其对术后瘢痕防治的临床疗效。材料与方法:1.利用网络药理学预测白僵蚕的活性成分、筛选得到疾病-药物共同靶基因,进一步实施相关靶基因的功能分析和代谢通路分析,构建白僵蚕治疗瘢痕的药物成分-靶基因-分子信号通路交互网络。随后给予体外细胞实验验证,除了CCK8细胞的增殖抑制实验、Transwell细胞侵袭实验外,人增生性瘢痕成纤维细胞在不同实验分组（对照组、不同浓度白僵蚕给药组、单体白僵菌素给药组、PI3K/Akt抑制剂LY294002给药组）干预下MMP-1、MMP-2、MMP-9、Akt、P-Akt、beta-Actin、P13K p85α、p38 MAPK、GAPDH、NF-κB蛋白的表达水平与空白对照组之间的差异。而后我们以白僵蚕3个主要化学成分（白僵菌素、环（D-脯-D-苯丙）二肽、（+）-松脂醇）和4个关键瘢痕干预靶点（MMP1、MMP9、MMP13、PI3k）为研究对象,利用分子靶向对接,再次对白僵蚕3个主要化学成分与疾病靶点的相互作用进行深一步探讨。2.收集2020年2月至2020年8月在咸阳市中心医院肛肠科住院的76例肛瘘患者,每组各38例,治疗组术后给予白僵蚕（0.5%薄荷醇为透皮促渗透剂基质）局部外用,对照组术后给予曲安奈德局部外用。研究过程中,使用随机数表,随机分配分为治疗组、对照组。分别对两组干预（治疗前、治疗后）的基线特征、温哥华瘢痕量表（Vancouver Scar Scale,VSS）的减少程度、瘢痕宽度（超声检测）等指标分析;采用苏木精-伊红（H&E）染色观察两组治疗前、后的组织形态;采用免疫组织化学染色法,检测两组治疗前、后,创面组织中血管内皮生长因子（VEGF）、增殖细胞核抗原（PCNA）、波形蛋白（Vimentin）染色阳性细胞数;两组的术后并发症（色素沉着、血管分布、柔韧性、瘢痕高度、皮肤萎缩、毛细血管扩张、局部溃疡、色素减退）指标给予观察及记录、分析;对两组临床疗效、创面愈合时间、创面愈合率、满意度等数据分析,完成白僵蚕（0.5%薄荷醇为透皮促渗透剂基质）对肛瘘术后创面愈合,抑制瘢痕形成的临床疗效评价。结果:1.经过筛选出白僵蚕单味药物688个靶基因中的73个与瘢痕疾病相关的药物成分,分子信号通路148条,通过构建的白僵蚕与瘢痕疾病网络,发现白僵蚕抗氧化、参与凋亡、补体激活、炎症反应、细胞迁移、细胞基质重建、以及抗肿瘤、改善低氧状态、衰老调节中起着关键作用。体外实验表明:与空白对照组相比,白僵蚕组、白僵菌素组、LY294002组干预后人增生瘢痕成纤维细胞中的MMP-1、MMP-9、P-Akt、p38 MAPK、NF-κB的表达均显着降低（P<0.05）;白僵蚕、白僵菌素干预下,能有效抑制PI3K/Akt/MMP1/MMP9信号通路。基于Autodock vina 1.1.2对接打分值,计算结果表明白僵菌素﹑环（D-脯-D-苯丙）二肽﹑（+）-松脂醇3个化合物可能同时作用于4个靶点,提示白僵蚕通过作用于多靶点,发挥协同增效的作用,协同抑制PI3K/Akt/MMP1/MMP9分子信号通路。2.在76例肛瘘患者中,术后采用白僵蚕（0.5%薄荷醇为透皮促渗透剂基质）的治疗组创面愈合时间优于曲安奈德对照组（P<0.05）,创面愈合时间上白僵蚕组在25.39±3.03,曲安奈德对照组为29.48±2.90,两组创面愈合时间、创面愈合率方面比较差异有统计学意义（P<0.05）。经过治疗组和对照组干预后,温哥华瘢痕量表（VSS）的减少程度、超声检查瘢痕宽度也有显着差异（P<0.05）,两组患者组织中血管内皮生长因子（VEGF）、增殖细胞核抗原（PCNA）、波形蛋白（Vimentin）阳性细胞染色数有统计学差异（P<0.05）。两组的术后并发症（柔韧性、瘢痕高度、皮肤萎缩、毛细血管扩张、色素减退）显着差异（P<0.05）,白僵蚕（0.5%薄荷醇为透皮促渗透剂基质）有利于减少肛瘘术后瘢痕形成（P<0.05）,降低肛瘘术后疼痛。对两组肛瘘术后色素沉着比较差异无统计学意义（P>0.05）,治疗组未出现局部和全身不良反应。结论:1.白僵蚕能有效抑制PI3K/Akt/MMP1/MMP9分子信号通路,亦能有效抑制人增生瘢痕成纤维细胞增殖、侵袭,调控瘢痕疾病的发生发展的作用。2.白僵蚕（0.5%薄荷醇为透皮促渗透剂基质）在肛瘘术后创面愈合上,操作简便、创伤小、痛苦较少、疗效好、有利于减少肛瘘术后瘢痕形成,值得临床开展。
季剑雄[3]（2021）在《LncRNASChLAP1和E3泛素连接酶TRIM22在胶质母细胞瘤中的作用与机制研究》文中提出研究背景在所有类型的人类肿瘤中,胶质母细胞瘤（Glioblastoma,GBM）的治疗属于最具挑战之一。作为成人中最常见和最致命的原发脑恶性肿瘤,其生长方式的特点为膨胀性与浸润性,即使应用手术（最大保护脑功能前提下最大范围切除肿瘤）、术后同步放化疗及后续辅助化疗的标准治疗方案,GBM患者的中位生存期仅为12-15个月,5年生存期低于10%。随着对GBM分子病理和基因组学等认识不断加深,发现了参与维持肿瘤恶性生物行为的多条核心信号通路异常调节,如PI3K/AKT、RB、p53等,而临床试验结果提示,目前针对这些关键信号通路的分子靶向治疗效果有限,具有明显的局限性,应证了 GBM具有高度的异质性,其发生发展不是单一信号通路或分子所调节的。因此发现GBM相关的异常信号转导途径及关键调控分子将有助于了解肿瘤发生发展机制,探索新的靶向治疗策略,从而走出目前临床胶质瘤精准治疗的困境。核因子活化 B 细胞 κ 轻链增强子（Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activatedBcells,NF-κB）是一种可以控制DNA转录、细胞因子产生的同源或异源二聚体DNA 结合复合体,由 p50（NF-κB1,p105）,p52（NF-κB2,p100）,p65（RelA）,RelB 和 c-Rel五个结构相关的亚基组成,通常存在于胞质中,与抑制蛋白Iκ(B（Inhibitor of NF-κB）结合形成三聚体而失活。当上游信号因子刺激相应受体并传递至IKK（IκB kinase）激酶复合物后,使IκB蛋白磷酸化及降解,而NF-κB从三聚体中解离出且暴露出核定位基序（Nuclear localization motif,NLM）,进入细胞核内促进下游基因转录。近年来研究发现,NF-κB异常活化除与炎症和免疫系统疾病有关,还可能在包含GBM在内的多种人类肿瘤中起到促癌作用,巩固了肿瘤细胞的快速增殖、血管新生、治疗抵抗等恶性表型。尽管NF-κB信号通路对于GBM恶性表型如快速生长和治疗抵抗等至关重要,但目前针对该通路的药物开发仍处于非特异性或特异性靶向IKK激酶但副作用过大的瓶颈,在多项临床试验中相较于标准疗法,GBM患者预后并未取得较大改善。因此,深入研究GBM中NF-κB异常活化机制,剖析该通路的基因调控网络,将有助于采取不同以往的研究策略,研发小分子抑制剂,解决GBM临床治疗的窘境。长链非编码RNA（Long non-coding RNA,lncRNA）,是一类长度大于200个核苷酸（Nucleotide,nt）、生物学功能丰富的非编码RNA。随着二代测序技术的迅速发展,数量巨大的lncRNA被发现。由于其数量远超编码蛋白的基因,有望为寻找肿瘤诊断及预后生物标志物、治疗靶点提供广阔的研究空间。LncRNAs参与了多层面调控基因表达的过程,例如染色体失活、基因组印记、染色质修饰、转录激活或干扰等,可能通过与蛋白质、RNA、DNA等相互作用发挥生物学功能。近年来研究发现表达失调的lncRNAs,能通过上述的调控方式,介导肿瘤相关的核心信号通路,影响包括GBM在内的多种肿瘤细胞的血管新生、侵袭迁移、恶性增殖、治疗抵抗等多种生物学行为。越来越多研究证实,除了一系列的蛋白和miRNAs,lncRNAs也与NF-κB信号通路密切相关。例如,NKILA（NF-κB interacting lncRNA）在乳腺癌细胞中表达可受到NF-κB转录水平调控,同时还能通过抑制IκBα磷酸化和NF-κB信号通路活性起到负向反馈调控的作用;MALAT1（Metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1）则可以与 p65-p50 蛋白复合物相互作用,减弱其DNA结合能力,从而起到抑制NF-κB转录活性的功能。LncRNA-NF-κB的交联及潜在机制的探索已成为当下研究的热点之一。长链非编码RNA（Second chromosome locus associated with prostate-1;LINC00913）,作为lncRNA的一员,文献报道其在前列腺癌、膀胱癌等多种常见肿瘤中发挥癌基因作用,介导了肿瘤细胞的恶性增殖、转移等表型,其高表达量提示患者预后不佳。本课题组前期使用qRT-PCR初步检测了SChLAP1在正常脑和WHO Ⅱ-Ⅳ级胶质瘤组织中的表达水平,发现其倾向高表达于胶质瘤组织,并且呈现显着的级别相关性,提示SChLAP1可能与胶质瘤恶性演变有关,但其与胶质瘤一些主要分子标志物如IDH突变、ATRX突变等的相关性未见报道,仍有待阐明。此外SChLAP1在GBM的作用和调控机制尚不清楚,仍有待深入研究。泛素化修饰是翻译后修饰（Post-translational modification,PTM）的一种常见形式,其具有直接调控蛋白质功能和去向的作用,广泛参与到各种细胞活动中。其中泛素的Lys-48（K-48）和Lys-63（K-63）是最常见的多聚泛素链连接位点:K-48泛素链是底物被招募至26S蛋白酶体降解的标示;K-63泛素链则起着酶活性改变、信号转导和细胞内吞的作用。已有文献报道,K-48和K-63连接型多聚泛素化修饰方式可通过影响经典和非经典NF-κB信号通路各重要组件的表达和功能,介导信号转导的活性。泛素化反应往往需要多种泛素化相关酶,如泛素活化酶E1、泛素结合酶E2、泛素-蛋白连接酶E3的协同合作才能完成,其中任何一步发生异常都有可能导致信号通路异常,乃至于疾病如肿瘤的发生。相比于E1和E2,由于E3庞大的数量,与底物间的特异性识别等特点,吸引了研究者格外的关注。TRIM（Tripartite motif）蛋白家族,由于具有3个高度保守的结构域得名,其结构特征是从N端RING结构域开始,随后一个或两个B box域,然后是卷曲螺旋域的域簇,已被报道在多种正常细胞中通过E3泛素连接酶活性参与调控NF-κB转录活性。然而,具体哪些TRIM基因能在GBM细胞中调控NF-κB转录活性以及潜在调控机制尚不清楚,值得进一步探究。本论文利用多种技术手段,分两部分深入研究了 lncRNA SChLAP1和E3连接酶TRIM22促进GBM恶性生物学行为的作用及调控NF-κB转录活性的具体分子机制,为GBM治疗的靶点选择以及未来靶向药物研发提供新的思路。第一部分:LncRNA 与HNRNPL蛋白形成复合物促进胶质母细胞瘤恶性增殖目的揭示lncRNASChLAP1在正常脑组织和不同级别胶质瘤组织中的表达水平和GBM细胞系中的表达分布,分析其与胶质瘤临床分子病理学特征的相关性,探究SChLAP1对GBM体外细胞增殖和体内成瘤生长的影响,筛选并鉴定特异互作的蛋白,明确两者间相互作用的生物学功能及对下游信号通路的影响。方法1.利用RNA原位杂交（RNA in situ hybridization,RNA-ISH）检测正常脑组织和不同级别胶质瘤组织中SChLAP1的表达;RNA荧光原位杂交（RNA fluorescence in situ hybridization,RNA-FISH）、核质分离后qRT-PCR检测SChLAP1在人源正常星形胶质细胞（Normal Human Astrocytes,NHAs）及 GBM 细胞系 LN229,U118MG,GBM#P3 和 BG7中的表达分布。2.利用qRT-PCR验证敲减或外源性过表达SChLAP1慢病毒的效率;细胞直接计数和平板克隆形成实验检测上述操作对胶质瘤细胞体外恶性增殖能力的影响;构建裸鼠原位移植瘤模型,利用小动物活体成像系统定时观察上述操作对胶质瘤细胞体内生长的影响;Kaplan-Meier生存曲线分析荷瘤小鼠生存期的变化。3.利用RNA pull-down结合LC-MS/MS法筛选SChLAP1在胶质瘤细胞系中的候选相互作用蛋白;RNA免疫沉淀实验（RNA immunoprecipitation,RIP）验证SChLAP1与HNRNPL间的相互作用;RNA pull-down探究两者作用的具体结构域。4.