一、血小板源性生长因子与早期糖尿病肾病（论文文献综述）
杜鹃[1]（2021）在《CD26阳性外泌体与急性肾损伤的关系及机制的研究》文中提出1 研究背景急性肾损伤（Acute Kidney Injury,AKI）是以肾滤过功能快速丧失为特点的临床综合征,表现为尿素氮、肌酐等代谢产物的蓄积和/或尿量的减少,其病理特点主要为急性肾小管坏死。研究发现住院患者的发生率约为2-21%,其在社区医院发病率约为2%,而在大型医院发病率可达20%,重症监护病房（Intensive care unit,ICU）的发病率可达50%以上。AKI导致死亡率增加,住院时间延长,以及慢性肾病（Chronic kidney disease,CKD）的发病率增加。总之,AKI给公共卫生及社会资源带来巨大的压力,成为严重的健康问题。传统与新发现的肾病生物学标志物,如血尿素氮、血肌酐、尿NGAL、KIM-1及TIMP2-IGFBP7乘积等,可协助进行AKI的预测和诊断。但它们都仅仅指向预测肾功能降低或肾损伤的发生,缺乏预测肾功能恢复的能力。患者肾损伤的持续时间及肾功能转归可显着影响患者远期预后,因此,早期预测、识别患者的恢复表型,及早干预,促进肾功能早期恢复、改变恢复表型,或能显着改善AKI患者的预后。在预测肾功能恢复的生物学标志物方面,存在较大空白。目前临床亟需理想的生物标志物预测AKI肾功能的转归。外泌体是由细胞分泌的直径为30-150nm的微小囊泡,其中包含完整的膜蛋白（尤其是糖蛋白）、外周膜蛋白、胞质、核蛋白以及细胞内组分,如miRNA,mRNA和代谢产物。同时外泌体通过受体与配体的相互作用,与靶细胞膜的附着/融合或被受体细胞内化,来进行细胞间通讯以及蛋白质和核酸的细胞间交换,从而发挥细胞间信使的作用,参与增殖、凋亡、免疫、凝血等多种生理及病理过程。尿液外泌体主要起源于肾单位管腔和泌尿道内衬的细胞,循环外泌体难以穿过肾小球滤过膜。多项研究发现,尿液外泌体RNA,miRNA和蛋白质可以较尿液其他生化成分更早的反映肾脏疾病中基因表达的变化。尿液外泌体有望成为一种有效且非侵入性的肾脏疾病生物标记物。同时,临床前研究提示外源性外泌体可减轻AKI肾脏损伤,促进修复,提示外泌体可能直接参与肾脏损伤与修复过程。因此,较其他尿液中的分子,外泌体更及时、更直接地体现肾脏细胞的病理生理状态,在预测预后方面更具有优势。CD26,又称为二肽基肽酶 Ⅳ（Dipeptidyl-peptidase 4,DPP4）,是广泛表达于多种细胞表面的一种糖蛋白,可以裂解多种底物的N端二肽基,包括神经肽、肽激素、血管活性肽、趋化因子以及一些生长因子和细胞因子。另外CD26是多功能蛋白,除蛋白水解作用外,以多种方式发挥多种促增殖、免疫和炎症调节等作用。但CD26在AKI中的作用仍待阐明。最近的一项蛋白组学研究发现,与其他尿液及血清蛋白相比,尿CD26在AKI后发生显着变化,推荐尿CD26,尤其尿细胞外囊泡的CD26,为AKI候选生物标志物,值得进一步研究。多项尿液外泌体的组学研究也发现尿液外泌体富含CD26,主要由CD26表达极为丰富的远端肾小管上皮细胞及其他肾脏细胞所释放。尿液中外泌体结合CD26较尿液游离CD26更具有肾脏特异性,且已证实与外泌体结合是尿CD26的主要存在形式,因此,尿外泌体CD26可能对肾功能转归的预测更具有优势。综上,与AKI的早期预测相比,预测肾功能转归的生物标志物仍有较大空白,为临床所亟需。尿外泌体有可能成为新的肾损伤、肾功能转归预测的生物标志物,尿外泌体CD26能否作为AKI的预后标志物有待进一步研究。2目的（1）比较重症AKI患者与重症非AKI患者之间尿外泌体CD26水平的变化,探索尿外泌体CD26是否与AKI相关;（2）探讨尿外泌体CD26是否与AKI分期相关;（3）探讨尿外泌体CD26是否与90天内主要肾脏不良事件相关;（4）（4）探讨尿外泌体CD26是否与AKI肾功能恢复相关;（5）探讨尿外泌体CD26对AKI肾脏功能恢复的预测价值。3方法3.1研究设计该研究为单中心前瞻队列观察性研究。我们同时也收取了入住ICU的非AKI患者作为对照,首先比较两组间尿外泌体CD26表达的差异,以探讨尿外泌体CD26表达与AKI发生是否相关,并通过多元线性回归分析各临床因素对尿外泌体CD26表达有无影响。在AKI患者中按CD26+尿外泌体比率分为CD26高表达和低表达组,首先通过双向比较研究尿外泌体CD26与AKI分期、住院死亡率的关系,继而用生存分析的方法比较尿外泌体CD26表达的高/低与90天内主要肾脏不良事件（MAKE）的关系。其中MAKE包含3个成分,即死亡、接受肾脏替代治疗及肾功能持续恶化,对3个终点和组合终点分别进行分析及检验。应用同样的方法分析尿外泌体CD26表达水平与28天内肾功能恢复的关系,并进一步应用Cox回归分析进行多因素分析;进而在AKI存活者中对3个肾功能恢复终点（早期肾功能恢复、出院肾功能恢复及院内肾功能恢复）进行分析,通过单因素和多因素分析验证尿外泌体CD26与早期肾功能恢复、出院肾功能恢复和院内肾功能恢复之间的关系。最后,在AKI存活者中检验尿外泌体CD26对早期肾功能恢复,出院肾功能恢复和院内肾功能恢复的预测价值,并进行亚组分析。3.2研究对象研究连续纳入2017年1月至2018年1月入住山东大学齐鲁医院ICU,符合AKI诊断的成年患者,构成研究队列。AKI的诊断按照2012 KIDIGO指南推荐的诊断标准。排除标准为:（1）无尿;（2）严重的尿路感染;（3）泌尿系结石或肿瘤;（4）既往应用CD26/DPP4抑制剂;（5）患者或法定代表人拒绝。对照组的患者通过连续筛查2017年1月-2017年3月入住ICU的不符合AKI诊断标准的成年重症患者。排除标准同AKI组。入选患者均按照2012 KIDIGO指南的推荐进行治疗。3.3临床资料的采集采集患者的一般情况,包括:性别,年龄,身高、体重;采集患者的慢性病史及急性合并症;采集患者用药史;生命体征;采集入住ICU 24h内的Scr、尿量,及血常规、血生化、肝功能等数值。计算入住ICU第一天的APACHEII评分及非肾脏APACHE II。3.4临床终点的定义及随访本研究定义的主要终点是90天主要肾脏不良事件（MAKE）,包含:死亡、接受肾脏替代治疗（RRT）和持续肾功能恶化（较入组时肌酐≥200%）。次要终点为肾功能恢复。肾功能恢复的定义为不再符合AKI和CKD的任何一条诊断标准。肾功能恢复终点包含:早期肾功能恢复（7天内）,出院肾功能恢复（出院时处于肾功能恢复状态）和院内肾功能恢复（住院期间发生过肾功能恢复）。随访患者至90天,随访其存活与否,有无接受肾脏替代治疗（RRT）及肌酐数值等。若发生以上事件,记录事件发生的时间,以进行分析。3.5标本采集及保存入组患者在入住ICU的24小时内留取新鲜尿液15ml。常温下,以300g转速离心10min,弃沉渣,取上清,放入-80℃冰箱备用。3.6外泌体分离纯化通过差速超速离心法对尿液标本中的外泌体进行分离和纯化。3.7电镜观察外泌体显微结构样品前处理后,透射电镜观察AKI患者尿液外泌体的超微表征。3.8检测外泌体特征性蛋白利用Western blot及流式细胞术检测外泌体特征性蛋白。3.9乳胶微球辅助的流式细胞术检测尿液外泌体中CD26醛/硫酸盐乳胶微球吸附分离提纯的尿液外泌体,荧光素标记的流式抗体孵育结合的乳胶微球,流式细胞仪检测CD26阳性的尿液外泌体的阳性率。3.10统计学方法对采集的临床资料及检验数据,连续变量用中位数及四分位间距描述,分类变量的描述为病例数（n）和百分比（%）。对于连续变量,采用Student’s t-test检验用于呈正态分布的数据比较,Mann-Whitney检验和Kolmogorov-Smirnov检验用于呈非正态分布的数据比较。对于分类变量,用Pearson’s chi-squared检验进行数据间的比较。首先对AKI组和对照组间进行CD26+尿外泌体比率进行比较,探讨在AKI发生时尿外泌体CD26表达是否发生改变。进而纳入所有患者,以CD26+尿外泌体比率为因变量,纳入临床因素为自变量,进行相关及多元线性回归分析,来除外各临床因素对尿外泌体CD26表达的影响。为研究尿外泌体CD26与90天内MAKE及28天内肾功能恢复间的关系,我们应用类似生存分析KM曲线的方法,并对28天内肾功能恢复应用Cox进行多元回归分析,探讨其独立影响因素。在AKI存活者中进行双向比较,按临床终点分类（早期肾功能恢复/早期肾功能未恢复,出院肾功能恢复/出院肾功能未恢复,院内肾功能恢复/无院内肾功能恢复）,比较两个结局间CD26+尿外泌体比率;分别应用单因素和多因素的方法研究尿外泌体CD26与三个AKI肾功能恢复终点（早期肾功能恢复、出院肾功能恢复、院内肾功能恢复）的关系。单因素分析将尿外泌体CD26表达水平与三个肾功能恢复终点分别进行单因素chi-squared检验,多因素分析分别以三个肾功能恢复终点为因变量,自变量纳入尿外泌体CD26表达水平和各临床因素进行多元Logistic回归分析。最后进行敏感性分析,在AKI存活者中,通过制作ROC曲线,研究尿外泌体CD26对三个肾功能恢复终点的预测能力,并分亚组进行分析。以上分析,生存分析和ROC曲线应用GraphPad Prism 8进行分析,余统计过程均应用SPSS 17.0进行。4 结果4.1研究对象纳入研究对象为山东大学齐鲁医院重症医学科住院的成年患者,共入组AKI队列133人,非AKI对照组68人。4.2提取的外泌体形态与大小应用透射电镜和动态光散射测量结果显示提取的尿液外泌体形态与大小符合文献报道的经典外泌体特征,不含细胞碎片、微粒等其他细胞成分,可以用于下一步检测。4.3提取的外泌体生物标志物Western blot与流式细胞检测术显示 CD63,CD81,GRP94,Calnexin,CD61以及TSG101在所提取的外泌体中表达丰富。4.4 AKI队列与对照组临床特征及尿外泌体CD26的比较基线特征进行比较:两组间年龄、性别、非肾脏APACHEII评分匹配。AKI组住院死亡率显着增高。两组间住院时间和住ICU时间相比较,均无明显差异。AKI组CD26+尿外泌体比率显着低于对照组,6.4%（1.2%-22.0%）vs.23.9%,（6.6%-64.5%）;p<0.001。4.5尿外泌体CD26与临床指标的相关性分析CD26+尿外泌体比率与非肾脏APACHE II评分、糖尿病、慢性肾病（CKD）及AKI呈负相关,与外科术后呈正相关,与余临床指标不相关。