一、β-Adrenoceptors potentiate α_1-adrenoceptor-mediated inotropic response in rat left atria（论文文献综述）
闫莉[1]（2009）在《α1肾上腺素受体自身抗体在原发性高血压患者血清中的分布及其对血管功能的影响》文中认为研究背景高血压（hypertension, HT）是一种T多T基因遗传与环境T因素T交互作用而产生的以动脉血压升高为特征的全身性疾病，是导致其他心血管疾病的最重要的独立危险因素，已成为日益严重的公共卫生问题。长期的高压血流冲击动脉血管管壁，会引起动脉内膜机械性损伤，进而造成血脂易在动脉壁沉积，形成脂肪斑块并造成动脉硬化狭窄。加之由于全身细小动脉长期反复痉挛，特别是全身细、小动脉硬化，可造成心脏、脑、肾脏等重要脏器的缺血性病变。尽管世界范围内在高血压的预防、监测和治疗等方面有了很大的进步，但目前仍有约70%的高血压患者的血压得不到理想的控制，也不能从根本上逆转疾病的进展和最终防止其并发症的发生，提示在高血压发生发展过程中可能还有其它未知因素的参与。1994年，Fu等人在恶性高血压患者血清中发现了针对α1-肾上腺素受体细胞外第二环（α1-AR-ECII）的自身抗体（α1-AA）。随后的离体研究发现，该自身抗体可以使培养的乳鼠心肌细胞跳动频率加快以及激活L-钙通道等，表现出类激动剂样的作用。但是，与激动剂不同的是：α1-AA具有不脱敏现象，提示该自身抗体有可能使α1-肾上腺素受体（α1-AR）处于持续的激活状态。近年来的研究相继发现，α1-AR-ECII的长期作用能够诱导心肌重构和血管组织胶原沉积，使培养的血管平滑肌细胞增殖；用免疫吸附法去除高血压患者血清中α1-AA可以使患者的血压随之下降。这些结果均提示，α1-AA的过度活动可能与高血压许多重要的病理生理改变相关，并可能在高血压的发生、发展中发挥重要作用。α1-AR属于G蛋白偶联受体（GPCR），后者是人体内最大的膜受体蛋白超家族，广泛分布于全身组织器官，调节这些组织器官的生理功能。在结构上，GPCR由一条300～400个氨基酸残基构成的多肽链组成。在这些多肽链中出现7个由22-28个疏水性氨基酸组成的螺旋，反复穿透细胞膜形成了跨膜区段。连接疏水性氨基酸跨膜片段的亲水性氨基酸片段组成3个细胞外环与3个细胞内环。由于α1-AR有三个胞外环暴露在细胞外，它们均具有机会接触机体的免疫系统。那么，除α1-AR-ECII外，其它两个胞外环是否也能具有相应的免疫原性，进而刺激机体产生相应的自身抗体？如果有，这些自身抗体是否有其相应病理生理意义呢？到目前为止，对α1-AR细胞外第一和第三环自身抗体的研究尚未报道，也没有该类抗体与患者血压及靶器官损害关系的研究，而对这一问题的研究是判别α1-AA在高血压发病中作用的前提。尽管α1-AR广泛分布于人体各组织器官，介导了目前已知α1-AR的所有作用（如血管收缩、心肌收缩力、心肌肥厚和重构、刺激血管平滑肌细胞增殖等），但α1-AR在脉管系统的分布最为集中，作用也尤为突出。那么，具有类激动剂样作用的α1-AA是否也可以与血管平滑肌上的相应受体（α1-AR）结合，进而产生相应的收缩效应呢？如果是，那么长期高水平的α1-AA是否象α1-AR激动剂那样，也具有致血管病变的病理意义呢？已有的研究报道（包括我们的前期工作）揭示了α1-AA对心脏和血管平滑肌的直接、短期作用，如果能够进一步揭示α1-AA对各类血管（尤其是阻力血管）的直接作用，将会为我们深入认识α1-AA在高血压发生发展中的作用和机制，同时也为判断不同人群血清中存在α1-AA的病理生理学意义提供科学的实验依据。α1-AR除分布在血管平滑肌外，还广泛分布在血管内皮细胞，后者在调节血管收缩和舒张功能中具有重要的作用。血液中的α1-AA在血管内流动时，是否可以与血管内皮细胞上的α1-AR结合呢？如果可以，这种结合有可能产生什么样的作用呢？已知，过度的α1-AR激活会导致血管内皮细胞损伤。那么，具有类激动剂样作用的α1-AA是否也有可能导致类似的损伤呢？众所周知，当血管内皮细胞受损后，会导致流经损伤部位的血液中诸多血管活性物质的聚集（如血小板、凝血因子等）进而引发随后的释放反应，从而导致动脉血管管壁一系列的病理改变，如粥样硬化斑块的形成。然而，导致这种血管内皮细胞病理改变的机制尚不完全清楚。因此，如果能够通过直接的实验证据说明α1-AA有可能参与了血管内皮细胞的损伤将有助于认识α1-AA在原发性高血压发病过程中血管病变的机制。综上所述，我们设计了本研究课题：（1）采用ELISA方法，筛查原发性高血压患者和血压正常人群血清中针对α1-AR三个细胞外环抗肽抗体的分布情况，并分别分析这三种抗体水平和患者血压的相关性，以初步推测该三种自身抗体可能的临床意义。（2）通过上述实验，寻找出与患者血压相关的抗体类型，并通过离体实验技术，观察这些自身抗体对正常或高血压大鼠的大血管和微血管功能的直接作用及其可能的机制。具体内容如下：①用大血管环和微血管环技术，观察该类自身抗体对大鼠胸主动脉、主要脏器的小动脉（包括冠状动脉、大脑中动脉和肾动脉）、主要阻力血管（肠系膜动脉）等的直接作用；②通过细胞内静息钙离子测定技术，观察该类自身抗体对培养的血管平滑肌细胞内钙离子水平的影响；③利用自发性高血压大鼠（Spontaneously hypertensive rats, SHR）和其天然对照鼠（Wistar-Kyoto rats, WKY）模型，观察该类自身抗体对正常血压或高血压大鼠的血管收缩作用有何不同，并试图探讨血管内皮细胞和NO在其中发挥的调节机制；④通过细胞培养技术，在离体情况下观察该类自身抗体对内皮细胞的直接作用。