利用免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation,Co-IP）结合LC-MS/MS法筛选并鉴定ACTN4为SChLAP1-HNRNPL复合物下游的候选癌蛋白;免疫组化检测ACTN4蛋白在正常脑组织和不同WHO级别的胶质瘤组织中的表达;基于Rembrandt和CGGA数据库,绘制ACTN4表达量相关的生存曲线图;Co-IP研究ACTN4-HNRNPL作用的具体结构域。5.使用蛋白酶体抑制剂MG132（20μM）和蛋白合成抑制剂放线菌酮（Cycloheximide,CHX;25μg/mL）预处理相应胶质瘤细胞,Western blot检测敲减或外源过表达SChLAP1对ACTN4蛋白表达水平和半衰期的影响;体内泛素化实验检测上述操作对ACTN4蛋白的总泛素化修饰水平的影响;MG132预处理8h后,使用Co-IP研究SChLAP1对ACTN4-HNRNPL间相互作用的影响。6.基于CGGA数据库,对ACTN4相关的基因同时结合临床病理特征进行聚类热图分析;利用Venn图分析比对ACTN4相关的基因和NF-κB通路下游靶基因;荧光素酶报告基因系统检测敲减或过表达SChLAP1对NF-κB转录活性的影响;核质蛋白分离及免疫荧光检测分析上述操作对P65蛋白亚细胞定位的影响。结果1.LncRNA SChLAP1在胶质瘤中的表达及亚细胞定位RNA-ISH结果显示,SChLAP1在正常脑组织中几乎不表达。相比于低级别胶质瘤（LGG,WHO Ⅱ）,SChLAP1更倾向高表达于高级别胶质瘤（HGG,WHO Ⅲ-Ⅳ）,在GBM内表达最充足。其表达量与胶质瘤WHO分级,野生型IDH1显着正向相关。RNA-FISH 结果显示,在 GBM 细胞系 LN229,U118MG,GBM#P3 和 BG7 中,Cy3-SChLAP1荧光信号较NHA中更强。核质分离后的qRT-PCR检测分析提示,SChLAP1主要表达于细胞核内,少量分布于胞浆中。2.敲减SChLAP1对胶质母细胞瘤恶性进展的影响qRT-PCR检测结果显示,两条靶向SChLAP1的短发夹RNAs（Short hairpin RNAs,shRNAs）慢病毒能在LN229和GBM#P3中有效下调SChLAP1。细胞直接计数和平板克隆形成实验显示,敲减SChLAP1能显着抑制GBM细胞的体外增殖能力。通过建立原位移植瘤模型及小动物活体成像系统定时观察发现,敲减SChLAP1能明显延缓GBM细胞在体内的生长,并且相较于对照组,明显延长小鼠的中位生存期。3.筛选并鉴定RNA结合蛋白HNRNPL与SChLAP1在胶质瘤细胞中存在相互作用RNA pull-down结合LC-MS/MS法筛选鉴定HNRNPL蛋白是SChLAP1的候选互作蛋白之一,其主要的结合区域为HNRNPL的RRM2与SChLAP1的exon2（338-433 bp）。RIP实验结果进一步确认了两者的结合。此外,外源性调控SChLAP1表达不影响HNRNPL蛋白水平,但敲低HNRNPL会导致SChLAP1降解速率加快,提示SChLAP1-HNRNPL存在紧密的相互作用,可能形成复合物来发挥作用。4.筛选并鉴定ACTN4为SChLAP1-HNRNPL复合物下游的候选癌基因Co-IP结合LC-MS/MS法筛选鉴定ACTN4为SChLAP1-HNRNPL复合物下游的候选癌蛋白之一,负责结合的区域是ACTN4的Rod和CaM-like结构域及HNRNPL的RRM3结构域。免疫组化结果提示,ACTN4蛋白表达量与患者年龄,野生型IDH1,野生型ATRX及胶质瘤WHO分级呈显着正相关。Rembrandt和CGGA数据库的生存曲线与Log-rank检验提示,ACTN4高表达与患者预后不佳显着相关。5.SChLAP1-HNRNPL复合物对ACTN4蛋白稳定性的影响和调控机制Western blot结果显示,外源性调控SChLAP1表达与ACTN4蛋白表达变化趋势一致,并且胶质瘤细胞系及患者样本中SChLAP1与ACTN4蛋白水平呈正相关关系。进一步研究发现,敲减SChLAP1能在不影响ACTN4 mRNA表达情况下,降低ACTN4蛋白水平,使用MG132处理却能恢复到正常,提示SChLAP1可能参与抑制了 ACTN4蛋白的蛋白酶体-泛素化降解,Cycloheximide chase assay 与 in vivo ubiquitination assay 也证实了这一点。Co-IP结果显示,过表达 SChLAP1会增加HNRNPL与ACTN4的相互作用,敲减SChLAP1则反之。6.SChLAP1对ACTN4下游NF-κB信号通路活性的影响基于CGGA数据库,聚类热图分析得出ACTN4的1046个正向与668个负向相关基因,而且ACTN4的表达升高与胶质瘤WHO分级、Classical亚型、患者年龄及野生型IDH1正相关。此外通过比对NF-κB靶基因公共数据库（http://bioinfo.lifl.fr/NF-KB/）与ACTN4相关基因,显示存在19个基因的重合;荧光素酶报告基因系统检测结果显示,敲减SChLAP1能减弱胶质瘤细胞内NF-κB转录活性,而过表达SChLAP1的效果相反;核质蛋白分离及免疫荧光检测分析显示,敲减SChLAP1能减少P65蛋白在细胞核内定位,而过表达SChLAP1能促进P65蛋白核内表达。7.SChLAP1与HNRNPL蛋白相互作用对胶质母细胞瘤恶性进展的影响细胞直接计数实验显示,过表达SChLAP1所导致的GBM细胞体外增殖能力增强,能被SChLAP1-exon2缺失或敲减HNRNPL抑制。通过建立原位移植瘤模型及小动物活体成像系统定时观察发现,过表达SChLAP1所导致的GBM细胞在体内生长加剧,及明显缩短小鼠中位生存期,同样可以被exon2缺失或敲减HNRNPL抑制。结论1.SChLAP1高表达于高级别胶质瘤,与多个临床病理指标正相关;2.SChLAP1与HNRNPL形成复合物发挥促癌作用,HNRNPL是其下游的关键效应分子;3.SChLAP1能加强HNRNPL与ACTN4结合,减少ACTN4蛋白的蛋白酶体-泛素化途径降解,从而增强其蛋白稳定性;4.SChLAP1能通过调控ACTN4蛋白表达驱动P65蛋白核转位以激活NF-κB转录,从而促进GBM细胞恶性增殖。第二部分:TRIM22通过其E3泛素连接酶活性激活NF-κB信号通路促进胶质母细胞瘤恶性增殖目的筛选鉴定出在GBM细胞内最可能参与激活NF-κB信号通路的TRIM基因,揭示其在正常脑组织和不同级别胶质瘤组织中的蛋白表达水平,分析其与胶质瘤临床分子病理学特征的相关性,探究其对GBM体外细胞增殖和体内成瘤生长的影响及激活NF-κB信号通路的分子机制。方法1.利用NF-κB荧光素酶报告基因系统筛选在GBM细胞系U87MG和LN229内可能参与激活NF-κB信号通路的TRIM基因。2.免疫组化检测TRIM22蛋白在正常脑组织和不同WHO级别胶质瘤组织中的表达水平。3.利用Co-IP探究TRIM22-IκBα和TRIM22-IKKγ蛋白间相互作用。4.利用Western blot验证Cas9-sgRNA敲除或外源性过表达慢病毒的效率;细胞直接计数和Ki-67免疫荧光染色实验检测上述操作对胶质瘤细胞体外恶性增殖能力的影响;荧光素酶报告基因系统检测上述操作对NF-κB转录活性的影响;核质蛋白分离及免疫荧光检测分析上述操作对P65蛋白亚细胞定位的影响;构建裸鼠原位移植瘤模型,利用小动物活体成像系统定时观察上述操作对胶质瘤细胞体内生长的影响;Kaplan-Meier生存曲线分析荷瘤小鼠生存期的变化。5.使用蛋白酶体抑制剂MG132和蛋白合成抑制剂CHX预处理相应胶质瘤细胞,Western blot检测敲除或外源过表达TRIM22或TRIM22酶失活突变体对IκBα蛋白表达水平和半衰期的影响;体内/外泛素化实验检测上述操作对IκBα蛋白K-48连接型泛素化和IKKγ蛋白K-63连接型泛素化修饰水平的影响。结果1.筛选鉴定在胶质瘤细胞中参与正向调控NF-κB信号通路的TRIM基因及表达情况NF-κB荧光素酶报告基因系统检测结果显示,经过初步筛选后的5个TRIM基因中（TRIM5,TRIM21,TRIM22,TRIM38,TRIM56）,只有敲减TRIM22 后,能在 U87MG和LN229两个GBM细胞系内均明显下调NF-κB转录活性;免疫组化结果提示,TRIM22蛋白表达量与野生型IDH1,野生型ATRX及胶质瘤WHO分级呈显着正相关,正常脑组织中几乎不表达。2.敲除TRIM22对胶质母细胞瘤恶性进展的影响Western blot 结果显示,两条靶向TRIM22 的不同序列 sgRNAs（Small guide RNAs,sgRNAs）慢病毒能在稳定表达Cas9的U87MG和LN229中有效敲除TRIM22;在不影响总蛋白表达的情况下,统一下调NF-κB信号通路内关键元件IKKα/β（Ser176/180）,IκBα（Ser32/36）,P65（Ser536）的磷酸化水平,同时上调IκBα总蛋白水平。细胞直接计数和Ki-67免疫荧光染色实验显示,敲除TRIM22能显着抑制GBM细胞的体外增殖能力。通过建立原位移植瘤模型及小动物活体成像系统定时观察发现,敲除TRIM22能明显抑制GBM细胞在体内的生长速度,而且与对照组相比,显着延长小鼠的中位生存期。3.TRIM22依赖其E3连接酶活性发挥促进胶质母细胞瘤恶性进展的作用Western blot结果显示,相比于对照组（Flag-EV）,在LN229和U118MG细胞中过表达TRIM22全长蛋白（Flag-TRIM22-FL）,NF-κB信号通路内关键元件IKKα/β（Ser176/180）,IκBα（Ser32/36）,P65（Ser536）的磷酸化水平统一地上调,同时 IκBα总蛋白水平下降,而过表达TRIM22的2个E3酶失活体（Flag-TRIM22-ARING/-TRIM22-C15/18A）均无法调控上述蛋白水平变化。细胞直接计数和Ki-67免疫荧光染色实验显示,过表达TRIM22（Flag-TRIM22-FL）能显着加强GBM细胞的体外增殖能力。通过建立原位种瘤模型及小动物活体成像系统定时观察发现,过表达TRIM22（Flag-TRIM22-FL）能明显加快GBM细胞在体内的生长速率,相比于对照组,显着延长荷瘤小鼠的中位生存时间。但过表达 TRIM22 的 E3 酶失活体（Flag-TRIM22-ΔRING/-TRIM22-C1 5/18A）对GBM细胞在体内外的增殖能力无显着影响,与对照组对比无差异,小鼠生存期同样未见显着变化。此外,荧光素酶报告基因系统检测结果显示,过表达TRIM22（Flag-TRIM22-FL）能显着增强胶质瘤细胞内NF-κB转录活性;核质蛋白分离及免疫荧光检测分析显示,过表达TRIM22（Flag-TRIM22-FL）能促进P65蛋白在细胞核内定位。但相较于对照组,过表达 TRIM22 的 E3 酶失活体（Flag-TRIM22-ΔRING/-TRIM22-C1 5/18A）后 GBM 细胞的NF-κB转录活性和P65核定位均无显着变化。4.TRIM22对IκBα蛋白稳定性的影响和调控机制进一步实验分析表明,敲除TRIM22能在不影响IκBα mRNA表达情况下,升高IκBα蛋白水平,而过表达TRIM22能使IκBα蛋白水平下降,但E3酶失活体却失去了调控作用,提示TRIM22调控IκBα蛋白水平可能是通过蛋白酶体-泛素化降解的方式。Cycloheximide chase assay结果提示,相比于对照组,敲除TRIM22能显着延长IκBα蛋白降解半衰期,过表达TRIM22则反之,而TRIM22的E3酶失活体没有任何影响。In vitro/vivoubiquitinationassay 结果也佐证了这一点。Co-IP 结果显示,TRIM22 与 IKBα蛋白间存在相互作用,主要结合区域是TRIM22蛋白的89-131aa（B-Boxdomain）/133-223aa（Coiled-coil domain）/352-498aa（SPRY domain）和 IKBα 蛋白的 182-317aa（AR4/AR5）。5.TRIM22对NF-κB通路内IKK复合物的调节亚基IKKγ的影响和调控机制Co-IP 结果显示,在 GBM 细胞系 U87MG,LN229,U118MG,TRIM22 与IKKγ蛋白存在内源性相互作用;In vivo ubiquitination assay 结果显示,敲除TRIM22能明显下调IKKγ蛋白的K-63型多聚泛素化修饰水平,过表达TRIM22则反之,而TRIM22的E3酶失活体没有任何影响。6.IκBα是TRIM22发挥促胶质母细胞瘤进展作用的关键下游蛋白荧光素酶报告基因系统检测结果显示,过表达TRIM22所导致的GBM细胞NF-κB转录活性增强,能被srIκBα过表达所抵消。细胞直接计数实验显示,过表达TRIM22所导致的GBM细胞体外增殖能力增强,能被srIκBα过表达所抑制。通过建立原位种瘤模型及小动物活体成像系统定时观察发现,过表达TRIM22所导致的GBM细胞在体内生长加剧,及明显缩短的小鼠中位生存时间,而上述增强效果可由过表达srIκBα显着抑制。结论1.TRIM22是维持GBM细胞内NF-κB高转录活性的重要癌基因;2.TRIM22蛋白常高表达于高级别胶质瘤,与多个临床病理指标正相关;3.TRIM22依赖E3泛素连接酶功能,通过蛋白间相互作用的方式分别促进IKKγ的K-63型多聚泛素化和IκBα的K-48型多聚泛素化,以此激活NF-κB信号通路进而促进GBM进展。