多元线性相关分析显示,仅AKI与CD26+尿外泌体比率独立相关adjusted β=-15.95（-23.60,-8.29）,p<0.001。4.6尿外泌体CD26表达高/低两组间临床特点的比较以中位数为界值,定义CD26+尿外泌体比率≥6.4%为尿外泌体CD26高表达（n=67）,CD26+尿外泌体比率<6.4%为尿外泌体CD26低表达（n=66）。尿外泌体高表达和低表达组之间进行临床特点的比较,显示两组间年龄、性别、APACHEII评分及非肾脏APACHE II评分相匹配。比较两组间住院时间、住ICU时间及住院死亡率无显着性差异。高表达组院内接受RRT比率显着低表达组（p=0.016）,早期肾功能恢复、院内肾功能恢复显着高于低表达组（p<0.05）,而出院肾功能恢复率无显着性差异。4.7尿外泌体CD26表达与AKI分期之间的关系尿外泌体CD26表达高/低两组间比较AKI 3个分期的构成,结果显示无统计学差异（p=0.084）。将CD26+尿外泌体比率作为连续变量,在AKI 3个分期间进行比较,两两比较各组无差异。因此,尿外泌体CD26与AKI的分期无显着性关系。提示,尿外泌体CD26表达与肾损伤的严重程度无关。4.8尿外泌体CD26表达与AKI患者预后的关系4.8.1尿外泌体CD26与MAKE 90的关系针对复合终点MAKE的组成成分逐一进行分析。为分析尿外泌体CD26与死亡终点的关系,首先在出院存活与死亡患者间比较CD26+尿外泌体比率无显着性差异。尿外泌体CD26表达高/低两组间比较住院死亡率无显着差异。最后在高表达组和低表达组间比较90天死亡率,Kaplan-Meier分析显示CD26高表达组与CD26低表达组90天死亡率无显着差异（p=0.907）。以上结果提示,尿外泌体CD26与近期死亡无关。对MAKE的另一成分——接受RRT治疗,与尿外泌体CD26的关系进行分析。CD26高表达组较低表达组院内应用RRT的比率显着降低（p=0.016）。KM分析显示,CD26高表达组90天内接受RRT比率显着低于低水平组（p=0.013）。提示,CD26高表达预示90天内RRT应用风险较低。对MAKE的最后一个成分——持续肾功能恶化进行分析。KM分析显示,90天内持续肾功能恶化在两组间无统计学差异（p=0.717）。对复合终点MAKE进行分析,CD26高表达组90天内MAKE的发生率显着低于CD26低表达组,具有统计学差异（p=0.018）,主要是RRT应用这一结局的影响。提示,尿外泌体CD26高表达预示近期内MAKE发生风险较低,较好的肾脏相关预后。4.8.2尿外泌体CD26与肾功能恢复的关系4.8.2.1尿外泌体CD26与28天内肾功能恢复的关系Kaplan-Meier分析比较AKI患者尿外泌体CD26高/低表达组间28天内肾功能恢复发生率,结果显示高表达组28天内肾恢复率显着高于CD26低表达组（p<0.001）。进一步的多因素Cox回归分析,尿外泌体CD26 表达水平进入方程（HR,1.90;95%CI,1.15-3.14;p=0.012）。结果提示,尿外泌体CD26高表达可能促进AKI肾功能恢复。4.8.2.2 AKI存活者中尿外泌体CD26与肾功能恢复终点的关系AKI组81名存活者,依据3个肾功能结局进行分组,分别为早期肾功能恢复组/早期肾功能未恢复组、出院肾功能恢复组/出院肾功能未恢复组、院内恢复组/院内肾功能未恢复组,分别比较3组CD26+尿外泌体比率,显示各良好结局组CD26+尿外泌体比率均显着高于不良结局组（p<0.05）。在CD26表达高/低两组间比较肾功能早期恢复的差异,高表达组29（72.5%）例患者早期恢复,而低表达组仅有15（3 6.6%）例患者早期恢复,卡方检验显示两组间早期肾功能恢复存在显着差异（OR=4.57,p=0.001）。逐步多元Logistic回归分析显示,早期肾功能恢复与AKI分期及尿外泌体CD26表达水平独立相关（OR=4.67,p=0.007）。结果提示,尿外泌体CD26高表达可能是促进早期肾功能恢复的因素。在CD26高/低表达两组间比较肾功能出院恢复的差异,高表达组34（85.0%）名患者出院恢复,而低表达组有23（56.1%）名患者出院恢复,卡方检验显示两组间出院肾功能恢复存在显着差异（OR=4.44,p=0.004）。以出院肾功能恢复为因变量,进行逐步多元Logistic回归分析,显示心血管事件、AKI分期和尿外泌体CD26表达水平（OR=3.50,p=0.039）进入方程。结果提示,尿外泌体CD26高表达可能是促进出院肾功能恢复的因素。在CD26表达高/低两组间比较院内肾功能恢复,高表达组35（87.5%）例患者院内肾功能恢复,低表达组有23（56.1%）例患者在院期间肾功能恢复,存在显着差异（OR=5.48,p=0.002）。以院内肾功能恢复为因变量,进行逐步多元Logistic回归分析,显示心血管事件、AKI分期以及CD26表达水平（OR=4.66,p=0.019）进入方程。结果提示,尿外泌体CD26高表达可能促进院内肾功能恢复。4.8.3尿外泌体CD26对肾功能恢复终点的预测价值CD26+尿外泌体比率在AKI存活者中分别预测早期肾功能恢复、出院肾功能恢复及院内肾功能恢复,经ROC方法检测仅对早期肾功能恢复的预测具有统计学意义,曲线下面积（AUROC）为0.65（0.53-0.77）,p=0.021。对于出院肾功能恢复和院内肾功能恢复的预测不能达到统计学意义。利用预测早期肾功能恢复的ROC曲线选取曲线上最佳截断值,为6.8%。利用该值计算尿外泌体CD26对3个肾功能恢复终点的预测能力,显示其对出院肾功能恢复和院内肾功能恢复有较高的特异性和阳性预测值。分析显示,大于此截断值的患者其中90%的患者将在院期间发生肾功能恢复。提示,尿外泌体CD26对肾功能转归的预测具有一定的临床应用价值。进一步在亚组中检测尿外泌体对3个肾功能恢复终点的预测能力。因为脓毒症是AKI最重要的病因,按是否合并脓毒症分类后,显示在非脓毒症相关AKI的患者中尿外泌体CD26的预测价值显着提高,预测早期肾功能恢复:AUROC=0.71,p=0.046;预测出院肾功能恢复:AUROC=0.79,p=0.009;预测院内肾功能恢复:AUROC=0.83,p=0.003。提示,在非脓毒症相关AKI患者,尿外泌体CD26对肾功能恢复有较强的预测价值,值得进一步研究。5结论（1）尿外泌体CD26表达的降低与重症患者AKI的发生相关,但尿外泌体CD26表达水平与AKI肾损伤的严重程度不相关;（2）尿外泌体CD26与近期死亡率不相关,但尿外泌体CD26与90天内主要肾脏不良事件发生率相关,尿外泌体CD26高表达预示着较低的90天内主要肾脏不良事件发生风险;（3）尿外泌体CD26与肾功能恢复独立相关,尿外泌体CD26高表达可预测AKI早期肾功能恢复、出院肾功能恢复及院内肾功能恢复。利用尿外泌体CD26早期预测肾功能转归,实现个体化精准治疗,以期能改善患者的长期预后。1 研究背景急性肾损伤（acute kidney injury,AKI）是住院患者尤其重症患者的严重并发症,除导致住院死亡率显着升高外,会导致长期死亡率升高和慢性肾脏疾病（chronic kidney disease,CKD）及终末期肾病的发病率增加,造成沉重的疾病负担。目前对于AKI尚无有效的预防或治疗措施,仍为支持治疗。外泌体是一种细胞外囊泡,广泛存在于各种体液中。其脂质双分子层携带来源细胞的蛋白及核酸的结构使其作为一种细胞间信使,通过与受体细胞结合,广泛参与各种生理及病理过程的调节。外泌体作为疾病诊断和预后标志物越来越受到重视,已发现数种外泌体蛋白及RNAs与AKI有关。晚近的几项研究发现,外源性的外泌体可减轻AKI肾脏损伤,促进肾功能恢复,但其作用机制及关键分子尚不清楚。论文I的研究发现,与对照组相比,AKI患者尿外泌体CD26表达显着降低;而AKI患者队列内部,尿外泌体CD26高表达组比低表达组有更高的出院肾功能恢复率;经过校正性别、年龄、慢性合并症、急性病因、危重程度、AKI分期之后,尿外泌体CD26与早期肾功能恢复、出院肾功能恢复等肾脏预后仍有独立的关联。因肾小球滤过膜的存在,尿外泌体较少来自于循环,肾脏细胞是尿外泌体的主要来源。由此我们推断表达CD26的肾脏细胞来源的外泌体可能有减轻肾脏损伤、促进肾脏修复的功能。CD26是细胞表面的跨膜糖蛋白,通常也被称作Dipeptidyl peptidase-4（DPP4）。其具备丝氨酸蛋白酶活性,广泛表达于多种类型的细胞中,在肾脏其表达于肾小球足细胞的基底膜,并高度表达于远端肾小管上皮细胞（TEC）的刷状缘微绒毛。研究发现CD26与细胞增殖、炎症调节等过程相关。TEC的再生是AKI修复的主要环节,研究发现CD26有促进细胞增殖的作用。并且CD26参与炎症反应的调节,其底物包含一些系列趋化性细胞因子。AKI主要病理过程发生于TEC,尤其远端TEC的损伤、坏死或凋亡,进而炎症细胞浸润、间质炎症反应的发生。肾脏修复主要过程为TEC的增生,替代丧失的TEC、修复肾小管上皮组织,炎症反应参与调控这一过程。良好的增生和调控,导致完全的修复和肾功能的恢复;反之则导致纤维化的加重,最终导致CKD。因此,我们假设CD26+外泌体可能通过促进TEC增生,抑制炎症反应,减轻纤维化,减轻肾损伤、促进肾脏修复。由此,我们拟通过体外培养小鼠肾小管上皮细胞系TCMK1,通过体外模拟AKI的主要致病过程缺血再灌注（ischemia/reperfusion injury,IR）,获取培养基上清中的生理外泌体（ExoNormal）,IR程序获取ExoIR,探索生理与IR条件下尿液中CD26的表达。过表达CD26腺病毒载转染TCMK1,构建TEC来源的CD267过表达的外泌体（ExoCD26）;利用手术构建IR相关的AKI小鼠动物模型,进一步利用外泌体进行干预,通过与对照组在肾脏功能、组织病理及增生、炎症等指标对照间的比较,探讨CD26+外泌体对AKI肾脏修复的影响,及其可能的机制。2 目的（1）体外实验中探讨缺血再灌注对肾小管上皮细胞（TEC）外泌体中CD26表达的影响;（2）利用CD26过表达的腺病毒载体转染肾小管上皮细胞,构建CD26过表达的TEC外泌体;（3）IR-AKI动物体内,示踪TEC外泌体能否被肾脏细胞摄取;（4）通过体内实验,探讨CD26过表达外泌体能否减轻肾损伤、促进肾脏修复,并探讨其可能的机制。3方法3.1细胞培养及病毒转染TCMKI细胞分别常规培养及缺血缺氧程序培养,两种培养条件下的细胞均按标准程序转染CD26过表达腺病毒与空载体。留取细胞培养基上清。