通过这部分研究，拟观察该类自身抗体对血管平滑肌细胞、内皮细胞以及离体血管环的直接效应，以及在高血压状态时内皮细胞和NO对血管收缩的影响；（3）以在体动脉血压为切入点，用急性或慢性动物模型的方法，观察该类抗体对大鼠血压的直接或长期影响；通过血管环张力测定技术，观察在体情况下α1-AA的长期作用对大鼠血管收缩和舒张活动的影响；以血清中内皮素含量为指标，观察在该类抗体长期存在下对在体血管内皮的损伤作用（另题研究该类抗体长期作用对血管平滑肌细胞的功能和形态学影响），以期阐明α1-AA在高血压的发生发展过程中参与了致血管结构和功能损伤的可能性及其防治的意义。本课题拟验证的假说：原发性高血压患者血清中存在的α1-AA，有可能通过影响血管结构和功能而与高血压发生发展相关：（1）在原发性高血压患者血清中的α1-AA与患者的血压呈一定的相关性；（2）在离体情况下，α1-AA对大血管具有直接的收缩效应，但对不同重要的组织器官小阻力血管可能表现各不相同；SHR大血管对α1-AA的敏感性可能有所改变，其机制可能与血管内皮细胞受损和NO的生物利用度改变有关；α1-AA本身可能通过与血管内皮细胞上的相应受体结合，从而导致血管内皮细胞的直接损伤；（3）在体情况下，α1-AA对动脉血压的影响可能比较复杂，但α1-AA的长期作用可能会诱导大鼠血管对收缩剂的刺激敏感，舒张功能减弱，同时引起血管内皮细胞损伤。所有这些结构和功能变化可能与原发性高血压患者所表现的血压升高、组织器官血流量下降以及和其它病理学改变密切相关。一、原发性高血压患者血清中α1肾上腺素受体自身抗体的检测及其免疫学特征分析目的本研究分别以合成的人α1-AR细胞外第一环、第二环、第三环作为抗原肽段，采用酶联免疫吸附测定（ELISA）技术，检测原发性高血压患者以及血压正常的健康人群血清中抗α1-AR细胞外第一环自身抗体（anti-α1-ECI）、抗α1-AR细胞外第二环自身抗体（anti-α1-ECII）以及抗α1-AR细胞外第三环自身抗体（anti-α1-ECIII）的分布情况，以证实哪一种α1-AR的细胞外环有可能成为免疫反应靶位，及其在原发性高血压患者血清中的分布规律和可能的意义。方法1.检测对象：（1）原发性高血压患者73例，年龄48-71岁，高血压的诊断符合1999年世界卫生组织制定的高血压诊断标准，即收缩压≥140mmHg和/或舒张压≥90mmHg，人工采用水银柱血压计测定血压。以上患者均排除继发性高血压、急性或慢性肾脏疾病、内分泌和自身免疫性疾病以及严重威胁生命的疾病。患者接受1-2种抗压药物的治疗（包括利尿剂，β肾上腺素受体拮抗剂，钙离子拮抗剂，血管紧张素受体拮抗剂以及血管紧张素转换酶抑制剂），但未使用α1肾上腺素受体的拮抗剂作为降压治疗药物。（2）血压正常的健康体检者86例，年龄45-68岁，作为正常血压对照人群，90mmHg <收缩压<140mmHg，并且60mmHg<舒张压<90mmHg。两组人群的临床资料见表1。入选者均于空腹12h后采集静脉血液并及时分离血清置于-20℃保存。2.α1-AR细胞外三环抗原多肽的合成：按照人α1-AR细胞外第一环、第二环和第三环肽段序列（表2），由西安联美生物科技有限公司合成，肽段纯度大于95%。合成的肽段储存于-20℃备用，用于后续血清抗体的定性、定量和血清抗体的功能测定。3.血清自身抗体水平的测定：采用间接SA-ELISA（Streptavidin-ELISA）方法测定血清自身抗体的水平，以反应孔的光密度值（OD）的大小代表人血清中α1-AA的含量。结果判定：以P/N≥2.1为阳性，P/N= （标本OD值-空白对照OD值）/（阴性对照OD值-空白对照OD值）；将血清标本从1:20起连续倍比稀释，以出现P/N≥2.1的最高稀释度作为该标本的效价。4.统计处理：α1-AA在不同组间的分布用阳性率表示；每组抗体水平的平均值用几何平均数（geometric mean）来表示；用U检验进行两样本阳性率的差别检验；两几何均数之间的差别检验用t检验；几何均数的检验用经对数转换后的数据进行。P值小于0.05认为有显着差异。结果1.针对α1-AR细胞外第一、二、三环的自身抗体在原发性高血压患者及正常血压人群血清中的分布情况。1.1三种自身抗体的阳性率：原发性高血压患者的血清中anti-α1-ECI抗体的阳性率为32.6 %，显着高于86例血压正常的健康受试者血清中的阳性率（8.7 %，P<0.01）；高血压患者anti-α1-ECII抗体的阳性率为34.2 %，显着高于血压正常的健康受试者（10.4 %，P<0.01）,而anti-α1-ECIII抗体的阳性率在两人群之间无明显差异（2.7 % vs. 3.5%，P>0.05）（见图1）。以上结果表明，原发性高血压患者血清中anti-α1-ECI和anti-α1-ECII的抗体分布特征呈高阳性率、高抗体滴度，提示这两种抗体可能与高血压的病理生理机制相关。1.2三种自身抗体在血清中的含量：以反应孔的光密度值（OD）的大小代表人血清中α1-AA的含量发现，正常血压人群血清中anti-α1-ECI抗体水平（0.12±0.02）与anti-α1-ECII抗体水平（0.14±0.03）和anti-α1-ECIII（0.15±0.03，P<0.01）三者之间均没有明显差异；在原发性高血压患者anti-α1-ECI（0.26±0.08）和anti-α1-ECBIIB的抗体水平（0.30±0.12）均明显高于anti-α1-ECIII的抗体（0.16±0.05）（见图2）。