程赢[4]（2021）在《新型靶向配体CL429防治辐射损伤的作用及机制研究》文中研究说明一、研究背景在辐射损伤防治研究领域,重度电离辐射损伤的救治一直是放射医学研究的重点难题[1,2]。该领域目前面临的主要挑战性科学问题:一是缺乏作用机理明确的辐射防护新靶点,二是缺乏高效、低毒的治疗辐射损伤的辐射防护剂。目前国际上效果最好的是美国FDA批准的抗辐射药物WR-2721,并且已经装备美军,但因其毒副作用较明显,在一定程度上限制了WR-2721的使用[3,4];我军配备的辐射损伤防护药物主要有两大类:雌激素类衍生物（500注射液、523片）和茜草提取物（408片）,但这些药物还停留在上世纪六七十年代的水平,疗效不佳且毒副作用大;目前处于研究阶段的多数辐射防护药物存在效应不明确、机制不清或毒性反应大等缺点。因此,深入研究辐射损伤机理,寻找辐射损伤治疗更为高效低毒的治疗措施,具有重要的临床意义。同时,在国家战略层面,提高我国大剂量辐射损伤的防治水平符合国家安全需求,具有十分重要的国防价值。2008年,Science杂志首次报道了Burdelya LG等利用TLR5的改良型激动剂CBLB502激活TLR5信号分子,进而活化NF-κB在辐射损伤动物模型中发挥了极强的辐射防治效果[5]。这一开创性的研究成果为辐射损伤防治研究开辟了一个全新的研究方向,使得TLRs受体家族在辐射损伤防治研究领域受到极大的关注,成为了辐射防治研究领域的新热点[6,7]。继TLR5之后,TLRs家族受体其它成员（如TLR2[8-10],TLR4[11-14]和TLR9[15-19]等）的辐射防护作用也相继被发现和深入研究,目前TLR2和TLR4通路在电离辐射损伤防护方面的研究较为深入,已经证实TLR2和TLR4是治疗电离辐射损伤的重要新靶点[11,20],并且陆续有大量的研究成果被报道出来。但是目前仍有两大问题制约靶向TLR2/4研究转化为实际应用。一是目前报道的TLR2/4靶向配体不能同时兼顾高效和低毒这两方面;如TLR4配体LPS防护效价高但是毒性也高[11],如果进行各种修饰改进则会出现减毒减效的情况,而TLR2配体Pam2,Pam3虽然毒副作用小但是本身防护效价较弱等;二是这些靶向配体在受照射前预防使用效果良好,但受照后使用治疗效果较差,不能满足重度辐射损伤治疗的需要。因此,关于TLR2/4通路的报道虽然为辐射防护研究带来良好前景,但是迄今为止尚未完全解决治疗重度电离辐射损伤的技术难题。针对以上两大问题,为寻找具有显着的辐射损伤防治作用且毒性较低的TLR2或/和TLR4靶向配体,本课题通过前期文献检索、理论分析和大量预实验,从TLR2/4相关配体中筛选到一种对电离辐射损伤具有明确防护和治疗作用的新型TLR2/NOD2双靶向配体CL429[21,22]。其不仅具有照前给药的预防作用也有照后给药的治疗作用,而且还兼顾了高效与低毒两个方面。在此基础之上,本课题开展了CL429防治电离辐射损伤的作用及初步机制研究。首先,从整体动物水平和细胞水平确认了CL429较低的毒副作用,并分别摸清CL429在小鼠和细胞的最佳给药剂量;然后通过小鼠急性放射病模型,分别比较了CL429与WR2721和LPS的照前预防和照后治疗效果,以及CL429与TLR2配体Pam3、NOD2配体MDP、Pam3+MDP联合给药的预防和治疗效果,并进一步从辐射敏感的组织器官骨髓造血组织和小肠组织的层面多角度明确了CL429的辐射防护效果。在辐射防护效应明确的前提下,从TLR2和NOD2信号通路的角度在整体动物和细胞水平揭示了CL429发挥辐射防护作用可能主要依赖TLR2经典的TLR2-MYD88-NF-κB信号通路[23,24],部分依赖于NOD2,并且CL429可能并不是通过上调TLR2和NOD2的m RNA表达水平来发挥辐射防护作用。最后,通过RNA测序鉴定CL429防护辐射损伤中新关键效应分子及其相关的信号通路,进一步通过热图、KEGG富集通路分析对CL429辐射防护作用机制进行深入的探讨。本课题的创新之处主要有以下3个方面:首先,成功通过文献调研、理论分析以及预实验筛选出新型TLR2/NOD2双靶向配体CL429,它不仅具有辐射损伤预防作用又有治疗作用,同时还兼顾了高效与低毒;其次,从细胞、组织以及整体动物水平全方位探索了CL429防治电离辐射损伤的效应及规律;最后,证明了CL429发挥辐射损伤防护效应主要依赖TLR2,部分依赖NOD2,进一步通过RNA测序成功筛选出CL429防治电离辐射损伤相关的信号通路（TLR2-My D88-NF-κB）以及关键作用分子（S100A9等）,为辐射损伤防治研究提供了新的研究思路和干预途径。二、研究目标1.通过大量的文献调研、理论分析以及预实验筛选出高效低毒的新型TLR2/NOD2双靶向配体CL429,并从整体动物水平和体外细胞水平摸清其毒性剂量,为CL429成为潜在的新型辐射损伤防护剂研究奠定基础。2.探明整体动物水平CL429最佳的辐射防护给药剂量和给药方式,从整体动物和辐射敏感组织器官两个层面明确CL429的辐射防护效应。为CL429成为可能的高效低毒的辐射防护剂提供实验依据。3.阐明CL429调控TLR2/NOD2信号通路防治电离辐射损伤的科学依据;通过二代测序寻找CL429防护辐射损伤的新靶点分子,从多个角度一起阐明CL429防治辐射损伤的作用机制,为电离辐射损伤防护研究这一重点问题探索新的研究路径。三、研究内容1.新型双靶向配体CL429的筛选及其对细胞和小鼠的急性毒性效应研究（1）新型双靶向配体CL429的筛选:通过前期文献调研、理论分析选中TLRs家族成员相关的13种靶向配体,选用HIEC细胞给药后8Gy照射通过CCK-8法检测细胞活力。（2）CL429细胞急性毒性试验:对数生长期的HIEC细胞中分别加入不同终浓度的CL429（细胞培养基中CL429的浓度分别为0μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml、800μg/ml、1600μg/ml、3200μg/ml）,培养24小时后采用CCK-8法检测OD值来评价细胞活力。（3）CL429小鼠急性毒性试验:6周龄雄性C57BL/6小鼠随机分组后分为2组（n=6）:LPS组和CL429组。两组都通过腹腔注射给药,给药量均为25mg/kg体重（500μg/只）,然后连续观察给药后48小时内小鼠存活情况。2.CL429对整体动物的辐射防护效应（1）CL429小鼠辐射防护最佳给药剂量的摸索:6周龄雄性SPF级C57BL/6小鼠,分为8组（对照组、1μg/只+1μg/只、5μg/只+5μg/只、10μg/只+10μg/只、20μg/只+20μg/只、50μg/只+50μg/只、100μg/只+100μg/只、200μg/只+200μg/只）,照前分两次腹腔注射给药,分别为照前24小时和照前2小时。连续观察照后（7.5Gy）30天小鼠存活情况（2）CL429与WR2721和LPS辐射损伤预防和治疗效果对比:6周龄雄性SPF级C57BL/6小鼠在两个照射剂量点（7.5Gy和9Gy）,每组（CL429（2.5mg/kg）、WR2721（150 mg/kg）、PBS对照组和LPS（2.5 mg/kg））分别接受照前24小时和2小时两次腹腔注射给药或者照后立即1次给药,连续观察照后30天小鼠存活情况。（3）CL429与Pam3、MDP以及Pam3+MDP辐射损伤预防和治疗效果对比:6周龄雄性SPF级C57BL/6小鼠在9Gy照射剂量点,每组（CL429、Pam3（50 ng/kg）、MDP（5 mg/kg）、Pam3+MDP以及PBS对照组）分别接受照前24小时和2小时两次腹腔注射给药或者照后立即1次给药,连续观察照后30天小鼠存活情况。3.CL429对骨髓造血系统辐射损伤防治效应（1）骨髓HE染色病理分析:CL429组和PBS对照组雄性C57BL/6小鼠两次给药后接受7.5Gy全身照射,在照后第1、5、10天取股骨头制作病理切片HE染色分析。（2）小鼠骨髓有核细胞凋亡检测:雄性C57BL/6小鼠两次给药后分别接受7.5Gy和9Gy的全身照射,于照后24小时取小鼠骨髓细胞,采用流式细胞术FITC-Annexin V/PI双染色法检测骨髓组织有核细胞的凋亡率。（3）CL429对小鼠骨髓造血干细胞和祖细胞比例的影响:雄性C57BL/6小鼠7.5Gy全身照后24小时取小鼠骨髓细胞,通过免疫荧光法流式检测小鼠骨髓有核细胞中造血干细胞（Lin-c-Kit+Sca-1+,LKS+）和造血祖细胞（Lin-c-Kit+Sca-1-,LKS-）的比例变化情况。（4）小鼠骨髓移植后脾集落形成单位测定:给药后接受4Gy全身照射的雄性C57BL/6供体鼠,在照后24小时将其骨髓有核细胞（1×105个细胞/鼠）移植到接受7.5Gy全身照射的受体鼠体内,观察骨髓移植9天后小鼠脾结节的情况。4.CL429对肠道组织辐射损伤防治效应（1）小肠组织HE染色病理学分析:CL429组和PBS对照组雄性C57BL/6小鼠两次给药后接受9Gy全身照射,在照后第1、3.5、5天取小肠组织做HE染色病理学分析。（2）小肠隐窝免疫组化Ki67细胞增殖检测:CL429组和PBS对照组雄性C57BL/6小鼠两次给药后接受9Gy全身照射,在照后第3.5、5天取小肠组织做免疫组化Ki67染色检测小肠隐窝细胞凋亡。（3）小肠隐窝免疫组化TUNEL染色隐窝细胞原位凋亡检测:CL429组和PBS对照组雄性C57BL/6小鼠两次给药后接受9Gy全身照射,在照后24小时取小肠组织做免疫组化TUNEL染色检测小肠隐窝细胞原位凋亡。（4）小鼠肠道类器官培养:雄性C57BL/6小鼠取小肠隐窝进行类器官培养,并给予类器官CL429刺激,12小时后给予类器官6.0 Gy照射,照后继续培养类器官7天,对类器官的大小及出芽情况做统计学分析。5.CL429防治辐射损伤作用的初步机制探讨（1）基因敲除小鼠CL429给药并照射后生存期影响:野生型小鼠给药PBS组（WT+PBS）、野生型小鼠给药CL429组（WT+CL429）、NOD2敲除小鼠给药PBS组（NOD2 KO+PBS）、NOD2敲除小鼠给药CL429组（NOD2 KO+CL429）、TLR2敲除小鼠给药PBS组（TLR2 KO+PBS）、TLR2敲除小鼠给药CL429组（TLR2KO+CL429）、TLR2/NOD2双敲小鼠给药PBS组（TLR2/NOD2 DKO+PBS）、TLR2/NOD2双敲小鼠给药CL429组（TLR2/NOD2 DKO+CL429）。照前24小时和照前2小时分两次给药（CL429给药剂量2.5mg/Kg）。接受7.5Gy全身照射后观察照后小鼠30天生存情况。（2）敲低细胞系CL429给药后细胞活力检测:对数生长期的HIEC细胞采用Lipofectamine3000转染试剂盒分别构建si-TLR2、si-NOD2以及si-TLR2+si-NOD2细胞系,CL429给药后接受8Gy照射,采用CCK-8照后24小时检测细胞活力。（3）CL429对TLR2 KO小鼠照后骨髓和小肠组织病理切片HE染色分析:C57BL/6小鼠和TLR2 KO小鼠分为4组:WT+PBS、WT+CL429、TLR2 KO+PBS、TLR2 KO+CL429。照后3.5天分别取小鼠骨髓和小肠组织做病理切片HE染色分析。（4）骨髓细胞TLR2及NOD2成员m RNA表达水平RT-PCR检测:CL429组和PBS对照组雄性C57BL/6小鼠两次给药后取骨髓有核细胞,采用实时荧光定量PCR的方法检测TLRs家族及NODs家族各成员m RNA表达水平。（5）TLR2-MYD88-NF-κB信号通路相关蛋白表达量检测:对数生长期的HIEC细胞给予CL429刺激后,分别在0、2、4、8、12、24小时抽提HIEC细胞的蛋白,通过Western Blot来检测TLR2、NOD2、MYD88、p-IKK等蛋白的表达量水平。（6）辐射防护性细胞因子含量检测:6周龄雄性C57BL/6小鼠CL429给药后接受7.5Gy全身照射后,24小时后取小鼠外周血血清,采用酶联免疫吸附实验定量检测照后小鼠血清中IL-6、IL-11、IL-12以及TNF-α等辐射防护性细胞因子的表达量。