3.2外泌体分离纯化及表达鉴定用超速差速离心法提取TCMK-1小鼠肾小管细胞上清中的外泌体。分别对常规培养细胞释放的外泌体ExoNormal,缺氧培养细胞释放的外泌体ExoIR,正常培养条件下CD26转染后细胞释放外泌体ExoCD26,及缺氧培养并转染的细胞释放的外泌体ExoIR+CD26,分别进行CD26表达的检测。外泌体与抗CD26抗体和荧光素结合的二抗充分反应后,加入流式细胞分析。3.3 AKI（IR）动物模型的建立C57BI/6雄性成年小鼠（8周）,戊巴比妥麻醉后,显微镜下,一侧肾蒂紧密结扎后,将肾脏切除;对侧肾动脉用动脉夹夹闭,观察肾脏变色,呈缺血改变,覆盖湿润纱布,夹闭30分钟。3.4外泌体的体内示踪避光条件下操作,使用PKH26标记外泌体,经尾静脉注入IR小鼠体内;分别于注射15分钟、2小时及12小时在麻醉下取肾脏组织;OCT包埋组织块,制成冰冻切片;切片经双蒸水水化、PBS清洗后,应用BSA终止反应;加入AQP1一抗,4度湿盒孵育过夜后,PBS清洗,加入荧光素偶联的AQP1二抗,37℃孵育30分钟,PBS清洗,DAPI染色、封片,即刻荧光显微镜下观察。3.5 IR小鼠干预措施及分组分为对照组,IR+BSA 组,IR+ExoNormal 组,1IR+ExoIR组,IR+ExoCD26组,每组各10只;对照组不做肾脏处理,余操作同IR手术各组;IR各组于手术后12h分别经尾静脉注入等蛋白质量的BSA,ExoNormal,ExoIR及ExoCD26进行干预。3.6 肾功能指标检测干预后72h,取血样。各血样离心后,保存血清。分别应用尿素氮和肌酐试剂盒进行检测,以得出尿素氮和肌酐的浓度数值。3.7 肾脏组织病理学检测干预后72h,进行肾脏取材。各肾脏组织分别进行HE染色和PAS染色,显示肾小管上皮损伤情况,并用半定量的方法,在各组间进行比较。3.8 肾脏增殖指标的检测免疫荧光技术检测增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）在各组肾脏的表达;Western blot的方法检测p21和p53在肾脏的表达。3.9 肾脏炎症指标的检测免疫荧光技术分别应用抗MOMA2抗体、抗neutrophil抗体及抗CXCR4抗体显示巨噬细胞、中性粒细胞在肾脏的浸润和趋化性细胞受体CXCR4在肾脏的表达。并应用Western blot的方法检测趋化性细胞因子SDF-1（CXCR4的配体）在肾脏的分布。3.10肾脏纤维化指标的检测Western blot的方法测定1型胶原在各组肾脏中的表达。4 结果4.1 外泌体鉴定电镜下可见纯化成分为双凹圆盘状的高电子密度囊泡,大多直径位于30-150nm;使用动态光散射技术检测微粒的粒径大小,结果提示分离纯化的囊泡直径呈单峰分布,平均直径在30-100nm左右。结果提示,使用经典的超速差速离心方法获得的为典型的外泌体囊泡,可用于下一步功能试验。4.2外泌体中CD26表达分析流式细胞分析显示,生理条件下TCMK-1细胞培养液上清中分离纯化的外泌体ExoNormal中CD26表达量较少,经过IR程序的TCMK-1细胞上清外泌体ExoIR中CD26表达轻度增加。分别向TCMK-1细胞系（常规条件培养）转染空载体病毒Vector和过表达CD26的病毒（VirusCD2）。病毒转染后,细胞系培养液上清分离纯化外泌体,流式测得该外泌体高度表达CD26,阳性率大于70%,即ExoCD26。同样方法转染缺氧条件下培养的TCMK-1细胞系,从细胞培养液上清采集的外泌体（ExoIR+CD26）,也高度表达CD26,与ExoCD26相似。各组外泌体进行western blot检测,显示ExoNormal对CD26的表达均少,ExoIR对CD26的表达较ExoNormal轻度增加;常规培养的细胞系转染VirusCD26后释放的外泌体（ExoCD26）对CD26表达显着增加;缺氧条件下培养的细胞系,转染VirusCD26后,其外泌体（ExoIR+CD26）对CD26的表达也显着增加,与ExoCD26无明显差异。4.3 AKI动物模型的鉴定经过一侧肾动脉钳夹,对侧肾脏切除,72h后小鼠血尿素氮、肌酐显着升高,肾脏组织出现IR病理学改变,证实AKI造模成功。4.4动物体内外泌体示踪PKH26标记的外泌体通过尾静脉注入IR小鼠体内,2h后取材,制冰冻切片,荧光标记AQP1。显示肾小管上皮细胞内可见外泌体荧光标记,肾脏其他类型细胞内未见外泌体荧光标记。提示,肾小管上皮细胞（TEC）来源的外泌体选择性的被TEC所摄取。4.5外泌体对肾脏功能指标的影响IR小鼠血清尿素尿素氮及肌酐水平显着增高:与BSA相比,ExoNormal及ExoIR对肾功能指标无影响,而ExoCD26显着降低了血清尿素氮和肌酐水平。4.6外泌体对肾脏组织损伤的影响HE染色及PAS染色显示,IR小鼠肾脏出现明显损伤,包含肾小管扩张,刷状缘缺失,肾小管上皮细胞的坏死,管型的形成等;与BSA相比,ExoNomal及ExoIR未能减轻肾脏损伤,而ExoCD26显着降低了肾损伤评分和损伤肾小管分数,减轻了肾脏组织损伤。4.7外泌体对TECs增生的影响免疫荧光染色示,IR小鼠肾脏增殖细胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen,PCNA）显着降低;与 BSA 相比,ExoNormal 及 ExoIR 未能增加PCNA的表达,而ExoCD26显着增加了 PCNA的表达,PCNA沿肾小管分布。此外,IR小鼠肾脏p21和p53表达显着升高,提示细胞分裂增生的阻滞;与BSA相比,ExoNormal及ExoIR未能降低p21和p53的表达,但ExoCD26显着降低了两者的表达。以上结果提示,ExoCD26促进了 TECs细胞的增生。4.8外泌体对肾脏炎症反应的影响免疫荧光显示,IR肾脏中性粒细胞、巨噬细胞浸润显着增加;与BSA相比,ExoNormal及ExoIR未能显着降低中性粒细胞和巨噬细胞的浸润,而ExoCD26显着降低了两种炎症细胞的浸润。同时,Western blot和免疫荧光结果显示,SDF-1和CXCR4这一对趋化因子及受体在IR肾脏表达显着增加;与BSA相比,ExoNormal及ExoIR未能明显改变其表达,但ExoCD26显着降低了两者表达。提示,ExoCD26能降低趋化性细胞因子及受体的表达,并改善炎症细胞的浸润。4.9外泌体对肾脏纤维化的影响Western blot结果显示,IR肾脏1型胶原表达显着增加;与BSA相比,ExoNormal及ExoIR未能显着改变其表达,而ExoCD26显着降低了 1型胶原表达。提示,ExoCD26抑制早期肾纤维化。5.结论（1）缺血再灌注使肾小管上皮细胞系来源的外泌体CD26的表达增加;（2）肾小管上皮细胞系来源的外泌体在IR-AKI小鼠动物模型体内,可被TEC摄取;（3）ExoCD26可改善AKI小鼠肾脏功能指标,减轻肾脏损伤,其可能的机制是ExoCD26被TEC摄取后,促进TEC增殖,减轻肾脏炎症反应和纤维化,从而促进肾脏的修复。
危志强[2]（2020）在《二十碳五烯酸抑制肾小管上皮细胞间质转化及纤维化的机制研究》文中指出第一部分二十碳五烯酸抑制肾小管上皮细胞间质转化及纤维化机制的体外研究背景:上皮细胞向间充质细胞转化即上皮间充质转化（EMT）是肾脏疾病进展的一个重要过程。转化生长因子β1（TGF-β1）是一种常见的促纤维化细胞因子,TGF-β1/整合蛋白联接激酶（ILK）信号通路和整合素β1（integrinβ1）/ILK信号通路在肾纤维化过程中对间质的慢性炎症变化和细胞外基质的积累起着重要作用。过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）可下调肾小管上皮细胞分泌炎性介质ILK活性,延缓EMT。多个研究证实mi RNAs参与了肾小管水平细胞发育,如mi R-4756,mi R-34a和mi R-210。微眼相关转录因子（MITF）是MIR-541的靶点,MITF/mi R-541轴是心肌肥厚的一种新的调节途径。肿瘤转移和EMT的重要调节因子mi RNAs通过调节EMT相关基因参与各种肿瘤的进展。那么,mi R-541是否参与肾小管上皮细胞间质转化及纤维化的尚不清楚。二十碳五烯酸（EPA）具有降低蛋白尿、减轻肾脏损害、延缓肾脏进展等作用,然而EPA的肾脏保护作用是否通过TGF-β1/ILK信号通路和或integrinβ1/ILK信号通路、是否有mi R-541参与尚不清楚。目的:本研究对HK-2模型采用人血白蛋白（Alb）刺激,并对体内肾小管上皮细胞在发生蛋白尿后的病理改变过程进行模拟。分析EPA对肾脏EMT、纤维化和信号通路相关蛋白表达水平的影响,评价mi R-541在此过程的作用,并探讨其潜在机制。基于此,本体外实验研究将探讨EPA抑制肾小管上皮细胞间质转化及纤维化中的可能作用机制,以期为临床治疗提供理论依据。方法:常规培养对数生长期HK-2细胞,对其进行培养24h后,将其放置在无血清培养24h,将细胞培养为G0期。（1）将5.0mg/ml Alb加入为白蛋白组（模型组）;将EPAl0μmol/l+5.0mg/ml Alb（低剂量EPA干预组）,EPA30μmol/l+5.0mg/ml Alb（高剂量EPA干预组）,另外设置正常对照组。对以上各组进行培养24h、48h、72h,并对其具体指标进行测定。（2）细胞转染mi R-541抑制剂或mi R-NC抑制剂24h后,洗涤细胞,然后用或不用5mg/ml Alb处理,有或没有30μmol/l EPA刺激24h,对具体指标进行测定。各实验组均设置6个重复孔。（3）采用MTT法测定Alb或EPA对HK-2细胞活力的影响。通过QPCR检测ILK、integrinβ1、PPARγ、mi R-541、平滑肌肌动蛋白（a-SMA）、E钙黏蛋白（E-Cadherin）、I型胶原蛋白（collagen I）、纤维连接蛋白（FN）等m RNA表达。（4）采用Western blot法测定ILK通路相关蛋白TGF-β1、p Smad2/3、Smad7和ILK蛋白水平,同时测定integrinβ1、PPARγ、mi R-541、a-SMA、E-Cadherin、collagen I等蛋白水平。采用ELISA法检测FN的水平。（5）mi R-541和TGF-β1之间的目标关系通过生物信息学,荧光素酶基因测定和蛋白质印迹分析证实。结果:（1）低剂量的Alb对HK-2细胞的细胞存活率没有影响,而EPA以浓度依赖性方式抑制HK-2细胞的细胞活力。