1.3三种自身抗体的效价：原发性高血压患者anti-α1-ECI抗体阳性血清和anti-α1-ECII抗体阳性血清的抗体效价为1:148.6±6.7和1:168.6±6.7，分别高于血压正常的健康受试者血清中相应的抗体效价（分别为1:52.9±2.1和1:16.2±1.8, P<0.01）；而原发性高血压患者anti-α1-ECIII抗体的滴度与正常血压人群无统计学差异（图3）。2.原发性高血压患者和血压正常的健康受试者血清中α1-AA水平与血压的相关性分析原发性高血压患者和血压正常的健康受试者血清中anti-α1-ECII抗体的水平随收缩压和舒张压的增高而呈上升趋势（图4，图5）：相关性分析结果表明血压与人群中抗体水平（包括高血压患者和血压正常人群）呈正相关（收缩压: RP2P= 0.25, P< 0.01;舒张压: RP2P= 0.51, P< 0.01）；而原发性高血压患者和血压正常的健康受试者血清中anti-α1-ECI的抗体水平与收缩压合舒张压之间则无相关性（P>0.05，图6，图7）。以上结果提示，原发性高血压患者血清中anti-α1-ECII抗体水平随患者收缩压和舒张压的增高而呈上升趋势，提示血清中anti-α1-ECII抗体的水平与高血压呈现正相关关系。3.原发性高血压患者的用药情况对anti-α1-ECII抗体产生的可能影响对原发性高血压患者的用药情况进行分析的结果表明，anti-α1-ECII抗体阳性和阴性两组患者的用药情况并没有明显的差异（表3）。该结果提示不同种类抗压药物的使用并没有影响anti-α1-ECII的抗体的产生。小结1.本研究结果证实，在原发性高血压患者血清中存在有anti-α1-ECI和anti-α1-ECII的抗体，这两类自身抗体的分布特征呈高阳性率、高抗体滴度，提示这两种抗体可能和高血压的病理生理机制具有一定的关联性；2.在三种细胞外环的抗原多肽中，只有针对细胞外第二环肽段产生的自身抗体与机体的血压水平相关。3.根据73例高血压患者的临床用药情况分析表明，不同种类抗压药物的使用并没有影响anti-α1-ECII的抗体的产生。然而，我们仍需增加临床病例数来进一步证实这一结果。目的1.采用大血管环张力测定技术，观察抗α1肾上腺素受体细胞外第二环抗体（α1-AA）对大鼠容量血管收缩功能的作用，分析该自身抗体对患者血压的影响；采用微血管环技术，观察α1-AA对主要脏器的小血管（包括冠状动脉、大脑中动脉和肾动脉）和外周阻力血管（肠系膜动脉）的直接作用，明确该自身抗体对患者主要脏器和外周阻力血管功能的影响；2.采用血管平滑肌细胞原代培养技术，观察α1-AA对血管平滑肌细胞静息钙离子水平的影响，以明确该抗体致血管收缩的可能机制；3.利用大血管环技术，观察α1-AA对SHR和其天然对照WKY大鼠胸主动脉收缩作用的特点，以及内皮细胞和NO在收缩作用的影响，明确高水平的α1-AA在原发性高血压患者血清中存在的意义，并试图探索其可能机制；4.采用细胞培养技术，观察α1-AA对离体培养的内皮细胞的直接损伤效应及其致内皮细胞损伤的途径，阐明α1-AA在高血压致血管损伤的可能性及其防治的意义。方法1.α1-AA的纯化和鉴定：利用MAb Trap Kit试剂盒对原发性高血压患者抗体阳性者血清中的抗体IgG进行提取和纯化。纯化后的抗体经SDS-PAGE胶凝胶电泳检测其纯度（图8），经BCA法进行蛋白定性（图9）。其中，对阳性血清中的抗体IgG进行提取获得的IgG为P-IgG（Positive IgG），作为后续研究的药物；从血压正常的健康受试者阴性血清中提取的IgG为N-IgG（negative IgG），作为阴性对照。2.采用离体胸主动脉环张力测定技术检测α1--AA对大血管收缩功能的影响：实验分为以下6组：（1）自身抗体阳性组（positive IgG, P-IgG）；（2）去氧肾上腺素（phenylephrine, PE）作为阳性对照组；（3）自身抗体阴性组（negative IgG, N-IgG）作为阴性对照组；（4）positive IgG + prazosin（α1-肾上腺素受体选择性拮抗剂）组；（5）positive IgG+α1-Ag（α1肾上腺素受体细胞外第二环表位肽段）组；（6）α1-Ag（α1肾上腺素受体细胞外第二环表位肽段）组。3.采用为血管环张力测定技术观察α1-AA对大鼠肾动脉、大脑中动脉、冠状动脉和肠系膜动脉收缩功能的影响，分组情况同2；4.大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞原代培养，并利用免疫荧光细胞技术对其种类和纯度进行鉴定；5.利用激光共聚焦显微镜以及CaP2+P的荧光指示剂Fluo-3/AM观察α1-AA对平滑肌细胞胞内静息钙水平的影响，分组情况同2；6.利用人脐静脉内皮细胞的培养技术，观察α1-AA对内皮细胞的直接损伤作用，分组情况同2；7.收集各处理组的内皮细胞，采用Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的活性测定法检测内皮细胞的凋亡发生情况；8.采用LDH酶活性测定法观察内皮细胞的坏死程度；9.采用吖啶橙/碘化丙啶（AO/PI）染色法和单细胞凝胶电泳观察培养的内皮细胞凋亡率；10.采用单细胞凝胶电泳观察培养的内皮细胞DNA损伤程度。结果1.α1-AA对离体血管环张力的直接收缩作用1.1α1-AA剂量依赖性地引起大鼠胸主动脉的收缩：α1-AA能浓度依赖性地增强大鼠胸主动脉血管环的最大收缩张力，0.01、0.1和1.0μM的α1-AA可使大鼠胸主动脉血管环的收缩张力的增加值从对照组的0.07±0.04（g）分别增加到0.22±0.04（g）、0.85±0.11（g）和1.83±0.17（g），其作用与α1肾上腺素受体选择性激动剂phenylephrine（PE）相似，与之不同的是，α1-AA的作用维持了2小时以上，表现为不脱敏现象；1.0μM的prazosin可以有效地拮抗α1-AA对血管环收缩张力的影响；3.0μM的α1-Ag预孵后能有效的中和α1-AA的作用，而N-IgG对胸主动脉的收缩无影响（图10，图11）。