（7）RNA测序法鉴定CL429防护辐射损伤中新关键效应分子及其相关的信号通路:6周龄雄性C57BL/6小鼠CL429给药后接受7.5Gy全身照射,照后24小时取小鼠骨髓细胞以及脾脏,照后72小时取小肠组织,液氮速冻后委托上海欧易生物科技有限公司进行RNA质检及测序。分析出与对照组相比CL429组表达差异的基因,筛选出表达差异最大的可能的靶效应分子,并进一步通过热图、reads分布图、KEGG富集通路分析对差异表达基因进行深入分析。（8）潜在效应分子定量PCR验证:C57BL/6小鼠随机分为2组:对照组、CL429组。照前两次给药后接受7.5Gy全身照射,照后24h取骨髓、脾脏、小肠组织抽提m RNA进行定量PCR检测潜在效应分子S100A8、S100A9、Wnt5a、Igf2bp3、Ccl2、Ccl3、Ccl4、Ccnb1、Ccnb2、Ccnd1、Ccne1、Ccne2、Cdk1。（9）小鼠原代骨髓和脾脏细胞给予重组蛋白并照射后细胞活力检测:取C57BL/6小鼠原代骨髓和脾脏细胞分为6组:对照组、CL429组、S100A8组、S100A9组、Wnt5a组、Igf2bp3组（重组蛋白给药浓度50ng/ml）。给药后立即接受7.5Gy照射,照后24h CCK-8检测细胞活力。（10）CL429对S100A9 KO小鼠和野生型小鼠照后生存期的影响:杂合子S100A9KO小鼠和野生型C57BL/6小鼠分为4组（n=6）:WT+PBS组,WT+CL429组,S100A9KO+PBS组,S100A9 KO+CL429组。两次给药后小鼠接受9Gy全身照射,观察照后小鼠30天存活情况。6.对研究结果采用SPSS 19进行数据分析,结果采用mean±SD来表示,判断两组数据之间是否有统计学差异采用t检验。小鼠生存期试验采用Kaplan-Meier生存曲线来比较两组小鼠存活情况的差异,实验数据的作图采用Graph Pad Prism软件进行绘图分析。四、研究结果1.新型双靶向配体CL429的筛选及其对细胞和小鼠的急性毒性效应研究（1）新型双靶向配体CL429的筛选:本课题通过前期文献调研、理论分析并通过HIEC细胞给药后8Gyγ射线照后CCK-8试验检测细胞活力发现,新型TLR2/NOD2双靶向配体CL429组的细胞活力略低于LPS,但是显着高于其它各TLRs家族成员相关靶向配体。（2）CL429细胞急性毒性试验:对数生长期的HIEC细胞中分别加入不同梯度终浓度的CL429后,培养24小时后采用CCK-8法检测细胞活力,发现CL429给药浓度低于400μg/ml时,细胞活力随着CL429给药浓度的提高逐步上升,当给药浓度为800μg/ml时,与400μg/ml组相比细胞活力出现轻微下降但仍然高于空白对照组,到了1600μg/ml组细胞活力出现比较明显的下降但是仍然高于对照组,而3200μg/ml组细胞活力显着下降且低于空白对照组,显示出了CL429的药物毒性。而CL429细胞水平辐射防护的最佳给药浓度为40μg/ml,因此可以认为CL429在此最佳浓度下对细胞是安全的或者是没有明显的毒副作用。（3）CL429小鼠急性毒性试验:通过给药（25mg/kg）后48小时内连续观察小鼠存活情况发现CL429组全部存活,而LPS组小鼠在36小时全部死亡。2.CL429对整体动物的辐射防护效应（1）CL429小鼠辐射防护最佳给药剂量的摸索:通过梯度浓度分两次腹腔注射给药并接受7.5Gy全身照射后连续观察照后30天小鼠存活情况,发现CL429进行小鼠体内辐射防护试验的最佳给药剂量为2.5mg/kg,其给药剂量为前面小鼠急性毒性实验给药量的1/10,因此可以认为CL429在小鼠最佳给药剂量是安全的的或者没有明显的急性毒性作用。（2）CL429与WR2721和LPS辐射防护效果对比:7.5Gy照前预防给药条件下CL429组与LPS组小鼠存活率均为100%,明显好于WR2721组的80%;9Gy照前预防给药条件下CL429组存活率依然是100%,好于LPS组的90%以及WR2721组的70%;7.5Gy照后治疗给药条件下CL429组存活率100%好于LPS组的80%以及WR2721组的60%;9Gy照后治疗给药条件下CL429组存活率显着下降到50%,好于LPS组的30%以及WR2721组的0。（3）CL429与Pam3、MDP以及Pam3+MDP辐射防护效果对比:9Gy照前预防给药条件下CL429组存活率依然是100%,预防效果由高到低依次是:CL429>Pam3+MDP>Pam3>MDP>PBS;9Gy照后治疗给药条件下CL429组存活率显着下降到50%,治疗效果由高到低依次是:CL429>Pam3>Pam3+MDP>PBS>MDP。3.CL429对骨髓造血系统辐射损伤防治效应（1）骨髓HE染色病理分析:与PBS组相比,CL429组在骨髓腔空虚、血窦损伤等方面的损伤明显减轻,骨髓有核细胞计数统计也显示CL429组高于PBS组。（2）小鼠骨髓有核细胞凋亡检测:随着照射剂量的加大,各组骨髓有核细胞的凋亡率都明显升高,但是CL429组的骨髓有核细胞的凋亡率均显着低于PBS组。（3）CL429对小鼠骨髓造血干细胞和祖细胞比例的影响:与PBS对照组相比,CL429给药组无论是造血干细胞还是造血祖细胞的比例都有显着提高。（4）小鼠骨髓移植后脾集落形成单位测定:CL429组小鼠脾结节无论是数量还是体积均明显好于PBS对照组。4.CL429对肠道组织辐射损伤防治效应（1）小肠组织HE染色病理学分析:照前给药9Gy全身照后,PBS对照组与CL429组相比,小肠绒毛数目减少、形态异常、黏膜变薄、隐窝上皮细胞减少,小肠绒毛的长度也明显变短。（2）小肠隐窝免疫组化Ki67细胞增殖检测:照前给药9Gy全身照后,CL429组小肠隐窝阳性细胞率要显着高于PBS对照组。（3）小肠隐窝免疫组化TUNEL染色隐窝细胞原位凋亡检测:照前给药9Gy全身照后,PBS对照组小肠隐窝细胞TUNEL染色阳性细胞数明显多于CL429组。（4）小鼠肠道类器官培养:提取小肠隐窝细胞类器官培养,给予CL429刺激和6.0 Gy照射后,观察发现,与PBS对照组相比,CL429给药组小肠隐窝细胞形成类器官数目以及单个类器官出芽数目更多、体积更大。5.CL429防治辐射损伤作用的初步机制探讨（1）基因敲除小鼠CL429给药并照射后生存期影响:照前两次给药接受7.5Gy全身照射后,各组小鼠存活率由高到低依次是:WT+CL429组100%存活率>NOD2KO+CL429组50%存活率>TLR2 KO+CL429组20%的存活率。（2）HIEC敲低细胞系CL429给药照后细胞活力检测:对数生长期的HIEC细胞采用Lipofectamine3000转染试剂盒分别构建TLR2 KD、NOD2 KD以及TLR2KD+NOD2 KD敲低细胞系,Western Blot结果显示,si RNA敲低后的TLR2和NOD2蛋白表达量均有显着的表达下调,进一步细胞给药后接受8Gy照射并通过细胞活力检测结果发现（与PBS对照组相比）:si-NC组>si-NOD2组>si-TLR2组>si-TLR2+si-NOD2组。（3）CL429对TLR2 KO小鼠照后骨髓和小肠组织病理切片HE染色分析:与PBS照射组相比,CL429能够有效减轻野生型和TLR2 KO小鼠骨髓和小肠辐射损伤;在CL429给药组内部,野生型小鼠骨髓和小肠辐射损伤减轻程度要好于TLR2 KO小鼠。（4）骨髓细胞中TLR2及NOD2成员m RNA表达水平RT-PCR检测:与PBS对照组相比,CL429能够显着上调TLR4、7,8,11和13的m RNA水平,但是TLR2和NOD2的m RNA水平没有明显上调,甚至略有下调。（5）TLR2-My D88-NF-κB信号通路相关蛋白表达量检测:采用蛋白印迹实验方法检测蛋白表达量,结果发现:CL429刺激照射后TLR2、NOD2以及MYD88等蛋白表达量均先出现明显的表达上调,然后随着时间推移表达量慢慢降低,而p-IKK没有出现上调,它的表达量随着时间推移一直慢慢降低。（6）辐射防护性细胞因子含量检测:小鼠照后24小时取血清采用ELISA法定量检测4种辐射防护性细胞因子表达量,与空白对照组相比,给予PBS+照射组中IL-6和TNF-α这两种细胞因子的表达量有一定程度的下调,IL-11和IL-12则出现一定程度的上调;在CL429给药照射组中IL-6、IL-11、IL-12以及TNFα表达量都出现了显着的上调。（7）RNA测序法鉴定CL429防护辐射损伤中新关键效应分子及其相关的信号通路:6周龄雄性C57BL/6小鼠CL429给药后接受7.5Gy全身照射,照后24小时取小鼠骨髓细胞以及脾脏,照后72小时取小肠组织,液氮速冻后委托上海欧易生物科技有限公司进行RNA质检及测序。分析出与对照组相比CL429组表达差异的基因,筛选出表达差异最大的可能的靶效应分子,并进一步通过热图、reads分布图、GO和KEGG富集通路分析对差异表达基因进行深入分析。（8）潜在效应分子定量PCR验证:通过对RNA测序筛选出的CL429辐射损伤防护潜在效应分子S100A8、S100A9、Wnt5a、Igf2bp3、Ccl2、Ccl3、Ccl4、Ccnb1、Ccnb2、Ccnd1、Ccne1、Ccne2、Cdk1进行定量PCR验证,进一步筛选出上调倍数较大且稳定的四个分子S100A8、S100A9、Wnt5a、Igf2bp3。（9）小鼠原代骨髓和脾脏细胞给予重组蛋白并照射后细胞活力检测:通过CCK-8检测重组蛋白S100A8、S100A9、Wnt5a、Igf2bp3对小鼠原代骨髓和脾脏细胞照射后细胞活力发现:在骨髓原代细胞里细胞活力:S100A9>CL429>Wnt5a>S100A8>Igf2bp3>con;在脾脏原代细胞里细胞活力:CL429>S100A9>S100A8>Wnt5a>Igf2bp3>con。（10）CL429对S100A9 KO小鼠和野生型小鼠照后生存期的影响:观察小鼠照后30天生存曲线可以看出与S100A9 KO+PBS组相比,给予CL429后S100A9 KO小鼠存活率和存活时间有一定程度提高,CL429能够部分挽救S100A9 KO小鼠的辐射损伤,但是CL429对S100A9 KO小鼠的辐射防护效应远低于野生型小鼠。五、研究结论我们首先从一众TLRs和NODs家族配体中成功筛选到新型TLR2/NOD2双靶向配体,从整体动物和细胞水平确认其毒性水平显着小于LPS和WR2721,但是无论其预防还是治疗效果均好于LPS、WR2721以及TLR2配体Pam3、NOD配体MDP以及Pam3+MDP联合使用,这为CL429成为潜在的高效低毒的辐射防护剂奠定了坚实的基础。然后从辐射敏感的骨髓造血组织和小肠组织的组织器官水平证实CL429的辐射防护效应,CL429能够缓解骨髓腔空虚、血窦损伤,抑制骨髓有核细胞凋亡,促进造血干/祖细胞的增殖与分化,对骨髓造血组织辐射损伤后的恢复重建具有积极的促进作用;对于小肠组织CL429能够减缓辐射引起的小肠绒毛断裂变短和数目减少、形态异常改变、黏膜变薄以及隐窝上皮细胞的减少,促进小肠隐窝细胞的增殖,抑制小肠隐窝细胞的凋亡,通过小肠类器官培养也证实CL429能够有效促进小肠隐窝细胞形成肠道类器官及其进一步的增殖与分化。最后我们从不同角度来探讨CL429防护电离辐射损伤的初步作用机制。首先分别从整体动物水平和体外细胞水平证实CL429防治辐射损伤可能主要依赖于TLR2,部分依赖于NOD2。照后TLR2和NOD2的m RNA表达量并没有被照前给药CL429上调,这证明了CL429可能并不是通过在转录水平来激活TLR2和NOD2的活性。进一步通过检测经典的TLR2-My D88-NF-κB信号通路相关蛋白表达量的变化,发现TLR2、NOD2以及My D88均先出现明显的表达上调,而p-IKK没有出现上调。这提示我们CL429可能通过激活TLR2-My D88-NF-κB信号通路发挥辐射损伤防护作用。通过对照后小鼠血清细胞因子的检测发现CL429能够显着上调IL-6、IL-11、IL-12以及TNFα等辐射防护性细胞因子。综合来看,CL429发挥辐射损伤防护效应主要依赖TLR2,部分依赖NOD2,它通过TLR2-My D88-NF-κB信号通路并上调IL-6、IL-11、IL-12以及TNFα等辐射防护性细胞因子发挥辐射损伤防护效应。接下来我们通过RNA测序筛选出相关的信号通路TLR2和NOD2信号通路,这说明CL429发挥辐射损伤防护作用与这两条信号通路密切相关;同时筛选出潜在关键分子,通过小鼠骨髓、脾脏及小肠定量PCR验证以及关键分子重组蛋白给药后小鼠原代骨髓和脾脏细胞活力检测成功锁定1个关键分子S100A9,最后通过S100A9基因敲除小鼠生存期试验证实S100A9在CL429发挥辐射损伤防护效应中起到了重要作用。综上所述,我们证明了CL429发挥辐射损伤防护效应部分依赖NOD2,主要依赖TLR2通过TLR2-My D88-NF-κB信号通路并上调IL-6、IL-11、IL-12以及TNFα等辐射防护性细胞因子发挥辐射损伤防护效应。同时我们也成功锁定并证实S100A9在CL429发挥辐射损伤防护效应中起到了重要作用,为辐射损伤防治研究提供了新的研究思路和干预途径。