（2）HK-2在Alb的作用下,ILKm RNA和蛋白的表达上调,而integrinβ1、PPARγ的m RNA和蛋白的表达下调,EPA一定程度上抑制了该过程,且呈浓度和时间依赖性。（3）EPA可抑制Alb诱导的HK-2细胞的EMT和纤维化,并增加mi R-541表达。mi R-541的引入有效地消除了Alb刺激的HK-2细胞的EMT和纤维化。（4）生物信息学分析预测TGF-β1作为mi R-541的靶基因,随后荧光素酶报告基因检测和蛋白质印迹分析进一步支持了该预测。mi R-541可下调TGF-β1的表达,并抑制TGF-β1/Smad3/ILK通路。Alb处理激活TGF-β1/Smad3/ILK途径,而EPA抑制该途径的激活。（5）mi R-541抑制剂逆转了EPA对Alb诱导的HK-2细胞的EMT、纤维化和TGF-β1/Smad3/ILK通路相关蛋白表达的影响。结论:EPA可通过PPARγ介导的ILK/integrinβl信号通路直接激活核受体,或靶向mi R-541通过TGF-β1/Smads/ILK通路,抑制EMT和肾纤维化。第二部分二十碳五烯酸抑制肾小管上皮细胞间质转化及纤维化机制的体内研究背景:在慢性肾脏疾病中辅助采用二十二碳六烯酸（DHA）和二十碳五烯酸（EPA）等n-3多不饱和脂肪酸可使患者受益,比如降低蛋白尿、减轻肾脏损害、延缓肾脏进展等作用,然而具体作用机制尚不清楚。目的:本研究拟对早期阶段的2型糖尿病肾病KK-Ay/Ta小鼠采用EPA干预,通过检测小鼠表型变化、分析肾脏病理变化等,探讨体内试验研究中EPA抑制肾小管上皮细胞间质转化及纤维化的机制,为EPA治疗慢性肾脏病尤其是早期糖尿病性肾病提供理论依据。方法:在本次体内实验中,将20只KK-Ay/Ta雄性小鼠采用随机数字表法进行分组分为2组每组均为10只雄性小鼠,其中治疗组从小鼠周龄自第12周开始给予EPA给药,每次腹腔内注射EPA1g/kg/d,连续注射8周,非治疗组在自第12周开始给予腹腔内注射生理盐水1g/kg/d,连续注射8周。对照组小鼠为10只Balb/c A雄性小鼠。分别在小鼠12周、16周及20周时对小鼠血压、血糖、尿蛋白肌酐比值等表型变化进行检测,并在小鼠20周龄时对血清脂肪酸、甘油三酯、胆固醇、晚期氧化蛋白产物（AOPP）、丙二醛（MDA）、胰岛素、糖耐量水平进行检测。对KK-Ay/Ta雄性小鼠进行8周治疗后处死,将肾组织取出,并采取形态学对肾组织进行观察及检测,采用图象分析软件、免疫组化对肾脏中TGFβ1、α-SMA、I型胶原、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）等表达及巨噬细胞浸润的情况进行检测分析。同时采用RT-PCR检测MCP-1、TGFβl、α-SMA和I型胶原m RNA表达。结果:对KK-Ay/Ta雄性小鼠经EPA治疗后,相比于未治疗组,血清磷脂中EPA水平呈明显升高趋势,本研究结果提示腹腔内注射EPA被KK-Ay/Ta雄性小鼠充分吸收。经过EPA治疗后,KK-Ay/Ta雄性小鼠的AOPP、MDA水平明显得到降低,且KK-Ay/Ta雄性小鼠的血清甘油三酯下降明显,对尿白蛋白的排泄率起到明显降低作用,对葡萄糖不耐受现象明显得到改善。通过免疫组化检测及形态学检查均证实对KK-Ay/Ta雄性小鼠进行EPA治疗后可明显降低肾小球细胞外基质的积聚,同时可减少EMT和小管间质纤维化程度,另外可有效减弱肾脏中MCP-1及巨噬细胞的浸润。通过RT-PCR检测结果提示,对KK-Ay/Ta雄性小鼠进行EPA治疗后,与未治疗组相比,MCP-1、TGFβl、α-SMA及I型胶原m RNA表达均呈下降状态。结论:EPA可通过抑制肾脏局部的炎症、纠正体内异常代谢、调节TGFβ1水平和氧化应激状态等有效地缓解细胞外基质的积聚,减轻EMT和肾间质纤维化。
国家中医药管理局国家中医临床研究基地办公室[3]（2013）在《我国16个重点病种的国家中医临床研究基地论文统计表（2008年～2013年）》文中研究表明
韦芳宁[4]（2010）在《益气活血中药治疗慢性肾衰的机理研究》文中研究表明背景慢性肾衰竭（CRF）为内科常见病之一,是各种肾脏疾病导致肾功能渐进性不可逆性减退,直至功能丧失所出的一系列症状和代谢紊乱所组成的临床综合征,其病情危重,死亡率高。西医非透析治疗的目的主要是缓解慢性肾衰症状和延缓病程进展,主要措施包括消除CRF进展的可逆因素；治疗原发病,如高血压病、糖尿病肾病等；抗感染,水电解质平衡等；优质低蛋白饮食,加必需氨基酸或酮酸；保护肾脏功能、减轻蛋白尿的血管紧张素Ⅱ酶转化酶抑制剂的应用；调节脂质代谢和改善肾小球局部存在高凝状态。中医中药治疗慢性肾衰以中药的单味药、单方、复方制剂及综合疗法,通过多环节、多层次、多途径综合治疗措施而达到缓解慢性肾衰症状,保护肾功能,延缓病程进展的目的。多年的临床实践经验表明,慢性肾衰的治疗,采用中西医结合的综合治疗,特别是中药介入治疗后,在缓解慢性肾功能衰竭症状,保护残余肾功能、延缓早中期肾功能进展、推迟进入透析和肾移植时间等方面取得了明显疗效,提高了CRF患者的生存质量。益气活血中药三芪口服液在慢性肾脏病的治疗以及改善慢性肾衰的症状,延缓慢性肾衰的病程进展,保护肾功能方面积累了一定的经验。本研究从细胞黏附因子、炎症因子、细胞凋亡和T淋巴细胞亚群上,多角度、多靶点研究三芪口服液的影响,旨在探讨中药介入慢性肾衰治疗的肾功能保护作用以及三芪口服液保护肾功能的作用机理。目的通过临床和实验研究观察益气活血中药三芪口服液对慢性肾衰病人及对5／6肾切除慢性肾衰大鼠模型肾脏病理形态和功能的保护作用,从分子生物学、细胞凋亡以及淋巴细胞免疫方面,探讨益气活血中药三芪口服液延缓CRF进展的机理。方法临床研究：选择纳入标准的病例95例,分为3组,三芪口服液组34例,尿毒清组30例,三芪口服液+尿毒清组31例,每组患者均按就诊顺序随机进入治疗组及对照组。12周后观察慢性肾衰的症状积分、血红蛋白、红细胞压积、血小板计数、血清白蛋白、尿素、肌酐、血钾、血小板膜α颗粒蛋白（PS）的变化。实验研究：选用SPF雄性SD大鼠102只。使用随机软件包PEMS3.1产生随机数字,按随机数字大小排序,等分为6组,每组17只,造模过程死亡24只,实际78只,空白组13只,模型对照组13只、三芪口服液高剂量组（TMH组）13只、三芪口服液中剂量组（TMM组）13只,三芪口服液低剂量组（TML组）13只、包醛氧淀粉组13只。建立大鼠5／6肾切除慢性肾衰的模型,造模成功后用三芪口服液口服进行干预治疗,12周后分别观察各组大鼠一般情况、肾功能、红细胞压积、血小板计数和血小板膜α颗粒蛋白的变化,以及光镜下肾小球组织的改变,细胞凋亡的分析,TNF-α、TGFβ1、PGDFBB以及CD4、CD8和CD68的变化。结果临床实验研究方面：治疗前后三芪口服液组中医症状积分比较,差异有统计学意义（P<0.05）。提示三芪口服液有改善慢性肾衰症状的作用。提示三芪口服液与尿毒清合用能明显提高临床治疗有效率,治疗有效率96.8%。三芪口服液能降低血尿素水平,提高血清白蛋白水平并可以下调PS的表达。治疗前后比较,差异有统计学意义（P<0.05）。口服三芪口服液,患者依从性较好,未发生出血及不良事件。基础实验研究：血生化方面,三芪口服液各剂量组均可降低造模大鼠的血尿素和血肌酐水平,中剂量可以提高造模大鼠的血红蛋白压积,高、中剂量可以降低造模大鼠的血小板,治疗前后比较有统计学意义（P<0.05）。细胞黏附因子方面,三芪口服液中、低剂量可以下调PS的表达。治疗前后比较有统计学意义（P<0.05）。在残肾病理组织学方面,三芪口服液可以使增大的肾小球面积明显缩小,可以减轻肾小管损伤程度。与包醛氧淀粉组比较,差异有统计学意义（P<0.05）。细胞因子研究方面,经三芪口服液治疗后,无论高、中、低剂量组,大鼠血清TNF-α、FPDGBB以及残肾组织的TGFβ1、FPDGBB水平均明显降低,与模型组比较,差异有统计学意义（P<0.05）。细胞凋亡方面,经三芪口服液治疗后,5／6肾切除大鼠慢性肾衰肾脏细胞凋亡率明显降低,与包醛氧淀粉酶组比较,差异有统计学意义（P<0.05）。淋巴细胞免疫方面,三芪口服液中、低剂量组可以显着上调CD4水平,使CD4／CD8比值明显上升,CD68水平下调,与包醛氧淀粉组比较,差异有统计学意义（P<0.05）。结论1.三芪口服液能改善慢性肾衰患者中医症状积分,提高临床治疗有效率。2.三芪口服液能提高慢性肾衰患者血清白蛋白水平,改善患者营养状态。3.三芪口服液能够通过下调慢性肾衰患者血浆PS的表达,改善患者的瘀血状态,从而改善患者肾小球微循环,此可能是保护肾功能的机制之一。4.三芪口服液能够降低5／6肾切除CRF模型大鼠的Scr水平,提高红细胞压积,改善机体整体状态。5.三芪口服液能减轻5／6肾切除大鼠的肾脏病理损害,使增大的肾小球面积明显减小,肾小管损伤程度明显减轻,对残肾组织的形态有保护作用,此可能是保护肾功能的作用机制之一。6.三芪口服液能抑制TNF-α、PDGFBB和TGFβ1的表达,减少肾小管损害,减少细胞增生,以此达到保护肾功能的目的。7.肾脏实质细胞的凋亡参与肾脏疾病的进展过程,可能是促进慢性肾硬化发生、发展的因素之一,三芪口服液能使5／6肾切除CRF模型大鼠凋亡细胞明显减少,从而抑制细胞凋亡参与的肾脏损伤,延缓慢性肾衰的进展。8.三芪口服液保护肾功能的机制可能与调整CD4和CD8的比例失调,调整异常的机体免疫紊乱和状态,减少了各种免疫受损的诱因有关,可能是其延缓CRF进展的机制之一。