1.2α1-AA引起不同部位微血管收缩的影响1.2.1 1.0μMα1-AA对不同阻力血管的收缩效应1.0μMα1-AA对肾动脉、大脑中动脉和冠状动脉的收缩作用可以被1.0μM的prazosin或3.0μM的α1肾上腺素受体细胞外第二环表位肽段（α1-Ag）中和。1.0μM的prazosin或3.0μM的α1-Ag预孵育可以使1.0μM的α1肾上腺素受体抗体引起的肾动脉的收缩增加值从3.52±0.14 mN降低到0.37±0.07mN和0.38±0.15 mN（图12A，n=6-10）；1.0μM的prazosin或3.0μM的α1-Ag预孵育可以使1.0μM的α1肾上腺素受体抗体引起的大脑中动脉的收缩从0.79±0.11 mN降低到0.12±0.06 mN和0.11±0.07 mN（图12B，n=6-10）；1.0μM的prazosin或α1-Ag可以使1.0μM的α1肾上腺素受体抗体引起的冠状动脉的收缩从0.67±0.05 mN降低到0.08±0.03 mN和0.06±0.02 mN（图12C，n=6）；N-IgG对各部位的血管均无明显的收缩作用。1.2.2α1-AA浓度依赖性收缩肾动脉、大脑中动脉和冠状动脉如图12D所示，0.01、0.1和1.0μM的α1-AA可使大鼠肾动脉的收缩张力的增加值分别为0.25±0.02 nM、1.45±0.10 mN和3.52±0.14 mN；大鼠大脑中动脉的收缩张力增加值分别为0.15±0.04 mN，0.45±0.07 mN和0.79±0.11mN；引起大鼠冠状动脉的收缩张力的增加值分别为0.13±0.03 nM、0.34±0.04 mN和0.67±0.05 mN。PE的作用和α1-AA相似，同时N-IgG对各来源的血管环张力没有明显变化。而对肠系膜动脉的收缩作用不明显。以上结果表明，α1-AA浓度依赖性的增强大鼠胸主动脉以及来源于重要脏器的微血管的收缩，提示该抗体可能通过增加心肌收缩后负荷，进而影响心脏泵血功能的调节，并可能在高血压患者重要脏器的缺血性改变发挥重要作用。然而，α1-AA对肠系膜动脉的收缩作用不明显，这一现象仍然需要进一步验证。为阐明血管平滑肌细胞在α1-AA致收缩作用中的机制，我们进行了后续实验。2.α1-AA对培养的血管平滑肌细胞胞内游离钙水平的影响与对照组相比，1.0μM phenylephrine均可以引起培养的血管平滑肌胞内CaP2+P水平明显增加；与之类似，1.0μMα1-AA也可以明显增加胞内CaP2+P水平，并且维持时间较phenylephrine更长，表现为不脱敏现象；该作用可以被1.0μM的prazosin或3.0μM的α1-Ag所阻断。而N-IgG对胞内钙离子水平没有明显的影响（图15，n=5）。以上结果表明，α1-AA可以增加血管平滑肌细胞胞内CaP2+P的水平，可能是其导致大鼠离体血管收缩的重要机制。3.α1-AA对自发性高血压大鼠（SHR）及其天然对照WKY离体血管收缩的特点以及内皮和NO在其中的作用。3.1α1-AA（1.0 nM-10P PμM）可以浓度依赖性地收缩WKY和SHR的离体胸主动脉环；与WKY大鼠相比，α1-AA对SHR的血管收缩作用更为明显（图16，n=5），同时观察到，SHR大鼠立体胸主动脉环内皮依赖性舒张明显降低（图17，n=5）；3.2与内皮完整的胸主动脉环相比，去除内皮后α1-AA对WKY和SHR的离体胸主动脉环的收缩作用均进一步增强（图18，n=5）；3.3在内皮完整的情况下，利用1.0μM的NO合成阻断剂L-NAME非特异性阻断NO后，α1-AA对WKY和SHR来源的胸主动脉环的收缩作用均进一步增强（图19A和19B，n=5），而iNOS的特异性阻断剂1400W仅增强了α1-AA对WKY大鼠离体胸主动脉的收缩作用，却没有改变对SHR的血管作用（图19C和19D，n=5）。以上结果表明，血管内皮细胞以及NO均在α1-AA致血管收缩作用中发挥着负性调节作用。在SHR中，由于血管内皮细胞功能受损以及NO的生物利用度降低导致这种保护作用降低，α1-AA的缩血管作用明显增强，提示高水平的α1-AA存在于原发性高血压患者血清中可能具有更为重要的病理学意义。4.α1-AA对内皮细胞损伤的影响4.1不同剂量α1-AA引起内皮细胞LDH活性的变化：本结果表明，1.0μM的α1-AA与内皮细胞孵育24h后显着的引起LDH活性的增高（与阴性对照组相比约增加了3.5倍，P<0.01），但0.01μM的α1-AA对LDH的活性无显着性的影响（图21A，n=8）。4.2不同剂量α1-AA引起内皮细胞caspase激活的情况：除坏死外，凋亡是细胞损伤的另一方式，为进一步观察α1-AA对内皮细胞的作用，我们检测了α1-AA作用于离体培养的内皮细胞后多种caspase的活性。结果表明，0.01，0.1和1.0μMα1-AA作用内皮细胞24h后，caspase3和caspase8的活性均呈浓度依赖性增高，与N-IgG组相比均有显着性差异（caspase3的活性分别为1.28±0.17 mmol/h/mg protein，1.85±0.09 mmol/h/mg protein和2.87±0.11 mmol/h/mg protein；caspase8的活性分别为0.25±0.03 mmol/h/mg protein，0.40±0.05 mmol/h/mg protein和0.58±0.03 mmol/h/mg protein），α1-AA引起的caspase活性的增高可以通过预先用prazosin或α1肾上腺素受体细胞外第二环特异性肽段孵育而消失（图22A和23A，表4，n=8-10）；α1-AA对caspase9的活性却无明显的作用。