李娜[5]（2021）在《滨蒿内酯通过PI3K/Akt信号通路对胰腺癌的抑制作用及相关机制的研究》文中进行了进一步梳理目的:胰腺癌是一种起病隐匿、早期诊断困难、进展迅速、治疗效果不佳、中位生存时间短、预后极差的恶性肿瘤。只有15-20%的患者有手术切除的机会,但高的转移倾向及术后复发率限制了手术的效果。吉西他滨等化疗药物能有效改善胰腺癌患者的预后,但耐药的出现降低了药物的疗效,此外需面对化疗的毒副作用和昂贵费用等问题。因此发展新的抗肿瘤治疗方法成为必然。近年来,天然产物因其活性物质结构新颖、抗肿瘤活性高,多靶点,毒性小而成为研究热点,既往研究表明天然产物可以通过多种途径调控肿瘤细胞增殖、自噬、凋亡、侵袭和转移、耐药,并调控胰腺干细胞的活性。滨蒿内酯是一种苯丙素类的天然产物,具有广泛药理学特性,因其抗肿瘤的活性而备受关注。研究表明滨蒿内酯在喉癌、白血病及前列腺癌中具有抗肿瘤的作用,但在胰腺癌中的作用及其可能的分子机制尚不清楚。近年来,生物信息学发展迅速,尤其是在肿瘤研究中,通过计算机、信息学技术的运用,收集、整理并分析大量的肿瘤数据,构建不同功能的数据库丰富肿瘤研究的方法。本研究通过结合生物信息学及肿瘤基础研究手段,探讨滨蒿内酯在胰腺癌中的抗肿瘤作用及可能的作用机制。研究方法:利用PubChem、SwissTargetPrediction、STITCH、Gene Cards、CTD、STRING、WebGestalt、Cytoscape等生物信息学数据库及分析平台确定滨蒿内酯作用于胰腺癌可能介导的信号通路及关键基因。进行体外细胞实验验证滨蒿内酯对胰腺癌细胞的作用,通过CCK8实验获得滨蒿内酯在胰腺癌细胞系的IC50值,检测其对胰腺癌细胞增殖的影响,划痕实验检测对胰腺癌细胞迁移的影响,Transwell实验检测对胰腺癌细胞迁移及侵袭的影响,流式细胞术检测对胰腺癌细胞凋亡及细胞周期的影响,并通过western blot实验检测转移相关蛋白MMP9,凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3及PI3K/Akt信号通路相关分子的表达变化;然后通过裸鼠移植瘤及免疫组化实验检测滨蒿内酯在体内对胰腺癌增殖的影响;综合观察滨蒿内酯不同情况下对胰腺癌细胞各生物学行为的影响。最后应用Akt的通路激活剂SC79做回复实验,通过CCK8实验检测对胰腺癌细胞增殖的影响,划痕实验检测对胰腺癌细胞迁移的影响,Transwell实验检测对胰腺癌细胞迁移及侵袭的影响,流式细胞术检测对胰腺癌细胞凋亡及细胞周期的影响,并通过western blot实验检测转移相关蛋白MMP9,凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3及PI3K/Akt信号通路相关分子表达的影响,进一步确认信号通路在滨蒿内酯抗胰腺癌中的作用。结果:1.通过数据库获得113个滨蒿内酯的药物靶点,4719个胰腺癌的疾病靶点,两者取交集,共获得83个滨蒿内酯治疗胰腺癌的药效靶点。2.滨蒿内酯可能参与的与肿瘤相关的信号通路分别为MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路、pathways in cancer、TNF信号通路,共涉及34个靶点,其中2个靶点IKBKB、Akt1同时参与4条通路,9个靶点FLT4、EGFR、IGF1R、MET、PDGFRB、ERBB2、MAPK8、MAPK10及RPS6KA5参与了3条通路。3.通过Cytoscape软件可视化蛋白-蛋白互作网络,Degree排名前5的靶点分别为Akt1、SRC、HSP90AA1、MAPK8、EGFR、PTGS2（其中EGFR与PTGS2并列第5）,与信号通路相关的靶点取交集,滨蒿内酯治疗胰腺癌的候选关键基因最可能为Akt1,其次为MAPK8和EGFR。4.Akt1及MAPK8在胰腺癌组织和正常胰腺组织之间具有表达差异,且差异有统计学意义,而EGFR无统计学的表达差异,推测滨蒿内酯抗胰腺癌的作用最可能是通过抑制Akt1的表达而实现的,其次是MAPK8。5.滨蒿内酯在Capan-2及SW1990细胞中IC50值分别为225.2μM及209.1μM;经100、200、400μM滨蒿内酯处理细胞,与Control组对比,滨蒿内酯明显抑制胰腺癌细胞增殖、迁移及侵袭,诱导细胞周期停滞及凋亡,具有剂量依赖性,统计学差异明显。6.滨蒿内酯100、200、400μM与Control组对比,转移相关蛋白MMP9及抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调,促凋亡蛋白Bax及cleaved caspase-3表达上调,具有统计学意义。7.通过qRT-PCR实验证实滨蒿内酯抑制Akt1表达,但不抑制MAPK8表达,滨蒿内酯最可能通过Akt1起到抗肿瘤的作用。8.滨蒿内酯100、200、400μM与Control组对比,不降低总PI3K及总Akt的表达,但显着抑制p-Akt的表达。9.在体内裸鼠移植瘤实验中,滨蒿内酯抑制移植瘤生长,显着降低移植瘤的体积及重量,且降低增殖相关蛋白Ki65及PCNA的表达。10.SC79可逆转滨蒿内酯对胰腺癌细胞增殖、迁移及侵袭的抑制作用,并阻断对细胞周期停滞及凋亡的诱导作用。11.SC79可逆转滨蒿内酯对胰腺癌转移相关蛋白MMP9及抗凋亡蛋白Bcl-2的抑制作用、促凋亡蛋白Bax及cleaved caspase-3的促进作用。12.SC79可以阻断滨蒿内酯对p-Akt的抑制作用。结论:1.通过网络生物信息学数据库及分析平台获得滨蒿内酯作用于胰腺癌的候选关键基因,并经qRT-PCR实验确定Akt1为滨蒿内酯抗胰腺癌的关键基因。2.体外细胞实验显示滨蒿内酯显着抑制胰腺癌细胞增殖、迁移及侵袭,引起细胞周期停滞及诱导凋亡,下调转移相关蛋白MMP9及抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,上调促凋亡蛋白Bax及cleaved caspase-3的表达;体内动物实验证实滨蒿内酯显着抑制移植瘤生长。3.滨蒿内酯可能通过PI3K/Akt信号通路抑制胰腺癌细胞增殖、转移及侵袭,并诱导细胞周期停滞及细胞凋亡。4.PI3K/Akt通路激活剂SC79,可以阻断滨蒿内酯对胰腺癌的抑制作用。
陈晨[6]（2021）在《溃疡性结肠炎“以痈论治”策略的临床疗效及机制研究》文中认为目 的:首先,通过理论研究,总结姜树民教授“以痈论治”UC的学术思想及经验。然后,通过临床试验,观察消痈止痢汤治疗活动期大肠湿热型UC患者的有效性及安全性。最后,通过动物实验,分析消痈止痢汤疗效的可能作用机制。为“以痈论治”UC提供新的治疗思路和科学依据。资料与方法:首先,通过理论研究,梳理姜树民教授“以痈论治”UC学术思想的师脉传承,总结姜师对UC祖国传统医学病因、病机的认识,挖掘其对本病的治疗特色及经验,并对消痈止痢汤的配伍特点、组方原则、方药功效进行分析。其次,通过临床研究,对符合纳入标准的48例UC患者,随机分为对照组和治疗组,对照组予美沙拉嗪缓释颗粒治疗,治疗组在此基础上联合消痈止痢汤颗粒剂治疗,疗程为2个月,疗程结束后对两组患者的临床疗效、中医证候疗效、中医主要证候总积分、改良Mayo评分、Baron内镜评分、IBDQ评分及血常规、肝肾功等安全性指标进行评价。最后,通过动物实验研究,先将51只SD大鼠随机分为空白组和造模组,对造模大鼠通过自由饮用4%DSS溶液,7天建立UC大鼠模型。造模成功后,再将造模大鼠随机分为模型组、消痈止痢汤低、中、高剂量组和柳氮磺吡啶组,并将全部大鼠连续7天灌胃治疗,空白组与模型组灌等量的生理盐水,中药组及西药组分别灌不同浓度的消痈止痢汤水煎液和柳氮磺吡啶混悬液。实验期间,每天观察大鼠的一般状态、体质量、便潜血等情况。疗程后,对大鼠麻醉、取材,腹主动脉取血,分离结肠组织。最后,观察各组大鼠的一般状态、体质量、结肠长度、DAI评分的变化情况;观察病理下组织形态,并对组织学评分;ELISA法对血清中IL-1β、IL-6、TNF-α和MPO含量进行检测;免疫组化法对结肠组织中磷酸化的ERK、JNK、p38MAPK、NF-κ Bp65蛋白进行检测,并测定平均光密度值;Western blot法对结肠组织中ERK、JNK、p38MAPK、NF-κ Bp65蛋白及磷酸化蛋白检测,并测定灰度值。结果:一 理论研究姜树民教授认为UC“脾虚为发病之本”,“湿热、毒、瘀”为关键病理因素,“毒热致痈”为发病特点,认为UC的病机为:湿热壅滞,凝滞气血,热极成毒,浊毒相互胶结,下结肠腑,脂络受损,血肉腐败,酿化成痈。临证善用托法,采用“消痈去腐”的治疗原则,创立“消痈止痢汤”。二 临床研究1.临床疗效比较:治疗组总有效率90.9%,对照组78.3%,治疗组高于对照组,但无统计学差异（P>0.05）。2.中医证候疗效比较:治疗组总有效率高于对照组（P<0.05）。3.中医主要证候总积分比较:两组中医证候积分较治疗前比较,均下降（P<0.05）;且治疗组积分低于对照组（P<0.05）。4.改良Mayo评分比较:两组较治疗前比较,Mayo评分均下降（P<0.05）;且治疗组评分低于对照组（P<0.05）。5.Baron内镜评分比较:两组较治疗前比较,Baron内镜评分均下降（P<0.05）;且治疗组评分低于对照组（P<0.05）。6.IBDQ评分比较:经过治疗,两组较治疗前比较,IBDQ评分均升高（P<0.05）;且治疗组评分高于对照组（P<0.05）。7.安全性指标检测:两组患者在疗程后,血常规、肝肾功检测均正常,全部病例未出现不良反应。三 实验研究1.UC模型成功的复制①大鼠在造模期间,从第3天便隐血试验开始呈现阳性（+）;从第4-5天逐渐出现体质量下降、大便变稀,便隐血试验呈强阳性（+++）;从第6-7天开始,大便中混有鲜血。②结肠组织肉眼和病理学观察结果:肉眼可见结肠黏膜表面充血、糜烂,距肛门口4-6cm处最为明显;病理下可见黏膜上皮破坏明显、隐窝结构消失、杯状细胞大量减少、黏膜层及下层大量炎性细胞浸润。2.消痈止痢汤对UC大鼠一般状态变化的影响疗程后,空白组大鼠状态活跃、皮毛光泽、进食正常、大便正常。与空白组相比,模型组大鼠皮毛缺乏光泽,食量下降,活动量减少,精神萎靡,大便中混有鲜血。与模型组比较,各剂量中药组及西药组对大鼠的一般状态均有不同程度的改善。3.消痈止痢汤对UC大鼠体质量变化的影响实验期间内,空白组大鼠体质量逐渐增加,并在实验第14天达到最大值;而模型组大鼠从第3天开始,体质量逐渐下降,在实验第14天下降到最低值,与空白组比较有统计学差异（P<0.01）;各剂量中药组及西药组,在第1周时间内,体质量下降程度同模型组相同（P>0.05）;实验结束后,各中药剂量组及西药组大鼠的体质量同模型组比较均增加（均P<0.01）。4.消痈止痢汤对UC大鼠DAI评分变化的影响与空白组比较,模型组DAI评分显着增高（P<0.01）;与模型组比较,各剂量中药组和西药组评分均降低（P<0.05,P<0.01）。5.消痈止痢汤对UC大鼠结肠长度变化的影响与空白组比较,模型组结肠显着缩短（P<0.01）,与模型组比较,各剂量中药组及西药组显着变长（P<0.01）。6.消痈止痢汤对UC大鼠组织病理学变化的影响①显微镜下:空白组,大鼠结肠黏膜表面组织完整,隐窝结构正常,排列规整,可见大量杯状细胞,无炎性细胞浸润;模型组,黏膜上皮损伤严重,隐窝结构消失,杯状细胞大量减少,组织中大量炎性细胞浸润;与模型组比较,高剂量组和西药组黏膜上皮完整,隐窝结构排列规则,杯状细胞明显增多,少量炎性细胞浸润;中剂量组黏膜上皮较完整,隐窝结构排列欠规则,可见隐窝萎缩、分支,炎症细胞浸润减轻;低剂量组,黏膜上皮完整性略有改善,炎性细胞浸润略有减轻,隐窝结构仍破损明显。②病理组织学评分:与空白组比较,模型组评分明显增加（P<0.01）;与模型组比较,各剂量中药组和西药组均明显降低（P<0.05,P<0.01）。7.消痈止痢汤对大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α和MPO含量的影响与空白组比较,模型组血清中IL-1β、IL-6、TNF-α和MPO含量明显升高（P<0.01）;与模型组比较,各剂量中药组及西药组血清中IL-1β、IL-6、TNF-α和MPO含量明显降低（P<0.05,P<0.01）。