杨敏[5]（2007）在《黄芪卫矛合剂对糖尿病肾病大鼠肾脏内皮细胞损伤的干预研究》文中研究说明糖尿病肾病（diabeticnephropathy,DN）是糖尿病（diabetesmellitus,DM）重要的微血管并发症之一,也是导致慢性肾功能不全的主要原因。目前DN的发病机制尚不清楚,亦缺乏有效的治疗手段。因此,积极地寻找有效方法治疗DN对于延长患者寿命,提高生活质量具有重大意义。本论文从文献综述、理论和实验研究三方面加以探讨,实验研究方面选用了体现益气行血、消症化积治法的黄芪卫矛合剂,重点观察其对单侧肾切除合并注射链脲佐菌素DN大鼠模型肾脏内皮细胞损伤的干预作用。1文献研究:就近年来现代医学对于DN的发病机理、治疗用药、研究方法;中医药防治DN作用机制进展;内皮细胞和DN关系;实验性DN动物模型的建立及研究方法等方面研究动态进行了较为系统的总结和综述。2理论研究:在中医理论指导下,结合现代研究成果,对消渴病肾病的病名、病机理论进行了阐述,认为消渴病肾病是以肾元亏虚、气阴两伤为本,气血瘀滞、痰湿内停为标,久病入络、肾生症瘕为发病关键;初步阐明了微型症瘕假说与肾脏内皮细胞损伤机制的相关性,确立了“益气行血、消症散结”为DN基本治法,为消渴病肾病的研究思路及治法提供了理论依据。3实验研究:目的:观察黄芪卫矛合剂对实验性糖尿病肾病大鼠肾脏内皮细胞损伤的干预作用及机制。方法:采用单侧肾切除加链脲佐菌素（STZ）尾静脉注射建立糖尿病肾病动物模型,随机分为模型组（M）、黄芪卫矛合剂治疗组（H）、科素亚治疗组（K）,另设假手术组为空白对照组（F）。0、4、8、12周动态观察大鼠一般状态、体重、尿量、空腹血糖（FBG）、糖化血红蛋白（HbA1c）、血脂、24小时尿蛋白定量、肾功能的变化,光镜观察肾小球及肾小管间质形态学和肾小管周围血管（PCT）网改变;采用双抗体夹心酶联免疫吸附（ELISA）法检测血清层粘连蛋白（LN）和Ⅳ型胶原（typeⅣcollagen）含量,硝酸还原酶法检测肾组织一氧化氮（NO）含量;放射免疫法检测内皮素-1（ET-1）的含量;采用Western-blot的方法测定肾组织中肝细胞生长因子（HGF）和转化生长因子β1（TGF-β1）的蛋白表达。结果:①黄芪卫矛合剂能显着降低DN大鼠空腹血糖和糖化血红蛋白,并具有降低血清胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL-C）而调节脂代谢的作用,与模型组比较有显着差异（P<0.05,P<0.01）;能够降低DN大鼠升高的血清BUN和Scr,与模型组比较有显着差异（P<0.05）;降低实验性DN大鼠24小时尿蛋白排泄量,与模型组比较有极显着差异（P<0.01）。提示黄芪卫矛合剂对实验性DN大鼠具有良好的调节糖、脂代谢作用,并具有减少尿蛋白排出、保护肾功能的作用。尤其在降糖、调脂、改善肾功能方面疗效优于科素亚组。其降低24小时尿蛋白的作用不如科素亚,但差异无统计学意义（P>0.05）。病理形态观察显示:模型组光镜下可见肾小球基底膜增厚,系膜区弥漫性增宽,细胞外基质（ECM）增多,肾小管纤维化。经黄芪卫矛合剂治疗后,上述病理改变有显着减轻,提示其对DN大鼠肾脏具有保护作用。科素亚对肾小球也有一定保护作用。②ELISA结果表明:糖尿病肾病大鼠血清LN和Ⅳ型胶原的合成和分泌明显增多,揭示了DN大鼠肾脏受到一定程度损害。在抑制肾小球合成和分泌LN和Ⅳ型胶原方面,黄芪卫矛合剂和科素亚皆能明显降低造模后LN和Ⅳ型胶原（与模型组相比P<0.05）,在降低Ⅳ型胶原方面黄芪卫矛合剂优于科素亚组,但在降低LN方面两组之间差异不显着（P>0.05）。表明黄芪卫矛合剂能减少肾小球合成和分泌LN和Ⅳ型胶原,是其防治DN的作用机制之一。③硝酸还原酶法检测表明糖尿病肾病模型组NO含量显着降低,放射免疫法检测显示其ET-1水平比假手术组显着升高,提示DN大鼠NO与ET-1的平衡失调,内皮功能紊乱,揭示了DN大鼠肾脏损害进一步发展。中药黄芪卫矛合剂和科素亚能明显提高NO含量,降低ET-1水平,与模型组比较差异均有显着性统计学意义（P<0.05,P<0.01）,两组之间比较差异不显着。提示黄芪卫矛合剂能显着改善糖尿病肾病模型所造成的NO表达减少和ET-1释放增多,从而发挥对肾脏内皮细胞的保护作用。表明黄芪卫矛合剂能显着改善糖尿病肾病大鼠模型所致NO的降低和ET-1增高,一定程度恢复二者的平衡紊乱、改善肾脏内皮功能,在此方面与科素亚比较作用相接近。④采用Westernblot蛋白印迹方法检测各组大鼠肾组织HGF和TGF-β1蛋白表达,研究结果显示:模型组大鼠肾组织中TGF-β1蛋白表达较假手术组明显升高（P<0.05）,而HGF蛋白表达较假手术组明显降低（P<0.05）,黄芪卫矛合剂和科素亚治疗后可明显下调TGF-β1蛋白表达,上调HGF蛋白表达,以调节HGF和TGF-β1的动态平衡,进一步抑制肾脏内皮细胞损伤,促进肾组织修复。结论:本课题中黄芪卫矛合剂采用“益气行血、消症散结”之法,针对DN“微型症瘕”病机设立,可有效防治糖尿病肾病,其作用机理可能是通过降糖、调脂、降低DN模型大鼠尿蛋白,减轻肾组织病理损伤,抑制细胞外基质主要成分LN和Ⅳ型胶原的合成,调节内皮细胞相关细胞因子NO和ET-1,HGF和TGF-β1的动态平衡发挥作用。其中,部分检测结果显示黄芪卫矛合剂优于科素亚,可能与中药多环节、多靶点治疗作用有一定关系。
关欣[6]（2006）在《益气养阴祛痰化瘀中药对糖尿病肾病大鼠肾脏的保护作用及其机制研究》文中认为目的： 观察益气养阴祛痰化瘀中药复方对早期糖尿病肾病大鼠肾脏的预防及治疗作用，探讨其药物作用机制，为临床应用提供可靠的实验依据。 方法： 将实验大鼠用高糖高脂饲料喂养1个月后，采用腹腔注射链脲佐菌素（STZ）的方法建立了早期糖尿病肾病（DN）大鼠模型。本实验将大鼠随机分为6组：正常对照组，中药预防组，中药高、低剂量组，模型组和西药福辛普利对照组。经益气养阴祛痰化瘀中药复方治疗6周，并与西药福辛普利进行对比。采用生化法、放射免疫法、电镜、光镜、蛋白质印记杂交法及逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）技术等进行研究。 分析指标：①血糖及糖化血红蛋白；②血清甘油三酯（TG），总胆固醇（TC）；③血浆血栓素B2（TXB2）和6-酮-前列腺素F1α(6-keto-FGF1α)；④尿微量白蛋白（UAIB）和α1微球蛋白（α1-MG）；⑤体重（BW）、肾重（RW）、肥大指数（RW／BW）：⑥血清肌肝（Scr）、尿素氮（BUN）；⑦肾皮质转化生长因子-β1（TGF-β1），葡萄糖转运蛋白1（GLUT1），血小板
中华医学会糖尿病学分会[7]（2021）在《中国2型糖尿病防治指南（2020年版）》文中提出随着国内外2型糖尿病的研究取得了重大进展, 获得了更多关于糖尿病及其慢性并发症预防、诊断、监测及治疗的循证医学新证据。中华医学会糖尿病学分会特组织专家对原有指南进行修订, 形成了《中国2型糖尿病防治指南（2020年版）》, 旨在及时传递重要进展, 指导临床。本指南共19章, 内容涵盖中国糖尿病流行病学、糖尿病的诊断与分型、2型糖尿病的三级预防、糖尿病的筛查和评估、糖尿病的教育和管理、2型糖尿病综合控制目标和高血糖的治疗路径、医学营养、运动治疗和体重管理、高血糖的药物治疗、糖尿病相关技术、糖尿病急性和慢性并发症、低血糖、糖尿病的特殊情况、代谢综合征和糖尿病的中医药治疗等。本指南的颁布将有助于指导和帮助临床医师对2型糖尿病患者进行规范化综合管理, 改善中国2型糖尿病患者的临床结局。
吴迪[8]（2021）在《人羊膜来源上皮细胞调节主动脉内皮细胞血管生成及其分子机制的探究》文中认为目的:动脉粥样硬化如今已成为危害人类健康的重要疾病,血管内皮受损是其始动因素。血管内皮细胞是是一层有活性的细胞,其完整性及生理特性对人体至关重要。除了动脉粥样硬化过程,血管内皮细胞还参与血管生成、血管收缩与舒张、凝血功能、炎症反应调控、内分泌功能、物质交换等重要的生理和病理过程。血管生成（Angiogenesis）指从毛细血管后微静脉出芽形成新的毛细血管网络,过程极其复杂,其中血管内皮细胞的激活、增殖、迁移、重建形成新的血管和血管网是非常重要的环节,是促进血管生成因子和抑制血管生成因子相互协调作用的结果。正常情况下二者处于平衡状态,一旦平衡打破就会激活血管系统,使血管生成过度或抑制,导致病理性事件。干细胞在血管生成方面的作用一直是研究热点,但是作用机制始终未能完全明确,特别是干细胞通过旁分泌功能对靶细胞的调控作用备受关注。人羊膜来源上皮细胞是干细胞的一种,能够旁分泌大量的生长因子及趋化因子等生物活性因子,旁分泌是其对靶细胞功能进行调控的重要方式之一。本研究的目的是:（1）建立人羊膜来源上皮细胞（hAECs）的体外分离、培养方法,并对其进行表型鉴定和纯度分析。（2）检测人羊膜上皮细胞条件培养液（hAEC-CdM）中的细胞因子,并对其相关信号通路进行富集分析。（3）观察不同浓度的人羊膜上皮细胞条件培养液对体外培养的人主动脉内皮细胞（hAoECs）增殖、迁移及血管生成作用的影响。（4）探究人羊膜上皮细胞条件培养液调节人主动脉内皮细胞相关生理作用的分子机制。研究方法:（1）采用胰蛋白酶消化法分离、体外培养人羊膜上皮细胞,应用免疫荧光染色分析其表型特征。（2）将收集的hAEC-CdM进行液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）检测,并对结果进行GO富集分析和KEGG信号通路分析。（3）实验分组情况:我们设计用ECM培养hAoECs为对照组,标记为Control组;在ECM中加入0.5倍、1倍及2倍浓度的hAEC-CdM设为3个实验组,标记为0.5×CdM组、1×CdM组、2×CdM组,分别用四种培养液培养hAoECs,然后进行相关实验验证hAoECs功能的变化。抑制剂干预实验分组:ECM组（Control）、1×CdM组、抑制剂组（SB431542或K02288）、CdM+抑制剂组。（4）经hAEC-CdM处理24小时、48小时及72小时后,通过CCK-8实验观察不同浓度hAEC-CdM对hAoECs增殖能力的影响。（5）经hAEC-CdM处理12小时及24小时后,通过细胞划痕实验评估不同浓度hAEC-CdM对hAoECs迁移能力的影响。（6）基质胶血管生成实验验证不同浓度hAEC-CdM对hAoECs管腔形成能力的影响。（7）Western Blot检测不同浓度hAEC-CdM对hAoECs TGF-β通路活化的影响。结果:（1）消化下来的人羊膜上皮细胞贴壁后呈多角形,长满后呈现上皮细胞特有的铺路石样,可在体外大量扩增。上皮细胞传至第2代用于细胞鉴定及实验。免疫荧光结果显示:上皮细胞高表达上皮细胞标志物角蛋白CK19,不表达间充质细胞标志物Vimentin,纯度在90%以上。（2）本次质谱分析鉴定蛋白273种,参与信号通路88种。GO富集分析结果显示:人羊膜上皮细胞条件培养液主要调节靶细胞的代谢过程、内吞作用和磷酸化进程;KEGG信号通路分析结果显示:羊膜上皮细胞条件培养液主要影响靶细胞的PI3K-Akt通路、mTOR通路和TGF-β通路。（3）CCK-8实验结果:在24小时节点,不同浓度实验组的hAoECs增殖能力与对照组相比均无显着差别（p>0.05）;在48小时节点,0.5×CdM组的hAoECs增殖能力与对照组相比无明显差别（p>0.05）,1×CdM组和2×CdM组的hAoECs增殖能力均明显高于对照组（p<0.05）;在72小时节点,不同浓度实验组hAoECs增殖能力均明显高于对照组（p<0.05）。