4.3 1.0μM的α1-AA在不同时间点引起内皮细胞损伤的研究1.0μM的α1-AA可以时间依赖性的引起内皮细胞的坏死：我们的研究已经证实α1-AA在1.0μM的浓度可以引起细胞明显的损伤，因此，我们采用这个浓度来观察不同时间点α1-AA对细胞损伤的影响。结果表明，LDH的活性在12h开始升高，且呈时间依赖性，24h时达到最高点，与6h相比，LDH在24h时的活性增加了约3.5倍（图21B，n=8），并且此种效应能够通过与prazosin以及细胞外第二环的特异性肽段孵育而消失。4.4 1.0μM的α1-AA在不同时间点对caspase活性的影响：Caspase3在12 h开始增高（从1.08±0.14 nmol/h/mg protein增加到1.40±0.08 nmol/h/mg protein，P<0.01），24h达到高峰（从1.08±0.14 nmol/h/mg protein增加到2.87±0.11 nmol/h/mg protein，P<0.01）（图22B，n=6）；caspase8从12 h开始增高（从0.17±0.04 nmol/h/mg protein增加到0.37±0.03 nmol/h/mg protein，P<0.01），24 h达到峰值（从0.17±0.04 nmol/h/mg protein增加到0.58±0.03 nmol/h/mg protein，P<0.01），二者的活性均可以维持到48 h（分别为2.89±0.14 nmol/h/mg protein和0.57±0.02 nmol/h/mg protein），且高于阴性对照组（分别为caspase3: 1.26±0.10 nmol/h/mg protein和0.21±0.02nmol/h/mg protein，P<0.05）（图23B，n=6）；α1-AA引起caspase3和8活性增高的效应能够通过与prazosin或细胞外第二环的特异性肽段孵育而消失；caspase9的活性在各组之间均无明显的差异（图24）。4.5α1-AA对培养的内皮细胞凋亡的AO/PI染色结果以及DNA损伤的程度：AO/PI染色结果显示，与α1-AA阴性组相比，PE组和α1-AA阳性组均可以明显增加培养的内皮细胞的凋亡指数（分别为15.28±1.08和12.83±1.19 vs. 2.92±0.57，P<0.01），该作用可以被1.0μM prazosin所阻断（4.85±0.82）（图25，n=5）。单细胞凝胶电泳的结果表示，PE组和α1-AA阳性组均可以明显增加培养的内皮细胞慧尾值（分别为17.23±1.491和5.42±1.28 vs. 1.59±0.29，P<0.01），且该作用同样可以被1.0μM的prazosin孵育（2.02±0.54）所阻断（图26，n=5）。以上结果提示，α1-AA通过可以通过坏死和凋亡（尤其是外源性途径）两种方式，直接引起血管内皮细胞的损伤。小结1.α1-AA浓度依赖性的增强大鼠胸主动脉的收缩，提示该抗体可能通过增加心肌收缩后负荷，进而影响心脏泵血功能的调节；2.α1-AA通过激活α1-AR细胞外第二环，浓度依赖性地增强大鼠肾动脉、大脑中动脉和冠状动脉的收缩，但对肠系膜动脉的收缩作用不明显。3.α1-AA可以增加血管平滑肌细胞胞内CaP2+P的水平，可能是其导致大鼠离体血管收缩的主要机制。4.血管内皮细胞以及NO均在α1-AA致血管收缩作用中发挥着负性调节作用。在SHR中，由于血管内皮细胞功能受损以及NO的生物利用度降低导致这种保护作用降低，α1-AA的缩血管作用明显增强，提示高水平的α1-AA存在于原发性高血压患者血清中可能具有更为重要的病理学意义。5.α1-AA通过可以通过坏死和凋亡（尤其是外源性途径）两种方式，直接引起血管内皮细胞的损伤。目的1.在体情况下，通过静脉给药的途径观察α1-AA对大鼠在体血压的急性作用；2.使用人工合成的α1-AR-ECII肽段免疫α1-AA阴性的正常大鼠，建立主动免疫动物模型，观察该抗体的长期作用对在体血压以及离体大鼠血管舒缩功能的影响；以及对内皮细胞损伤情况及其可能的机制；阐明α1-AA参与高血压致血管病理改变的可能性及其防治的意义。方法1.选择雄性Wistar大鼠（200-220 g），通过右侧颈总动脉插管技术和静脉给药方式测定α1-AA对大鼠在体血压急性作用，分组情况为：（1）N-IgG组（1μmol/kg体重）；（2）P-IgG组（1μmol/kg体重）；（3）prazosin+P-IgG组（α1-AA给药前30min给予哌唑嗪1.96μmol/kg体重，α1-AA 1μmol/kg体重）。2.将α1-AA阴性、体重180-220g的健康Wistar雌性大鼠随机分成两组：（1）α1-AR-ECII免疫组（Immunization group），将抗原α1-AR-ECII（按照大鼠α1-AR细胞外第二环功能表位肽段序列165-191位）溶于生理盐水溶液中。首次免疫采用背部皮下多点注射法（注射剂量：0.4μg/g体重），1周后采用背部皮下一点注射法进行第一次加强免疫。此后每隔两周用同样的方法加强免疫一次，共免疫8个月。（2）伪免疫组（Sham Immunization group），用等量生理盐水溶液替代抗原溶液，给药方法、免疫程序以及免疫增强剂的使用均同免疫组。