8.免疫组化法对组织中磷酸化的ERK、JNK、p38MAPK、NF-κ Bp65蛋白含量进行检测①光镜下结果:p-ERK、p-JNK、p-p38MAPK、p-NF-κ Bp65蛋白主要表达于细胞浆,在结肠黏膜层和黏膜下层均有不用程度的表达,均呈棕色或棕黄色。②p-ERK含量:与空白组比较,模型组显着升高（P<0.01）;与模型组比较,各剂量中药组及西药组显着降低（P<0.05,P<0.01）。③p-JNK含量:与空白组比较,模型组显着升高（P<0.01）;与模型组比较,中剂量、高剂量组、西药组显着降低（P<0.01）,低剂量组无差异（P>0.05）。④p-p38含量:与空白组比较,模型组显着升高（P<0.01）;与模型组比较,中剂量、高剂量组、西药组显着降低（P<0.01）,低剂量组无差异（P>0.05）。⑤p-NF-κ Bp65含量:与空白组比较,模型组显着升高（P<0.01）;与模型组相比,各剂量中药组及西药组显着降低（均P<0.01）。9.Western blot对大鼠结肠组织中ERK、JNK、p38MAPK、NF-κ Bp65及磷酸化蛋白检测与空白组比较,模型组大鼠结肠组织中ERK、JNK、p38MAPK、NF-κ Bp65及其磷酸化的蛋白水平显着升高（P<0.01）。与模型组比较,除了低剂量组在p-JNK蛋白含量上与模型组无明显差异外（P>0.05）,各不同剂量中药组及西药组大鼠结肠组织中ERK、JNK、p38MAPK、NF-κ Bp65及其磷酸化蛋白水平显着降低（P<0.05,P<0.01）。结 论:1.姜树民教授“以痈论治”UC理论渊源明确、学术特色鲜明,创立“消痈止痢汤”,为临床治疗本病提供新的治疗思路。2.消痈止痢汤联合西药,与单纯西药对比,可明显提高活动期大肠湿热型轻中度UC患者的中医证候疗效、降低中医主要证候总积分、改善主要临床症状、降低内镜下黏膜评分、促进肠道黏膜溃疡的愈合以及提高患者的生存质量。3.在临床试验中,患者各安全性指标未出现变化、未出现不良反应,消痈止痢汤安全有效,无毒副作用,可在临床上推广。4.消痈止痢汤对DSS诱导的UC模型大鼠的一般状态有明显改善作用,并可抑制结肠黏膜组织病理学损伤。5.UC模型大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α炎性细胞因子和MPO的含量明显增高,且其含量水平与疾病严重程度呈正相关。6.消痈止痢汤能通过抑制UC模型大鼠血清中L-1 β、IL-6、TNF-α炎性细胞因子和MPO的含量,来改善肠道炎症反应、降低黏膜组织损伤。7.消痈止痢汤治疗UC模型大鼠的作用机制,可能是通过抑制MAPK信号通路的活化,下调NF-κB转录因子的表达,阻止NF-κB的核移位,降低促炎性细胞因子的转录和释放,从而发挥抗炎疗效。
张亮[7]（2021）在《线性泛素化信号通路调控胃癌恶性进展的机制研究》文中指出胃癌是一种致命的肿瘤疾病,在全世界范围内的总体生存率都较低,严重威胁着人类的健康。目前,胃癌是世界第五大癌症类型,已被确定为全球癌症死亡相关的主要原因之一。胃癌的发生是由宿主遗传、环境因素（如吸烟、饮酒、高盐等）和微生物因素（如幽门螺杆菌）等复杂相互作用的结果。这些现状表明,深入研究胃癌发生发展的分子机制对于胃癌的临床改善和预后具有重要意义。蛋白泛素化修饰参与调节多种细胞功能,包括靶向蛋白的降解、蛋白的膜转运、DNA损伤修复、信号转导等。线性泛素链作为近年来新发现的一种泛素链接方式,主要由泛素连接酶复合体（linear ubiquitin chain assembly complex,LUBAC）催化合成和去泛素化酶OTULIN特异性水解,处于两者共同调节的动态过程中。LUBAC复合体是目前已知的唯一能够催化合成线性泛素链的泛素连接酶。它主要由HOIP（HOIL1-interacting protein）,SHARPIN（SHANK associated RH domain-interacting protein）和HOIL1L（haem-oxidized IRP2 ubiquitin ligase 1L）三个分子组成。HOIP是LUBAC复合体的酶催化核心,SHARPIN和HOIL1对于HOIP的激活具有关键作用。已有研究表明,线性泛素化修饰可发生在NEMO、TNFR1和RIPK1等底物中,通过调节NF-κB和Wnt/β-catenin等信号通路,对固有免疫、炎症反应和血管生成等具有重要的作用。但是在肿瘤的发生发展中,线性泛素化修饰对胃癌生物学行为的影响目前尚不清楚。因此,从线性泛素化相关的蛋白入手,研究线性泛素化修饰如何调节胃癌的生物学行为,有助于揭示胃癌发生发展的新机制,具有重要的理论意义及潜在临床价值。有鉴于此,本文主要分两部分,分别研究了线性泛素化相关蛋白OTULIN及SHARPIN对胃癌恶性生物学行为的影响和机制。本文的研究内容和主要结果结论如下:第一部分去泛素化酶OTULIN对胃癌恶性生物学行为的影响及机制研究一、去泛素化酶OTULIN在胃癌组织中呈高表达1.去泛素化酶OTULIN在多个数据库的胃癌中表达增高;2.去泛素化酶OTULIN在胃癌组织中表达明显高于癌旁组织;二、去泛素化酶OTULIN对胃癌细胞增殖以及迁移和侵袭能力的影响1.去泛素化酶OTULIN促进胃癌细胞的增殖和成瘤;2.去泛素化酶OTULIN促进胃癌细胞的侵袭和迁移;3.OTULIN促胃癌细胞迁移侵袭依赖于其去泛素酶活性;三、识别与鉴定线性泛素化修饰的底物蛋白RACK11.Pull-down实验结合质谱分析,筛选出底物蛋白RACK1;2.免疫共沉淀实验证明RACK1蛋白存在线性泛素化修饰;四、OTULIN与RACK1相互作用,并与黏着斑激酶FAK形成复合体1.免疫荧光实验证实OTULIN和RACK1存在共定位;2.免疫共沉淀实验证明OTULIN、RACK1和FAK形成复合体;五、OTULIN调节RACK1对FAK的招募,影响胃癌细胞的粘附运动1.敲除OTULIN能够抑制FAK的磷酸化水平;2.OTLUIN能够促进RACK1对FAK的招募;3.OTULIN敲除的胃癌细胞粘附运动能力下降;第二部分SHARPIN对胃癌恶性生物学行为的影响及机制研究一、SHARPIN通过不依赖于线性泛素化的方式调节Wnt/β-catenin信号通路1.LUBAC和OTULIN参与Wnt/β-catenin信号通路的调节;2.SHARPIN与β-catenin相互作用参与Wnt/β-catenin信号通路的调节;二、SHARPIN促进胃癌的恶性生物学行为1.SHARPIN促进胃癌细胞的增殖、克隆形成和迁移侵袭;2.SHARPIN促进胃癌细胞皮下移植瘤的生长;三、SHARPIN通过与β-Trcp1竞争性结合β-catenin,而抑制β-catenin的泛素蛋白酶体降解1.SHARPIN抑制β-catenin的泛素化降解;2.SHARPIN与β-Trcp1竞争性结合β-catenin;3.SHARPIN与β-Trcp1可能竞争性结合β-catenin上的相同位点;四、过表达β-catenin回复SHARPIN敲低引起的胃癌细胞增殖抑制1.过表达β-catenin回复SHARPIN敲低导致的胃癌细胞增殖、克隆形成和迁移侵袭表型;2.过表达β-catenin回复SHARPIN敲低导致的皮下移植瘤的增殖抑制;五、SHARPIN在胃癌组织中高表达且提示预后不良,并与β-catenin表达呈正相关1.SHARPIN在胃癌组织中的表达明显高于癌旁组织;2.SHARPIN高表达的胃癌患者总生存期短,预后较差;3.胃癌组织中SHARPIN表达与β-catenin表达呈显着正相关;本研究的主要结论为:1.去线性泛素化酶OTULIN能够通过去除RACK1蛋白的线性泛素化修饰,增强RACK1与黏着斑激酶FAK的相互作用,进而促进胃癌的增殖和转移播散。2.线性泛素化相关蛋白SHARPIN通过与β-Trcp1竞争性结合β-catenin上的相同位点,从而抑制了β-Trcp1泛素化降解β-catenin,稳定其表达和向细胞核转位,促进下游癌基因c-myc、CD44等基因的表达,进而促进肿瘤的发生发展。本研究首次报道了线性泛素相关蛋白OTULIN和SHARPIN对胃癌恶性生物学行为的影响。我们发现了线性泛素化修饰的新底物蛋白RACK1,并初步阐明了去泛素化酶OTULIN通过调节RACK1影响胃癌细胞增殖和转移播散的分子机制,为研究线性泛素化修饰在肿瘤中的作用提供了新的理论基础。另外,我们也发现SHARPIN通过不依赖于线性泛素化修饰的方式调节Wnt/β-catenin信号通路的活性,从而促进胃癌的发生发展,揭示了SHARPIN的一种新功能和调节β-catenin的新方式。这些研究为探索胃癌发生发展的分子机制提供了新的研究方向,并可能成为潜在的改善胃癌患者治疗和预后的策略。
李淅埙[8]（2021）在《基于NF-κB信号通路探究清肺口服液黄酮类成分抗RSV的效应机制》文中研究说明目的:通过观察感染RSV后小鼠肺组织的病理改变及核转录因子（NF-κB）信号通路中IKKα、IκBα、p65蛋白表达水平情况,探讨清肺口服液中黄酮类有效成分在治疗RSV肺炎小鼠的作用机制与量效关系。方法:本实验对50只BALB/c小鼠进行随机分组,共设定五组:正常组、模型组、高剂量黄酮组、低剂量黄酮组和利巴韦林组。正常组给予生理盐水,其余四组采用滴鼻感染RSV,病毒浓度为104/50ul。随后对药物组分别使用配制:高剂量黄酮组120mg/kg/d、低剂量黄酮组40mg/kg/d、利巴韦林组配制给药浓度50mg/kg/d,给药持续4天。观察各组小鼠表现,在治疗后第4天处死小鼠,取肺组织制作切片观察炎症变化、使用酶联免疫吸附法（ELISA）测定检测小鼠肺组织中血清IL-6含量、聚合酶链式反应（PCR）、免疫组化法（IHC）、免疫印迹法（WB）测定NF-κB信号通路中IKKα、IκBα、p65三组蛋白的表达水平。结果:与正常组相比,模型组NF-κB信号通路中IKKα、IκBα、p65蛋白表达量明显升高（P<0.05）、mRNA趋势上升（P<0.05）,皆与炎症反应的特点相符;参照模型组,药物组高低剂量黄酮组与西药利巴韦林组血清IL-6指数降低（P<0.05）、各组指标蛋白水平趋势下降（P<0.05）,高低剂量黄酮组之间无显着量效差异。结论:清肺口服液黄酮类成分与利巴韦林相比有着相近或更好的疗效,可能与清肺口服液中黄酮类成分进入机体后,起到干预疾病的病变过程,通过影响NF-κB信号通路的调节、降低NF-κB蛋白表达量,有效减少机体细胞因子的合成与释放,改善小鼠肺组织中的炎症反应,达到减轻肺组织结构功能损伤的治疗效果。
农安娜[9]（2021）在《TLR9乙酰化修饰在脓毒血症中的免疫调节及其机制研究》文中认为目的:探究乙酰化修饰对天然免疫toll like receptor 9（TLR9）信号通路的调节机制,评估TLR9乙酰化修饰与脓毒血症进展之间的关系,阐明TLR9乙酰化修饰影响脓毒血症的作用机制,为脓毒血症的诊断和防治提供一个新的靶点。方法:（1）用乙酰化抗体结合质谱确定TLR9乙酰化修饰位点:在小鼠单核巨噬细胞Raw264.7中,用免疫沉淀（immunoprecipitation,IP）结合免疫印迹（western blot,WB）技术证明TLR9发生乙酰化修饰。在人胚肾细胞293T中,将HA-TLR9质粒与乙酰化转移酶HA-CBP质粒共转染,用IP结合WB（应用泛乙酰化抗体）技术验证TLR9乙酰化修饰,并用质谱鉴定TLR9的乙酰化修饰位点;（2）在Raw264.7细胞中下调CBP表达后用TLR9配体ODN处理与不处理,再用免疫荧光（immunofluorescence,IF）技术检测TLR9乙酰化修饰对转录因子NF-κB进入细胞核的影响;（3）在293T细胞中过表达TLR9和TIRAP,分别加去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A（trichostatin A,TSA）、尼克酰胺（又名烟酰胺,niconictinamide,NAM）刺激细胞,经免疫共沉淀（co-immunoprecipitation,Co IP）后做WB分析两者的相互作用;（4）在293T细胞中过表达TLR9和CBP后分别用ODN处理与不处理,应用报告基因技术检测NF-κB的反应元件活性,用酶联免疫吸附测定技术（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）和实时荧光定量PCR（RT-q PCR）检测炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β的产生;（5）用ODN处理BALB/c小鼠构建脓毒血症模型,应用免疫组化技术（immunocytochemistry,IHC）检测以上小鼠肺组织TLR9乙酰化及炎症因子水平,并进行分析比较。结果:（1）质谱鉴定结果表明TLR9分子上存在7个赖氨酸（Lysine,K）乙酰化位点;（2）ODN刺激可促进CBP出核并与TLR9相互作用;（3）下调CBP表达后,TLR9乙酰化水平显着降低;（4）CBP介导TLR9发生乙酰化修饰;（5）ODN诱导CBP和TLR9发生相互作用;（6）TSA或NAM促进TLR9和TIRAP发生相互作用;（7）下调CBP表达后,ODN诱导NF-κB进入细胞核减少;（8）过表达CBP增强NF-κB反应元件活性;（9）过表达CBP增加TLR9信号通路终产物TNF-α、IL-6、IL-1β的产生;（10）动物实验证实TLR9乙酰化修饰增加炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β的产生。结论:（1）ODN诱导CBP出细胞核与TLR9发生相互作用,并介导TLR9在第348、361、381、472、475、489及657位K发生乙酰化修饰;（2）乙酰化修饰增强TLR9信号通路,增加炎症因子的产生,促进脓毒血症的进展。