根据以上结果可知:hAEC-CdM促进hAoECs增殖,随着hAEC-CdM浓度增加,其对hAoECs增殖的促进作用增强。（4）划痕实验结果:在12小时节点,0.5×CdM组细胞迁移能力与对照组无显着差别（p>0.05）,1×CdM组和2×CdM组细胞迁移能力显着高于对照组（p<0.05）;在24小时节点,不同浓度实验组细胞迁移能力均明显高于对照组（p<0.05）。根据以上结果可知:hAEC-CdM促进hAoECs迁移,随着hAEC-CdM浓度增加,其对hAoECs迁移的促进作用增强。（5）基质胶血管生成实验结果:对照组hAoECs在6小时开始逐渐形成管腔结构,0.5×CdM组和1×CdM组hAoECs在6小时形成管腔结构多于对照组,且1×CdM组形成的管腔结构多于0.5×CdM组。但是2×CdM组在6小时几乎没有形成管腔结构。根据以上结果可知:低浓度hAEC-CdM促进hAoECs管腔形成。（6）加入不同浓度hAEC-CdM刺激后的Western Blot结果:（1）ALK5-Smad3-Snail-Postn通路相关蛋白的表达:0.5×CdM组、1×CdM组和2×CdM组的ALK5和Smad3蛋白表达水平与对照组相比无显着差异（p>0.05）,0.5×CdM组和1×CdM组p-Smad3、Snail和Postn蛋白表达水平明显高于对照组（p<0.05）,但2×CdM组p-Smad3、Snail和Postn蛋白表达水平明显低于于对照组（p<0.05）。（2）ALK1-Smad5-Snail-Postn通路相关蛋白的表达:0.5×CdM组、1×CdM组和2×CdM组的ALK1和Smad5蛋白表达水平与对照组相比无显着差异（p>0.05）,0.5×CdM组和1×CdM组p-Smad5、Snail和Postn蛋白表达水平明显高于对照组（p<0.05）,但2×CdM组p-Smad5、Snail和Postn蛋白表达水平明显低于于对照组（p<0.05）。（7）加入抑制剂后的Western Blot结果:（1）加入SB431542后p-Smad3及其下游相关蛋白的western blot结果:加入抑制剂SB431542后,相较于对照组Smad3的蛋白表达水平无显着差异（p>0.05）,p-Smad3、Snail和Postn的蛋白表达水平显着降低（p<0.05）。1×CdM组p-Smad3、Snail和Postn的表达水平相较于对照组显着升高（p<0.05）,说明1×CdM促进了上述蛋白的表达;加入SB431542后,（CdM+SB）组p-Smad3、Snail和Postn的蛋白表达水平显着降低（p<0.05）,说明SB431542一定程度上抑制了1×CdM对hAoECs上述蛋白表达的促进作用。（2）加入K02288后p-Smad5及其下游相关蛋白的western blot结果:加入抑制剂K02288后,相较于对照组Smad5的蛋白表达水平无显着差异（p>0.05）,p-Smad5、Snail和Postn的蛋白表达水平显着降低（p<0.05）。1×CdM组p-Smad5、Snail和Postn的表达水平相较于对照组显着升高（p<0.05）,说明1×CdM促进了hAoECs的上述蛋白的表达;在加入K02288后（CdM+K02288组）p-Smad5、Snail和Postn的蛋白表达水平显着降低（p<0.05）,说明K02288在一定程度上抑制了1×CdM对hAoECs上述蛋白表达的促进作用。（8）加入抑制剂后的血管生成实验结果:（1）使用1×CdM预培养主动脉内皮细胞24小时后进行基质胶血管生成实验,对照组细胞在6小时开始逐渐形成管腔结构,1×CdM组细胞形成的管腔结构明显多于对照组。（2）加入SB431542抑制Smad3磷酸化后,在6小时节点,SB431542组未见管腔结构形成,而（CdM+SB431542）组形成管腔数目明显少于1×CdM组,说明抑制Smad3磷酸化水平确实可以抑制hAEC-CdM促hAoECs血管生成的能力。（3）加入K02288抑制Smad5磷酸化后,在6小时节点,K02288组未见管腔结构形成,而（CdM+K02288）组形成管腔数目明显少于1×CdM组,说明抑制Smad5磷酸化水平确实可以抑制hAEC-CdM促hAoECs血管生成的能力。结论:（1）成功分离培养人羊膜上皮细胞,高表达CK19,不表达Vimentin,纯度在90%以上,在体外培养条件下快速增殖。（2）本次质谱分析鉴定蛋白273种,参与信号通路88种。GO富集分析结果提示人羊膜上皮细胞条件培养液主要调节靶细胞的代谢过程、内吞作用和磷酸化进程;KEGG信号通路分析结果提示人羊膜上皮细胞条件培养液主要影响靶细胞的PI3K-Akt通路、mTOR通路和TGF-β通路。（3）hAEC-CdM促进hAoECs增殖及迁移。（4）低浓度hAEC-CdM激活TGF-β信号通路促进hAoECs管腔形成的能力,而高浓度hAEC-CdM的抑制作用可能与其抑制hAoECs的Snail和Postn表达相关。
周雨桐[9]（2021）在《糖尿病肾病Ⅲ、Ⅳ期证候特征与益气活血方网络药理学疗效机制探讨》文中进行了进一步梳理本研究依托课题:首都卫生发展专项项目—基于精准医疗模式的糖尿病中医防治与管理（首发2016-1-4151）本论文由文献综述、糖尿病肾病证候特征探讨和益气活血方网络药理学机制研究三部分组成。1文献综述对近10年国内外糖尿病肾病的相关文献进行综述,了解现代医学对于糖尿病肾病的发病机制、分期、诊断与治疗研究进展,以及中医学对于糖尿病肾病的病因病机、证候特征、专方专药的认识,从而对糖尿病肾病有一个整体全面的了解。2糖尿病肾病证候特征探讨目的选择100例糖尿病肾病Ⅲ-Ⅳ期患者,对其一般资料、实验室检查和中医证候进行统计分析,探讨糖尿病肾病Ⅲ-Ⅳ期证候特征,为今后临床用药奠定基础。方法病例来源为2018年1月至2020年12月在广安门医院内分泌科病房住院的患者,根据其临床诊断选取糖尿病肾病Ⅲ-Ⅳ期患者100例,针对其性别、年龄、糖尿病病程、糖尿病肾病病程、血压、空腹血糖、餐后血糖、糖化血红蛋白、肌酐、尿素、尿微白蛋白、尿微白蛋白肌酐比、24小时尿蛋白定量、甘油三酯、胆固醇、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白以及相应的中医四诊症状进行研究,分析糖尿病肾病Ⅲ-Ⅳ期患者的证候特征。结果本次研究共收集到100例患者,其中男性60例（60.0%）,女性40例（40.0%）;Ⅲ期患者共75例,其中男性48例（64.0%）,女性27例（36.0%）;Ⅳ期患者共25例,其中男性12例（48.0%）,女性13例（52.0%）,两组间的性别组成差异无明显统计学意义。在本次研究收集100例患者中,年龄最大为79岁,最小为37岁;Ⅲ期患者患者组共75例,其中年龄最大为79岁,最小为37岁;Ⅳ期患者共25例,其中年龄最大为79岁,年龄最小为42岁。Ⅲ期患者与Ⅳ期患者年龄均集中在45-64及64岁以上这两个年龄段。在本次研究中,糖尿病肾病Ⅲ期患者DM病程为9.42±6.60年,糖尿病肾病Ⅳ期患者DM病程为13.21±7.15年,二者间具有统计学意义。本次研究发现总胆固醇、尿微白蛋白肌酐比在糖尿病肾病Ⅲ期、Ⅳ期中存在统计学差异,且均为Ⅳ期高于Ⅲ期。气短懒言为糖尿病肾病Ⅲ、Ⅳ期最常见的症状,倦怠乏力、小便频有泡沫、心悸、自汗等气虚证的表现在两组间出现频率均较高,差别不显着。糖尿病肾病Ⅲ、Ⅳ期出现较多的舌质为:舌紫暗有瘀斑、舌暗、舌淡;糖尿病肾病Ⅲ期出现较多的舌质依次为:舌紫暗有瘀斑、舌暗、舌淡;糖尿病肾病Ⅳ期出现较多的舌质依次为:舌紫暗有瘀斑、舌暗、舌淡。糖尿病肾病Ⅲ、Ⅳ期出现较多的舌苔为:苔薄、苔少、苔白腻;糖尿病肾病Ⅲ期出现较多的舌苔依次为:苔薄白、苔少、苔白腻;糖尿病肾病Ⅳ期出现较多的舌质依次为:苔薄白、苔白腻、苔少。糖尿病肾病Ⅳ、Ⅳ期出现较多的脉象为:脉涩、脉弦滑、脉弦;糖尿病肾病Ⅲ期出现较多的脉象依次为:脉涩、脉弦滑、脉弦;糖尿病肾病Ⅳ期出现较多的脉象依次为:脉涩、脉弦滑、脉弦。糖尿病肾病Ⅳ、Ⅳ期最常见证候为气阴两虚兼瘀证,治疗以益气养阴活血为法,方选益气活血方,药物组成为黄芪、白僵蚕、川芎、杏仁、牛蒡子。结论糖尿病肾病Ⅲ、Ⅳ期在男女间发病率无明显差异。糖尿病肾病Ⅲ期与Ⅳ期糖尿病肾病患者集中在中老年人群中。随着糖尿病病程的延长,患者糖脂代谢紊乱加重,肾功能损害加重。在临床工作中对于糖尿病肾病患者,要定期监测总胆固醇、尿微白蛋白肌酐比等实验室指标,早发现、早治疗,防止疾病进展。气虚血瘀证是糖尿病肾病Ⅲ期、Ⅳ期的主要证型,具体可分为心气虚、肺气虚、脾气虚、肾气虚、心肺气虚、心脾气虚、心肾气虚、肺脾气虚、肺肾气虚、脾肾气虚挟瘀证。其中肾气虚挟瘀证尿微白蛋白肌酐比水平较高,显着大于肺气虚挟瘀证。肾主藏精,为封藏之本,肾气虚、肾气不固,则肾失封藏,精微物质外泄。在心肾气虚挟瘀患者中,肌酐水平明显高于肺脾气虚挟瘀者。肾藏精,化生肾气能够推动调节脏腑气化,心肾相交,精神互用,君相安位,心肾气虚,气化减弱,气、血、精、津液新陈代谢紊乱,瘀浊内生,肌酐升高。3益气活血方网络药理学机制研究目的探讨益气活血方（黄芪、白僵蚕、川芎、杏仁、牛蒡子）中药治疗DKD的作用机制,为指导临床提供理论支撑。方法在中药系统药理学数据库与分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP）、中药综合数据库（traditional Chinese medicine integrated database,TCMID）中获取益气活血方有效成分。通过Swiss Target Predition、中草药有效成分蛋白靶点数据库（herbal ingredients targets database,HIT）获取益气活血方有效作用靶点,从治疗靶点数据库（therapeutic target database,TTD）、DrugBank、DisGeNet 中收集 DKD 治疗靶点,将疾病和药物靶点进行映射后得到“益气活血方-DKD共同靶点数据集”,将其导入String（Version 11.0）数据库,获得潜在八点的作用关系,以“combined-score（综合评分）≥0.9”为筛选标准,将筛选选后的信息导入Cytoscape3.2.1软件,构建蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络,运用Network Analyzer进行网络拓扑分析,以“Dggree（自由度）≥2倍中位数、Closeness centrality（接近中心性）≥中位数、Betweeness centrality（介数）≥中位数”为标准,对关键靶点进行筛选,构建“益气活血方-关键靶点-DKD”网络,根据degree值进行可视化。