3.采用间接SA-ELISA（Streptavidin-ELISA）方法测定血清自身抗体的水平，检测条件及结果判定方法同第一部分：4.利用鼠尾动脉血压仪定期观察长期主动免疫对各组大鼠血压的影响；5.利用离体胸主动脉环张力测定技术检测各组大鼠离体血管舒张和收缩反应的变化；6.采用定量ELISA试剂盒测定不同时间点大鼠血清中内皮素-1的含量，以反应各组大鼠内皮损伤情况和趋势；7.利用免疫组织化学技术检测各组大鼠胸主动脉iNOS的表达情况。结果1.α1-AA对正常大鼠在体平均动脉压的急性作用α1-AA（1P Pμmol/kg体重）可以明显增加大鼠平均动脉压，在给药后30min达到高峰，然后逐渐降低，直到2h恢复到基线。这一升压作用可以被prazosin （1.96P Pμmol/kg体重）所阻断，而阴性抗体给药组没有明显的血压改变（图27）。2.长期主动免疫对大鼠血压的影响2.1长期主动免疫大鼠血清中α1-AA水平的变化α1-AR-ECII首次免疫前，免疫对照组和α1-AR-ECII免疫组大鼠血清中α1-AA的抗体水平分别为0.06±0.01和0.07±0.02，加强免疫后α1-AR-ECII免疫组（n=24）的抗体水平开始升高，并在免疫后3个月时达平台，其抗体水平为2.15±0.28，随后维持一较高水平；伪免疫组（n=26）大鼠血清中α1-AA的平均抗体滴度始终保持在较低水平（图28）。这一结果表明，主动免疫动物模型制备成功。2.2长期主动免疫大鼠血压的监测在长达8个月的主动免疫过程中，与主动免疫前相比，免疫对照组和免疫组大鼠的血压和心率均没有明显的变化，并且两组之间的血压和心率在各个时间点也没有统计学差异（图29）。以上结果提示，在体情况下，α1-AA可以引起大鼠血压急性增高；而在α1-AA的长期作用下，大鼠血压并没有明显的变化，这一现象可能与大鼠通过自身对血压的调节有关。3.长期主动免疫对血管功能和结构的影响3.1大鼠胸主动脉的收缩及舒张功能的影响结果显示，免疫6周和8周时，α1-AR-ECII免疫组大鼠血管内皮依赖性舒张功能显着下降，与同期伪免疫组相比有显着性差异（P<0.05）（图30）；同时，大鼠的血管对血管收缩剂的敏感性有有显着增加（图31）。这一结果更加确证了我们的假设：在α1-AA长期作用下，血管内皮细胞舒缩的功能均受到严重影响。3.2长期主动免疫对大鼠血清中内皮素-1（ET-1）水平的影响为了验证我们的假设，即α1-AA长期作用下，可以导致内皮细胞的损伤，我们检测了免疫大鼠血清内皮素-1（ET-1）的浓度，结果证实，α1-AR-ECII免疫组大鼠免疫后第4个月开始血清中ET-1含量增高，第6个月时达高峰，与对照组相比有显着性差异（161.48±16.93 pg/ml vs. 104.63±14.31 pg/ml，P<0.01）（图32）。ET-1由内皮细胞合成分泌，存在于正常的组织中，但在内皮受损时，ET-1的合成和分泌增加，因此，ET-1水平的升高在很大程度上反应了内皮受损的程度。因此，我们推测，α1-AA能引起在体血管内皮的损伤。以上结果提示α1-AA的长期作用虽然并未对大鼠整体血压产生影响，但已经对血管的舒缩功能和内皮细胞损伤产生了一定的影响。4.长期主动免疫对大鼠血管组织中iNOS表达的影响免疫组化检测的结果显示，α1-AR-ECII免疫组大鼠免疫后8个月血管内皮可见典型的iNOS染色，而免疫对照组为阴性，α1-AR-ECII免疫组大鼠iNOS的表达明显增强（图33）。研究表明，由iNOS产生的病理浓度NO可以通过生成活性氮代谢物（Reactice Nitrogen Species，RNS），尤其是硝基化作用很强的过氧亚硝基（peroxynitrite，ONOOP-P）分子导致硝基化应激（nitrative stress）和组织损伤。因此，我们推测，α1-AA长期存在的情况下，可能通过引起iNOS表达增加，从而产生病理浓度的NO，最终导致内皮细胞的损伤。以上结果提示，在α1-AA长期作用下，还可以使大鼠血管内皮iNOS的表达显着增强，提示α1-AA在致血管内皮损伤的机制中可能与NO生理功能异常有关。小结1.在体情况下，α1-AA可以引起大鼠血压急性增高；而在α1-AA的长期作用下，大鼠血压并没有明显的变化。2.α1-AA的长期作用可以引起大鼠血管离体情况下对收缩药物的敏感性增强；3.α1-AA的长期作用可以引起大鼠内皮细胞的损伤，并且大鼠内皮依赖性舒张血管功能显着降低；4.α1-AA长期作用下，还可以使大鼠血管内皮iNOS的表达显着增强，提示α1-AA在致血管内皮损伤的机制中可能与NO生理功能异常有关。
王森[2]（2009）在《α1、β肾上腺素受体调控快激活延迟整流钾电流的机制》文中研究表明背景室性心律失常往往继发于运动和情绪激动等交感神经兴奋的情况下,循环及组织局部儿茶酚胺浓度的增高改变了心肌细胞离子通道的特性,是导致恶性室性心律失常发生的重要原因。心肌细胞膜上分布着大量离子通道,作为参与心肌细胞动作电位的主要电流,快激活延迟整流钾电流I<sub>kr是心肌细胞复极化的主要电流,它的抑制可使动作电位时程延长。编码人类快激活延迟整流钾电流α亚单位的基因为hERG基因,该通道的基因突变导致的I<sub>kr电流减少是遗传性长QT综合征-2（LQTS-2）的发病因素。另外,hERG基因是临床广泛应用的I<sub>I<sub>I<sub>类抗心律失常药物的作用靶点之一。许多抗心律失常药物及非抗心律失常药物对hERG通道的过度抑制是获得性长QT综合征的主要发病机制。由运动或情绪激动引起的交感神经兴奋激活心肌细胞的α和β肾上腺素受体。