吕洁瑜[10]（2021）在《过表达HOXC11通过调控PPAE-γ和NF-κB通路促进头颈部鳞癌增殖和侵袭的研究》文中进行了进一步梳理研究背景同源盒（Homeobox,HOX）基因家族的异常表达常见于多种恶性肿瘤中,已有研究显示,HOXC11在多种肿瘤中异常高表达并参与了癌细胞的恶性生物学行为,被认为是一个具有潜在临床诊断价值的生物标志物。然而,HOXC11在头颈部鳞癌的表达及与临床的相关性依然不清,其是否参与头颈部鳞癌的恶性生物学行为以及具体的调控机制也有待研究。研究目的（1）观察HOXC11在头颈部鳞癌组织中的表达情况,分析HOXC11的表达与患者临床病理及预后的相关性。（2）探索HOXC11对头颈部鳞癌细胞体内与体外恶性生物学特征的影响。（3）阐明HOXC11参与头颈部鳞癌恶性生物学行为的相关分子机制。研究内容与方法（1）HOXC11在头颈部鳞癌的表达及其临床意义结合肿瘤基因组图谱（TCGA）的数据,利用实时荧光定量PCR、免疫蛋白印迹、免疫组织化学等方法,检测HOXC11在头颈部鳞癌组织中RNA和蛋白的表达情况,分析HOXC11的表达与患者临床病理及预后的相关性。（2）沉默HOXC11对头颈鳞癌细胞恶性生物学行为的影响利用shRNA技术在HOXC11高表达的头颈部鳞癌细胞（SCC15和SCC152）中,构建稳定沉默HOXC11的细胞模型。通过CCK-8实验、克隆形成实验、Transwell侵袭实验、软琼脂克隆形成实验和裸鼠皮下移植成瘤实验,观察HOXC11对头颈部鳞癌细胞的增殖、侵袭和成瘤性等恶性生物学特征的影响。（3）沉默HOXC11对头颈部鳞癌细胞信号通路的影响利用双荧光素酶报告基因实验、免疫印迹实验和实时荧光定量PCR等技术,观察在头颈肿瘤鳞癌细胞中,沉默HOXC11后对NF-κB通路和PPAR-γ通路的影响。同时,利用临床样本的免疫组化检测及分析,验证HOXC11、PPAR-y和NF-κB在临床组织中的表达情况及其相关性。研究结果（1）相对于良性病变或癌旁正常对照组织,头颈部鳞癌组织中HOXC11的mRNA和蛋白水平都显着高表达,且表达水平随T分期上升而上调;预后分析显示,HOXC11的高表达与患者预后差相关,癌组织中高表达HOXC11的患者更容易复发。（2）沉默HOXC11后,头颈部鳞癌细胞（SCC15和SCC152）体外的增殖、侵袭和非锚定生长能力都显着受到抑制;且体内实验显示,沉默SCC15细胞能显着抑制皮下瘤的生长和对周围组织的侵袭。（3）在头颈部鳞癌细胞中,沉默HOXC11能显着抑制NF-κB通路并激活PPAR-γ通路,并影响下游增殖和侵袭相关基因的表达;且头颈部鳞癌组织中,HOXC11的表达与PPAR-y的表达负相关而与p65的核定位水平正相关。研究结论HOXC11在头颈部鳞癌中高表达,并与患者复发及预后较差相关,是预判头颈部鳞癌患者预后的潜在生物标志物。沉默HOXC11能影响NF-κB通路和PPAR-γ通路,抑制头颈部鳞癌细胞增殖、侵袭和体内成瘤,是潜在的治疗靶点。
二、喉癌NF-κB信号转导通路的免疫组化研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、喉癌NF-κB信号转导通路的免疫组化研究（论文提纲范文）
（1）小檗碱在心脏外科术后早期预防新发房颤的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 论文一 基于网络药理学预测小檗碱治疗房颤的作用靶点及通路 |
| (前言) |
| 资料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文二 小檗碱预防非体外循环冠状动脉旁路移植术后早期新发房颤的单中心、前瞻性研究 |
| (前言) |
| 资料与方法 |
| 试验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文三 小檗碱对兔快速心房起搏诱导心肌纤维化模型心房重构的影响及机制研究 |
| (前言) |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 小檗碱在心血管方面的应用 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
（2）基于网络药理学的白僵蚕治疗瘢痕的分子通路机理研究和临床研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 论文一 白僵蚕治疗瘢痕疾病的分子通路机理研究 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文二 白僵蚕制剂治疗肛瘘术后创面的临床疗效 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 综述 瘢痕疾病的中西医治疗进展 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
（3）LncRNASChLAP1和E3泛素连接酶TRIM22在胶质母细胞瘤中的作用与机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一部分：LncRNA SChLAP1与HNRNPL蛋白形成复合物促进胶质母细胞瘤恶性增殖 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 材料和方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 结论 |
| 1.6 附图表 |
| 1.7 参考文献 |
| 第二部分：TRIM22通过其E3泛素连接酶活性激活NF-κB信号通路促进胶质母细胞瘤恶性增殖 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 2.6 附图表 |
| 2.7 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读傅士学位期间的研究成果 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文文章一 |
| 英文文章二 |
（4）新型靶向配体CL429防治辐射损伤的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 前言 |
| 第一部分:CL429 对整体动物的辐射防护效应 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、结果讨论 |
| 第二部分:CL429 对骨髓造血系统辐射损伤防治效应 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、结果讨论 |
| 第三部分:CL429 对肠道组织辐射损伤防治效应 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、结果讨论 |
| 第四部分:CL429 防治辐射损伤作用的初步机制探讨 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、结果讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 模式识别受体与电离辐射损伤防护研究进展 |
| 参考文献 |
| 论文与专利 |
| 致谢 |
（5）滨蒿内酯通过PI3K/Akt信号通路对胰腺癌的抑制作用及相关机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:生物信息学分析滨蒿内酯抑制胰腺癌的关键基因 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 获得药物分子结构 |
| 2.2 预测药物靶点 |
| 2.3 预测胰腺癌靶点 |
| 2.4 潜在作用靶点GO分析及通路分析 |
| 2.5 蛋白质相互作用网络的构建 |
| 2.6 候选关键基因的表达模式 |
| 3 结果 |
| 3.1 滨蒿内酯潜在作用靶点 |
| 3.2 靶点富集分析 |
| 3.3 蛋白质相互作用网络的构建 |
| 3.4 验证候选关键基因的表达模式 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分:滨蒿内酯通过PI3K/Akt信号通路对胰腺癌的抑制作用 |
| 6 前言 |
| 7 材料与方法 |
| 7.1 试剂和仪器 |
| 7.1.1 主要试剂与材料 |
| 7.1.2 主要仪器 |
| 7.2 步骤与方法 |
| 7.2.1 细胞培养 |
| 7.2.2 CCK8实验检测细胞增殖 |
| 7.2.3 划痕实验检测细胞迁移 |
| 7.2.4 Transwell实验检测细胞迁移及侵袭 |
| 7.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 7.2.6 流式细胞术检测细胞周期 |
| 7.2.7 细胞RNA的提取 |
| 7.2.8 mRNA反转录成cDNA |
| 7.2.9 PCR实验测定Akt1及MAPK8的表达 |
| 7.2.10 细胞蛋白的提取 |
| 7.2.11 蛋白浓度测定 |
| 7.2.12 western blot检测细胞迁移、凋亡相关蛋白及信号通路相关分子的表达 |
| 7.2.13 裸鼠种瘤 |
| 7.2.14 制作肿瘤病理切片 |
| 7.2.15 免疫组化检测Ki67及PCNA表达 |
| 7.2.16 统计学分析 |
| 8 结果 |
| 8.1 CCK8实验验证滨蒿内酯抑制胰腺癌细胞增殖 |
| 8.2 划痕实验验证滨蒿内酯抑制胰腺癌细胞迁移 |
| 8.3 Transwell实验验证滨蒿内酯抑制胰腺癌细胞迁移及侵袭 |
| 8.4 流式细胞术验证滨蒿内酯诱导胰腺癌细胞凋亡 |
| 8.5 流式细胞术验证滨蒿内酯引起胰腺癌细胞周期停滞 |
| 8.6 qRT-PCR实验验证滨蒿内酯对Akt1及MAPK8表达的影响 |
| 8.7 western blot实验验证滨蒿内酯对细胞迁移、凋亡相关蛋白及信号通路相关分子表达的影响 |
| 8.8 裸鼠成瘤实验验证滨蒿内酯对胰腺癌的抑制作用 |
| 8.9 免疫组化实验验证滨蒿内酯抑制KI67及PCNA的表达 |
| 9 讨论 |
| 10 结论 |
| 第三部分:PI3K/Akt信号通路激动剂对滨蒿内酯抑制胰腺癌作用的影响 |
| 11 前言 |
| 12 材料与方法 |
| 12.1 试剂和仪器 |
| 12.1.1 主要试剂与材料 |
| 12.1.2 主要仪器 |
| 12.2 步骤与方法 |
| 12.2.1 细胞培养及分组 |
| 12.2.2 CCK8实验检测细胞增殖 |
| 12.2.3 划痕实验检测细胞迁移 |
| 12.2.4 Transwell实验检测细胞迁移及侵袭 |
| 12.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 12.2.6 流式细胞术检测细胞周期 |
| 12.2.7 细胞蛋白的提取 |
| 12.2.8 蛋白浓度测定 |