将关键靶点信息导入DAVID数据库,对其进行基因本体论（gene ontology,GO）分析和KEGG通路富集分析,分别用Excel 2007和omicshare tools绘制GO分析条图和KEGG通路富集分析气泡图。结果通过数据库和平台共检索到益气活血方5味中药的活性成分,其中通过TXMSP数据库中的获取的潜在活性成分依据“DL≥0.18”并且“OB≥30%”的标准进行筛选后,共有54个活性成分符合筛选标准,包括黄芪20个活性成分,川芎7个活性成分,苦杏仁19个活性成分,牛蒡子8个活性成分,白僵蚕通过TCMID数据库获取并经SwissADME验证找到10个活性成分。通过TCMSP与Uniprot数据库获取196个黄芪作用靶点、28个川芎作用靶点、70个苦杏仁作用靶点、99个牛蒡子作用靶点,经SwissTargetPrediction数据库预测获取466个白僵蚕作用靶点。从DrugBank、DisGeNet、GeneCards获取符合条件的Ⅲ、Ⅳ期糖尿病肾病作用靶点共计124个。益气活血方靶点和Ⅲ、Ⅳ期糖尿病肾病靶点进行映射后,得到124个潜在共同靶点;将124个潜在靶点导入String,“combindscore”>0.9的进行更新筛选后,得到节点45个,149对靶点相互作用关系。将从String获得的靶点结果,运用Cytoscape进行Network Analyzer分析,符合“Degree”大于等于中位数（6）、“BetweennessCentrality”大于等于中位数（0.007815）、“ClosenessCentrality”大于等于中位数（0.447917）筛选标准的益气活血方治疗早中期糖尿病肾病的关键靶点共19个。本次研究对19个益气活血方治疗早中期糖尿病肾病的关键靶点进行KEGG富集分析,共富集到81条通路,具有显着意义（P<0.01）通路的有64条。对19个益气活血方治疗早中期糖尿病肾病的关键靶点进行GO富集分析,经过筛选,有意义（P<0.01）的生物学过程结果53个、细胞学组分结果6个、分子生物学功能结果11个。结论益气活血方是通过多药味、多靶点、多通路的协同作用发挥作用。益气活血方可能作用于STAT3、PIK3CA等靶点,同时本方发挥多环节、多途径的作用机制可能与 NF signaling 通路、Toll-like receptor signaling 通路、HIF-1 signaling 通路相关,调控人体炎症反应、相关细胞凋亡及相关细胞因子的活性,延缓糖尿病肾病的进程。4本研究创新点、不足与展望糖尿病肾病是常见的糖尿病微血管并发症之一,它的起病隐匿,初期并无明显表现,病至晚期则不可逆,是引起终末期肾病以及死亡的主要病因,西医目前尚无特效药物对其进行治疗。探讨糖尿病肾病Ⅲ、Ⅳ期证候特征对于早期确诊糖尿病肾病、尽早采取有效的治疗手段具有重要意义。益气活血方是倪青教授针对糖尿病肾病Ⅲ-Ⅳ期气虚血瘀病机所创经验方,多年实践,效果显着。但是益气活血方成分多样,在体内作用过程复杂,作用机制尚缺乏系统的研究。近年来,网络药理学的发展使得可以运用公共数据库、网络可视化、网络分析预测等方法预测药物机制,对于临床药物研究具有重要意义。本研究由于条件有限,研究病例数较少,对于糖尿病肾病其他证型特征有待进一步研究。
二、血小板源性生长因子与早期糖尿病肾病（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、血小板源性生长因子与早期糖尿病肾病（论文提纲范文）
（1）CD26阳性外泌体与急性肾损伤的关系及机制的研究（论文提纲范文）
| 论文Ⅰ CD26阳性尿外泌体与重症患者急性肾损伤预后关系的前瞻性队列研究 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 1.前言 |
| 2 方法与材料 |
| 3 结果 |
| 4 讨沦 |
| 5 结论 |
| 6 局限性 |
| 附图与附表 |
| 参考文献 |
| 论文Ⅱ CD26阳性外泌体对急性肾损伤后肾脏修复作用的机制研究 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 1.前言 |
| 2.材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5.结论 |
| 6.局限性 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 综述 细胞外囊泡与肾脏疾病的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 发表论文1 |
| 发表论文2 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（2）二十碳五烯酸抑制肾小管上皮细胞间质转化及纤维化的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 序言 |
| 第一部分 二十碳五烯酸抑制肾小管上皮细胞间质转化及纤维化机制的体外研究 |
| 引言 |
| 1.实验材料与方法 |
| 2.实验结果 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 二十碳五烯酸抑制肾小管上皮细胞间质转化及纤维化机制的体内研究 |
| 引言 |
| 1.实验材料与方法 |
| 2.实验结果 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结与展望 |
| 综述一 二十碳五烯酸在蛋白尿相关性肾病治疗中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 EPA和肾脏疾病的临床研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间的科研成果 |
| 英文缩略词表 |
| 致谢 |
（4）益气活血中药治疗慢性肾衰的机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 研究背景 |
| 一、慢性肾衰溯源——历代医家对慢性肾衰的认识 |
| (一) 古代医家对慢性肾衰病名的共识 |
| (二) 古代医家对慢性肾衰病因病机的认识 |
| (三) 近代医家对慢性肾衰治则的认识 |
| (四) 中医药治疗近况 |
| 二、现代医学对慢性肾衰的认识 |
| (一) 西医研究进展 |
| (二) 瘀血与CRF |
| (三) 血小板α-颗粒膜蛋白(PS)与慢性肾衰 |
| (四) TNF-α、TGFβ1、PDGFBB与慢性肾衰 |
| (五) 细胞凋亡与慢性肾衰 |
| (六) CD4、CD8、CD68与慢性肾衰 |
| 第二部分 临床研究 |
| 一、研究对象 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 第三部分 实验研究 |
| 实验一 三芪口服液对5/6肾切除大鼠慢性肾衰肾功能的保护作用 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 实验二 三芪口服液对5/6肾切除大鼠肾脏病理形态与肌酐的关系 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 实验三 三芪口服液对5/6肾切除大鼠慢性肾衰TNF、TGF、PGDF的影响 |
| 一、大鼠血清TNF—α、PGDFBB含量检测 |
| 二、三芪口服液对大鼠残肾组织TGFβ1、PDGFmRNA表达的影响 |
| 实验四 三芪口服液对5/6肾切除大鼠慢性肾衰肾脏细胞凋亡的影响 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 实验五 三芪口服液对5/6肾切除大鼠慢性肾衰肾脏组织中CD4、CD8、CD68抗体的表达 |
| 一、5/6肾切除大鼠慢性肾衰肾脏组织中CD4抗体的表达 |
| 二、5/6肾切除大鼠慢性肾衰肾脏组织中CD8抗体的表达 |
| 三、5/6肾切除大鼠慢性肾衰肾脏组织中CD68抗体的表达 |
| 讨论 |
| 一、慢性肾衰竭病机探讨 |
| 二、慢性肾衰竭治则及治法探讨 |
| 三、三芪口服液的组成及方药分析 |
| 四、三芪口服液延缓慢性肾衰进展的中医机理探讨 |
| 五、三芪口服液延缓5/6肾切除大鼠慢性肾衰竭进展的机制探讨 |
| (一) 对大鼠造模、残肾组织、血肌酐及PS的影响方面 |
| (二) 对TNF-α、TGFβ1和PGDFBB表达的影响方面 |
| (三) 对肾脏细胞凋亡的影响方面 |
| (四) 对CD4、CD8、CD68抗体的表达的影响方面 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录一 英文缩略语 |
| 附录二 慢性肾衰症状分级量化表 |
| 附录三 疾病疗效评定标准 |
| 附录四 随机区组(及配对)设计表 |
| 附录五 附图 |
| 附图1 三芪口服液对5/6肾切除大鼠肾脏病理形态与肌酐的关系 |
| 附图2 三芪口服液对5/6肾切除大鼠慢性肾衰TGF、PDGF的影响 |
| 附图3 三芪口服液对5/6肾切除大鼠慢性肾衰肾脏细胞凋亡的影响 |
| 附图4 三芪口服液对5/6肾切除大鼠慢性肾衰肾脏组织中CD4、CD8、CD68抗体的表达 |
| 研究生在学期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（5）黄芪卫矛合剂对糖尿病肾病大鼠肾脏内皮细胞损伤的干预研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略语 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 糖尿病肾病的现代医学研究进展 |
| 第二章 糖尿病肾病的中医药研究进展 |
| 第三章 内皮细胞与糖尿病肾病 |