目前至少有9种肾上腺素受体已被明确:α1A、α1B、α1D、α2A、α2B、α2C、β1、β2及β3。人类心肌细胞上主要为α1及β肾上腺素受体,近期研究表明α1和β肾上腺素受体激活后可调控hERG/I<sub>kr电流的大小,但α1及β肾上腺素受体通过何种亚型调控hERG/I<sub>kr电流以及确切的调控机制尚需进一步的研究来阐明。目的采用全细胞膜片钳技术研究α1和β肾上腺素受体及其亚型对豚鼠心室肌细胞快激活延迟整流钾电流的调控及可能的机制,探讨应激触发室性心律失常发生的机制。内容与方法1.成年豚鼠心室肌细胞的分离:雄性豚鼠,体重250-300g,采用Langendorff灌流装置逆行灌流心脏,酶解分离出单个心室肌细胞。2.豚鼠心室肌细胞快激活延迟整流钾电流（I<sub>kkr）的记录:分离出的细胞悬液置于细胞池中,采用全细胞方式膜片钳技术记录豚鼠心室肌细胞的快激活延迟整流钾电流。膜片钳参数为:钳制电压-40mv,预刺激从-40mv至+40mv,脉宽200ms,刺激从相应电压降至-40mv,脉宽600ms,记录I<sub>kr尾电流。3.α1肾上腺素受体激活对豚鼠心室肌细胞I<sub>kkr电流的调控:3.1.α1肾上腺素受体激活对I<sub>kkr电流的影响:持续灌流含有选择性α1肾上腺素受体激动剂苯肾上腺素（0.0001μmol/L-100μmol/L）的细胞外液,记录苯肾上腺素灌流前后的I<sub>kr电流。分别由灌流系统持续灌流含有哌唑嗪（α1肾上腺素受体阻断剂）或5-甲基乌拉地尔（α1A肾上腺素受体阻断剂）或chlorethylclonidine（α1B肾上腺素受体阻断剂）或BMY7378（α1D肾上腺素受体阻断剂）的细胞外液;再给予苯肾上腺素干预,记录苯肾上腺素灌流前后的I<sub>kr电流。3.2.蛋白激酶A和蛋白激酶C在α1肾上腺素受体激动剂影响I<sub>kkr电流中的作用:分离出的单个心室肌细胞室温分别与特异性蛋白激酶A（PKA）抑制剂KT5720（2.5μmol/L）或特异性蛋白激酶C（PKC）抑制剂chelerythrine（1μmol/L）共同孵育1小时后灌流含有苯肾上腺素的细胞外液,记录苯肾上腺素灌流前后的I<sub>kr电流。4.β肾上腺素受体激活对豚鼠心室肌细胞I<sub>kkr电流的调控:4.1.β肾上腺素受体激活对I<sub>kkr电流的影响:持续灌流含有非选择性β肾上腺素受体激动剂异丙肾上腺素（0.001μmol/L-100μmol/L）的细胞外液,记录异丙肾上腺素灌流前后的I<sub>kr电流。分别由灌流系统持续灌流含有普萘洛尔（β肾上腺素受体阻断剂）或CGP20712A（β1肾上腺素受体阻断剂）或I<sub>CI<sub>118551（β2肾上腺素受体阻断剂）的细胞外液;再给予异丙肾上腺素干预,记录异丙肾上腺素灌流前后的I<sub>kr电流。4.2.β1肾上腺素受体激动剂对I<sub>kkr电流的影响:持续灌流含有选择性β1肾上腺素受体激动剂扎莫特罗（0.01μmol/L-100μmol/L）的细胞外液,记录扎莫特罗灌流前后的I<sub>kr电流。4.3.蛋白激酶A、蛋白激酶C、磷脂酶C和钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶在β1肾上腺素受体激动剂影响I<sub>kkr电流中的作用:分离出的单个心室肌细胞分别用特异性PKA抑制剂KT5720（2.5μmol/L）或特异性PKC抑制剂chelerythrine（1μmol/L）或特异性PLC抑制剂U73122（100nmmol/L）孵育1小时或特异性CaMKI<sub>I<sub>抑制剂KN93（10μmol/L）孵育30小时,灌流含有扎莫特罗的细胞外液,记录扎莫特罗灌流前后的I<sub>kr电流。5.α1和β肾上腺素受体在调控I<sub>kr电流中的交互作用5.1.急性激活α1肾上腺素受体对β肾上腺素受体激动剂调控I<sub>kkr电流的影响:先灌流含有苯肾上腺素的细胞外液10min,记录苯肾上腺素灌流前后的I<sub>kr电流;再灌流含有异丙肾上腺素的细胞外液10min,记录异丙肾上腺素作用后的I<sub>kr电流。5.2.急性激活β肾上腺素受体对α1肾上腺素受体激动剂调控I<sub>kkr电流的影响:先灌流含有异丙肾上腺素的细胞外液10min,记录异丙肾上腺素灌流前后的I<sub>kr电流。再灌流含有苯肾上腺素的细胞外液10min,记录苯肾上腺素作用后的I<sub>kr电流。结果1.豚鼠心室肌细胞I<sub>kkr电流的记录:用全细胞膜片钳技术可记录到豚鼠心室肌细胞的I<sub>kr尾电流,该电流可被1μmol/L的多非立特完全阻断。I<sub>kr电流受温度影响,当灌流槽温度由22℃逐渐升高至37℃,I<sub>kr电流亦逐渐增大。当预刺激电压为+40mV时,I<sub>kr电流电流密度由22℃时的0.28±0.07pA/pC增加到37℃时的0.62±0.07pA/pC。2.α1肾上腺素受体激活对豚鼠心室肌细胞I<sub>kkr电流的调控:2.1.α1肾上腺素受体及其亚型对豚鼠心室肌细胞I<sub>kr电流的影响:选择性α1上腺素对I<sub>kr电流的减低作用;而β2肾上腺素受体阻断剂I<sub>CI<sub>118551不能减弱异丙肾上腺素对I<sub>kr电流的减低作用。3.2.β1肾上腺素受体对豚鼠心室肌细胞I<sub>kkr电流的影响:选择性β1肾上腺素受体激动剂扎莫特罗也可剂量依赖性地降低I<sub>kr电流。依次灌流含0.01、0.1、1、10、100μmol/L的扎莫特罗可使I<sub>kr电流降为原来的基础电流大小的0.96±0.12、0.85±0.13、0.67±0.12、0.59±0.10、0.55±0.11。