| 12.2.9 western blot检测细胞迁移及凋亡相关蛋白及信号通路相关分子的表达 |
| 12.2.10 统计学分析 |
| 13 结果 |
| 13.1 CCK8实验验证PI3K/Akt信号通路激动剂SC79逆转滨蒿内酯对胰腺癌细胞增殖的抑制作用 |
| 13.2 划痕实验验证PI3K/Akt信号通路激动剂SC79逆转滨蒿内酯对胰腺癌细胞迁移的抑制作用 |
| 13.3 Transwell实验验证PI3K/Akt信号通路激动剂SC79逆转滨蒿内酯对胰腺癌细胞迁移及侵袭的抑制 |
| 13.4 流式细胞术验证PI3K/Akt信号通路激动剂SC79逆转滨蒿内酯对胰腺癌细胞凋亡的诱导 |
| 13.5 流式细胞术验证PI3K/Akt信号通路激动剂SC79逆转滨蒿内酯对胰腺癌细胞周期停滞的诱导 |
| 13.6 Western blot实验验证PI3K/Akt信号通路激动剂SC79逆转滨蒿内酯对细胞迁移及凋亡相关蛋白及信号通路相关分子表达的影响 |
| 14 讨论 |
| 15 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 天然产物在胰腺癌中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）溃疡性结肠炎“以痈论治”策略的临床疗效及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 理论研究 姜树民教授“以痈论治”溃疡性结肠炎的学术思想及经验 |
| 1 “以痈论治”学术特色的师脉传承 |
| 2 “以痈论治”UC及“毒热致痈”的源流考析 |
| 3 UC的病因和病机 |
| 4 姜师治疗UC特色及经验 |
| 5 姜师治疗UC用药特色 |
| 6 消痈止痢汤的组方解析 |
| 第二部分 临床研究 “消痈止痢汤”治疗活动期大肠湿热型轻中度溃疡性结肠炎的临床疗效观察 |
| 前言 |
| 资料与方法 |
| 研究结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 实验研究 |
| 实验一 消痈止痢汤对溃疡性结肠炎大鼠的一般状态和黏膜组织形态的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 实验二 消痈止痢汤对溃疡性结肠炎大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α和MPO含量的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 实验三 消痈止痢汤对溃疡性结肠炎大鼠MAPK信号通路和NF-κB蛋白表达的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 中医药治疗溃疡性结肠炎分子机制的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
（7）线性泛素化信号通路调控胃癌恶性进展的机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 去泛素化酶OTULIN对胃癌恶性生物学行为的影响及机制研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 SHARPIN对胃癌恶性生物学行为的影响及机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 泛素化修饰在肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间的研究成果 |
| 学位论文自评表 |
| 致谢 |
（8）基于NF-κB信号通路探究清肺口服液黄酮类成分抗RSV的效应机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部份 基础研究 |
| 1 传统中医学对现代病毒性肺炎的探讨 |
| 1.1 中医学对RSV肺炎的概述 |
| 1.2 中医学对肺炎喘嗽的文献研究 |
| 1.3 中医学对肺炎喘嗽的病因病机概述 |
| 1.4 中医学对肺炎喘嗽的治疗概述 |
| 1.5 现代中医对RSV肺炎的诊治现况 |
| 1.6 清肺口服液的临床运用 |
| 2 现代医学对RSV肺炎的认识与现况 |
| 2.1 呼吸道合胞病毒的认识 |
| 2.2 呼吸道合胞病毒肺炎 |
| 2.3 现代医学对RSV的治疗概述 |
| 2.4 RSV疫苗的研制现况 |
| 2.5 RSV与NF-κB信号通路研究概况 |
| 第二部分 实验研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物造模 |
| 1.2 病毒复苏后增量 |
| 1.3 干预药物 |
| 1.4 实验试剂 |
| 1.4.1 主要实验用品来源 |
| 1.4.2 主要试剂配置比例 |
| 1.5 实验设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 呼吸道合胞病毒的采集与接种 |
| 2.1.1 培养细胞技术 |
| 2.1.2 接种RSV病毒 |
| 2.2 收集RSV病毒并检测其毒力 |
| 2.2.1 收集RSV病毒 |
| 2.2.2 稀释RSV病毒原液 |
| 2.2.3 病毒TCID50测定毒力 |
| 2.3 取得清肺口服液黄酮类成分 |
| 2.4 动物实验造模及给药 |
| 2.5 组织病理切片 |
| 2.6 酶联免疫吸附法测定血清IL-6 |
| 2.7 聚合酶链式反应测mRNA表达水平 |
| 2.7.1 设计PCR引物 |
| 2.7.2 采集样本提取RNA |
| 2.7.3 测定病毒RNA浓度并转录 |
| 2.7.4 荧光定量PCR |
| 2.8 免疫组化法测目标蛋白表达水平 |
| 2.9 免疫印迹法测目标蛋白表达水平 |
| 2.9.1 提取肺组织蛋白 |
| 2.9.2 BCA法测蛋白浓度 |
| 3 结果 |
| 3.1 实验小鼠观察 |
| 3.2 肺组织病理观察 |
| 3.3 血清白介素-6含量比较 |
| 3.4 荧光定量PCR测mRNA表达水平 |
| 3.5 免疫组化法测IKKα、p65蛋白表达水平 |
| 3.6 免疫印迹法测p-IκBα/IκBα蛋白表达水平 |
| 第三部份 讨论 |
| 1 研究讨论 |
| 2 实验讨论 |
| 3 创新与不足 |
| 3.1 创新之处 |
| 3.2 不足之处 |
| 4 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（9）TLR9乙酰化修饰在脓毒血症中的免疫调节及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英汉缩略词对照表 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 TLR9 发生乙酰化修饰 |
| 2.2 CBP和TLR9发生相互作用 |
| 2.3 TLR9和TIRAP发生相互作用 |
| 2.4 CBP增加NF-κB的反应元件活性 |
| 2.5 乙酰化修饰促进炎症反应中的TLR9信号通路的传递,增加炎症因子的产生 |
| 2.6 通过动物实验探讨TLR9乙酰化修饰在脓毒血症疾病发展中的作用 |
| 3 讨论 |
| 3.1 TLR9蛋白发生乙酰化修饰 |
| 3.2 乙酰化修饰正向调节TLR9与多个接头蛋白的相互作用 |
| 3.3 TLR9 乙酰化修饰正向调控NF-κB核转移 |
| 3.4 TLR9 乙酰化修饰对脓毒血症的调节 |
| 4 不足与展望 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 蛋白质翻译后修饰对TLRs信号通路调控的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文及获得的科研成果 |
（10）过表达HOXC11通过调控PPAE-γ和NF-κB通路促进头颈部鳞癌增殖和侵袭的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 1.1 头颈部恶性肿瘤的临床治疗进展 |
| 1.1.1 头颈部恶性肿瘤的流行病学及病理学情况 |
| 1.1.2 头颈恶性肿瘤的诊断学上的研究进展 |
| 1.1.3 头颈部恶性肿瘤的临床治疗进展 |
| 1.1.4 头颈部恶性肿瘤发生的分子机制假说 |
| 1.2 HOXC基因家族在恶性肿瘤中的研究情况 |
| 1.2.1 HOX基因家族的结构及一般生物学功能 |
| 1.2.2 HOXC基因家族在恶性肿瘤中的研究进展 |
| 1.2.3 HOXC基因家族在头颈部恶性肿瘤中的研究进展 |
| 1.3 NF-κB信号通路在头颈部恶性肿瘤中的研究情况 |
| 1.3.1 NF-κB信号通路的组成和一般生物学功能 |
| 1.3.2 NF-κB信号通路在头颈部恶性肿瘤中的研究进展 |
| 1.4 PPAR-γ信号通路在头颈部恶性肿瘤中的研究情况 |
| 1.4.1 PPAR-γ信号通路的组成和一般生物学功能 |
| 1.4.2 PPAR-γ信号通路在头颈部恶性肿瘤中的研究进展 |
| 第二章 HOXC11在头颈部鳞癌的表达及其临床意义 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 HOXs家族成员在头颈部鳞癌中的mRNA表达 |
| 2.2.2 HOXC11的高表达与头颈部鳞癌患者差的生存预后相关 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 HOXC11对头颈鳞癌肿瘤细胞的特性的调控 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 稳定沉默HOXC11的头颈部鳞癌细胞模型构建 |
| 3.2.2 沉默HOXC11对头颈部鳞癌体外生物学特性的影响 |
| 3.2.3 沉默HOXC11对头颈部鳞癌体内生物学特性的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 头颈部鳞癌中HOXC11作用通路机制的初步探索 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 总结和展望 |
| 参考文献 |
| 附录1 中英文缩写对照 |
| 附录2 鼻咽拭子检测Septin9基因甲基化对鼻咽癌早期诊断的意义 |
| 1 研究背景与目的 |
| 2 研究的中文摘要 |
| 3 研究的英文摘要 |
| 4 正文 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间主要成果 |
| 致谢 |
四、喉癌NF-κB信号转导通路的免疫组化研究（论文参考文献）
- [1]小檗碱在心脏外科术后早期预防新发房颤的作用及机制研究[D]. 王洋. 辽宁中医药大学, 2021(02)
- [2]基于网络药理学的白僵蚕治疗瘢痕的分子通路机理研究和临床研究[D]. 李娜. 辽宁中医药大学, 2021(02)
- [3]LncRNASChLAP1和E3泛素连接酶TRIM22在胶质母细胞瘤中的作用与机制研究[D]. 季剑雄. 山东大学, 2021(12)
- [4]新型靶向配体CL429防治辐射损伤的作用及机制研究[D]. 程赢. 中国人民解放军海军军医大学, 2021(01)
- [5]滨蒿内酯通过PI3K/Akt信号通路对胰腺癌的抑制作用及相关机制的研究[D]. 李娜. 中国医科大学, 2021
- [6]溃疡性结肠炎“以痈论治”策略的临床疗效及机制研究[D]. 陈晨. 辽宁中医药大学, 2021(02)
- [7]线性泛素化信号通路调控胃癌恶性进展的机制研究[D]. 张亮. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021(01)
- [8]基于NF-κB信号通路探究清肺口服液黄酮类成分抗RSV的效应机制[D]. 李淅埙. 南京中医药大学, 2021(01)
- [9]TLR9乙酰化修饰在脓毒血症中的免疫调节及其机制研究[D]. 农安娜. 右江民族医学院, 2021
- [10]过表达HOXC11通过调控PPAE-γ和NF-κB通路促进头颈部鳞癌增殖和侵袭的研究[D]. 吕洁瑜. 南方医科大学, 2021(02)