| 第四章 糖尿病性肾病的动物模型研究进展 |
| 第二篇 理论探讨 |
| 1 糖尿病肾病中医病名 |
| 2 糖尿病肾病中医病机探析 |
| 3 糖尿病肾病“益气行血、消症散结”治法的确立 |
| 4 黄芪卫矛合剂防治消渴病肾病的组方思路 |
| 第三篇 实验研究 |
| 前言 |
| 实验一 黄芪卫矛合剂对实验性糖尿病肾病大鼠糖、脂代谢及肾功能的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验二 黄芪卫矛合剂对糖尿病肾病大鼠Ⅳ型胶原及层粘连蛋白的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验三 黄芪卫矛合剂对糖尿病肾病大鼠肾组织NO 和ET-1 的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验四 黄芪卫矛合剂对实验性糖尿病肾病大鼠肾脏HGF和TGF-β_1蛋白表达的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 附录照片 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）益气养阴祛痰化瘀中药对糖尿病肾病大鼠肾脏的保护作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 中英文名词术语对照 |
| ABSTRACT |
| 摘要 |
| 前言 |
| 实验研究 |
| 一 材料和方法 |
| 1 实验动物 |
| 2 实验药物及剂量 |
| 3 仪器 |
| 4 试剂 |
| 5 糖尿病肾病大鼠模型的复制 |
| 6 分组及给药方法 |
| 7 标本收集、观察指标及检测方法 |
| 8 统计方法 |
| 二 实验结果与分析 |
| 1 一般情况 |
| 2生化指标 |
| 3 肾组织形态学 |
| 4 肾皮质TGF-β_1蛋白及其基因表达 |
| 5 肾皮质GLUT1蛋白及其基因表达 |
| 6 肾皮质PDGF-B蛋白及其基因表达 |
| 三 讨论 |
| 1 早期DN大鼠模型的建立 |
| 2 中医对DN的认识 |
| 3 脾气虚是DM发生的病理基础 |
| 4 脾肾亏虚是DN的病理基础 |
| 5 痰浊血瘀是DN的重要因素 |
| 6 益气养阴祛痰化瘀是治疗早期DN的基本原则 |
| 7 中药复方对DN肾脏的保护作用及其机理的探讨 |
| 四 结论 |
| 五 结语 |
| 六 参考文献 |
| 七 致谢 |
| 文献综述 |
| 综述一 中医药治疗糖尿病肾病的研究进展 |
| 1 中医病名探讨 |
| 2 病因病机认识 |
| 3 中医药治疗研究 |
| 4 中药实验研究 |
| 5 前景展望 |
| 6 参考文献 |
| 综述二 西医治疗糖尿病肾病的研究进展 |
| 1 发病机理 |
| 2 病理变化 |
| 3 早期诊断 |
| 4 临床表现 |
| 5 防治措施 |
| 6 参考文献 |
| 附照片 |
| 个人简历 |
（8）人羊膜来源上皮细胞调节主动脉内皮细胞血管生成及其分子机制的探究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:人羊膜来源上皮细胞原代提取、条件培养液浓缩物的制备及应用质谱鉴定结果预测人羊膜上皮细胞旁分泌因子及相关的信号通路 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 人羊膜来源上皮细胞原代提取及鉴定 |
| 2.2.2 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 人羊膜来源上皮细胞的原代提取及培养 |
| 3.2 人羊膜来源上皮细胞的鉴定 |
| 3.3 质谱鉴定结果 |
| 3.3.1 质谱鉴定合并Uniprot数据库搜索结果 |
| 3.3.2 血管生成相关蛋白的筛选 |
| 3.4 GO注释及富集分析 |
| 3.4.1 按生物学功能分类 |
| 3.4.2 按分子成分分类 |
| 3.4.3 按分子功能分类 |
| 3.5 KEGG信号通路分析 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分:不同浓度的人羊膜来源上皮细胞条件培养液对主动脉内皮细胞功能的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 人主动脉内皮细胞培养 |
| 2.2.2 条件培养液(Conditioned medium,CdM)的收集及浓缩物的制作 |
| 2.2.3 实验分组方法 |
| 2.2.4 不同浓度hAEC-CdM对主动脉内皮细胞增殖能力的影响 |
| 2.2.5 不同浓度hAEC-CdM对主动脉内皮细胞迁移能力的影响 |
| 2.2.6 不同浓度hAEC-CdM对主动脉内皮细胞血管生成能力的影响 |
| 2.2.7 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 hAEC-CdM促进主动脉内皮细胞增殖 |
| 3.2 hAEC-CdM促进主动脉内皮细胞迁移 |
| 3.3 hAEC-CdM促进主动脉内皮细胞的血管生成能力 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分:人羊膜来源上皮细胞条件培养液调节主动脉内皮细胞血管生成的分子机制探究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 条件培养液的收集及冻干粉的制作 |
| 2.2.2 人主动脉内皮细胞的培养 |
| 2.2.3 实验分组方法 |
| 2.2.4 Western blot |
| 2.2.5 加入抑制剂的血管生成实验 |
| 2.2.6 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 加入不同浓度hAEC-CdM刺激后的western blot结果 |
| 3.1.1 加入不同浓度hAEC-CdM刺激后ALK5和Smad3的western blot结果 |
| 3.1.2 加入不同浓度hAEC-CdM刺激后ALK1和Smad5的western blot结果 |
| 3.2 加入抑制剂后的western blot结果 |
| 3.2.1 加入SB431542后p-Smad3及其下游相关蛋白的western blot结果 |
| 3.2.2 加入K02288后p-Smad5及其下游相关蛋白的western blot结果 |
| 3.3 加入抑制剂后的血管生成实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究的创新性自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 血管再生研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）糖尿病肾病Ⅲ、Ⅳ期证候特征与益气活血方网络药理学疗效机制探讨（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 一 糖尿病肾病的中医研究进展 |
| 1 中医病因病机 |
| 2 中医辨治 |
| 3 单味药及中药单体治疗 |
| 4 中药专方治疗 |
| 5 中医外治法 |
| 二 糖尿病肾病的西医研究进展 |
| 1 DKD的发病机制 |
| 2 DKD的分期 |
| 3 DKD的诊断 |
| 4 DKD的治疗 |
| 第二章 临床研究 |
| 1 资料与方法 |
| 2 一般情况 |
| 3 实验室指标 |
| 4 中医证候情况 |
| 5 中医证型与实验室指标 |
| 6 讨论 |
| 第三章 基于网络药理学探讨益气活血方治疗糖尿病肾病Ⅲ-Ⅳ期的作用机制 |
| 研究一 益气活血方化学成分检索和筛选 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 小结 |
| 研究二 益气活血方药物靶点和早中期糖尿病肾病靶点的筛选 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 小结 |
| 研究三 益气活血方-关键靶点-早中期糖尿病肾病网络的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 小结 |
| 研究四 关键靶点生物功能注释分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 小结 |
| 讨论 |
| 1 益气活血方药物有效靶点与早中期糖尿病肾病靶点筛选 |
| 2 益气活血方有效成分 |
| 3 KEGG通路富集分析和GO分析 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、血小板源性生长因子与早期糖尿病肾病（论文参考文献）
- [1]CD26阳性外泌体与急性肾损伤的关系及机制的研究[D]. 杜鹃. 山东大学, 2021(11)
- [2]二十碳五烯酸抑制肾小管上皮细胞间质转化及纤维化的机制研究[D]. 危志强. 苏州大学, 2020(06)
- [3]我国16个重点病种的国家中医临床研究基地论文统计表（2008年～2013年）[J]. 国家中医药管理局国家中医临床研究基地办公室. 世界科学技术-中医药现代化, 2013(05)
- [4]益气活血中药治疗慢性肾衰的机理研究[D]. 韦芳宁. 广州中医药大学, 2010(09)
- [5]黄芪卫矛合剂对糖尿病肾病大鼠肾脏内皮细胞损伤的干预研究[D]. 杨敏. 北京中医药大学, 2007(02)
- [6]益气养阴祛痰化瘀中药对糖尿病肾病大鼠肾脏的保护作用及其机制研究[D]. 关欣. 辽宁中医药大学, 2006(12)
- [7]中国2型糖尿病防治指南（2020年版）[J]. 中华医学会糖尿病学分会. 国际内分泌代谢杂志, 2021(05)
- [8]人羊膜来源上皮细胞调节主动脉内皮细胞血管生成及其分子机制的探究[D]. 吴迪. 中国医科大学, 2021(02)
- [9]糖尿病肾病Ⅲ、Ⅳ期证候特征与益气活血方网络药理学疗效机制探讨[D]. 周雨桐. 中国中医科学院, 2021(02)