开始即灌流10μmol/L扎莫特罗可使I<sub>kr电流减低到基础电流大小的0.56±0.04。3.3.蛋白激酶A、磷脂酶C/蛋白激酶C和钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶在β1肾上腺素受体激动剂影响I<sub>kkr电流中的作用:（1）正常对照组（细胞未用任何蛋白酶抑制剂预处理）:10μmol/L扎莫特罗可使I<sub>kr电流减低到原基础电流大小的0.56±0.04。（2）KT5720组（细胞先用特异性PKA抑制剂KT5720预孵育1小时）:10μmol/L扎莫特罗能使I<sub>kr电流减低到基础电流大小0.87±0.03,与正常对照组相比有明显统计学差异。（3）U73122组（细胞先用PLC抑制剂U73122预孵育1小时）:10μmol/L扎莫特罗能使I<sub>kr电流减低到基础电流大小的0.91±0.07,与正常对照组相比有明显统计学差异。（4）Chelerythrine组（细胞先用特异性PKC抑制剂chelerythrine预孵育1小时）:10μmol/L扎莫特罗仅能使I<sub>kr电流减低到基础电流大小的0.71±0.01,与正常对照组相比有明显统计学差异。（5）KN93组（细胞用特异性CaMKI<sub>I<sub>抑制剂KN93预孵育30分钟）:10μmol/L扎莫特罗仍能使I<sub>kr电流减低到原电流大小的0.68±0.07,与正常对照组相比相比无统计学差异。4.α1和β肾上腺素受体在调控豚鼠心室肌细胞I<sub>kkr电流中的交互作用:4.1.急性激活α1肾上腺素受体对β肾上腺素受体激动剂调控I<sub>kkr电流的影响:若细胞未先加用α1肾上腺素受体激动剂苯肾上腺素,β肾上腺素受体激动剂异丙肾上腺素能使I<sub>kr电流降为基础电流大小的0.55±0.06。若细胞先加用苯肾上腺素,异丙肾上腺素则不能降低I<sub>kr电流的大小,提示α1肾上上腺素对Ikr电流的减低作用;而β2肾上腺素受体阻断剂ICI118551不能减弱异丙肾上腺素对Ikr电流的减低作用。3.2.β1肾上腺素受体对豚鼠心室肌细胞Ikkr电流的影响:选择性β1肾上腺素受体激动剂扎莫特罗也可剂量依赖性地降低Ikr电流。依次灌流含0.01、0.1、1、10、100μmol/L的扎莫特罗可使Ikr电流降为原来的基础电流大小的0.96±0.12、0.85±0.13、0.67±0.12、0.59±0.10、0.55±0.11。开始即灌流10μmol/L扎莫特罗可使Ikr电流减低到基础电流大小的0.56±0.04。3.3.蛋白激酶A、磷脂酶C/蛋白激酶C和钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶在β1肾上腺素受体激动剂影响Ikkr电流中的作用:（1）正常对照组（细胞未用任何蛋白酶抑制剂预处理）:10μmol/L扎莫特罗可使Ikr电流减低到原基础电流大小的0.56±0.04。（2）KT5720组（细胞先用特异性PKA抑制剂KT5720预孵育1小时）:10μmol/L扎莫特罗能使Ikr电流减低到基础电流大小0.87±0.03,与正常对照组相比有明显统计学差异。（3）U73122组（细胞先用PLC抑制剂U73122预孵育1小时）:10μmol/L扎莫特罗能使Ikr电流减低到基础电流大小的0.91±0.07,与正常对照组相比有明显统计学差异。（4）Chelerythrine组（细胞先用特异性PKC抑制剂chelerythrine预孵育1小时）:10μmol/L扎莫特罗仅能使Ikr电流减低到基础电流大小的0.71±0.01,与正常对照组相比有明显统计学差异。（5）KN93组（细胞用特异性CaMKII抑制剂KN93预孵育30分钟）:10μmol/L扎莫特罗仍能使Ikr电流减低到原电流大小的0.68±0.07,与正常对照组相比相比无统计学差异。4.α1和β肾上腺素受体在调控豚鼠心室肌细胞Ikkr电流中的交互作用:4.1.急性激活α1肾上腺素受体对β肾上腺素受体激动剂调控Ikkr电流的影响:若细胞未先加用α1肾上腺素受体激动剂苯肾上腺素,β肾上腺素受体激动剂异丙肾上腺素能使Ikr电流降为基础电流大小的0.55±0.06。若细胞先加用苯肾上腺素,异丙肾上腺素则不能降低Ikr电流的大小,提示α1肾上腺素受体激活可抑制β肾上腺素受体激活对Ikr电流的降低作用。4.2.急性激活β肾上腺素受体对α1肾上腺素受体激动剂调控Ikkr电流的影响:细胞若未预先加用β肾上腺素受体激动剂异丙肾上腺素,α1肾上腺素受体激动剂苯肾上腺素能使Ikr电流降为基础电流大小的0.58±0.04。若细胞先加用了异丙肾上腺素,苯肾上腺素能使Ikr电流降为基础电流大小的0.80±0.02,提示β肾上腺素受体激活可减弱α1肾上腺素受体激活对Ikr电流的降低作用。结论1.α1肾上腺素受体激活可浓度依赖性地减弱豚鼠心肌细胞的Ikr电流,此作用主要通过α1A肾上腺素受体介导。2.特异性PKA和PKC抑制剂均可减弱苯肾上腺素对Ikr电流的降低作用,提示α1A受体激活对Ikr电流的调控依赖于PKA以及PKC的激活。3.β肾上腺素受体激活可剂量依赖性地减弱豚鼠心肌细胞的Ikr电流,此作用主要通过β1肾上腺素受体介导。4.β1肾上腺素受体的瞬时激活对Ikr电流的调控作用依赖于PKA、PLC以及PKC的激活,而与CaMKII的激活无关。5.α1肾上腺素受体激活可抑制β肾上腺素受体激活对Ikr电流的降低作用,β肾上腺素受体激活亦可减弱α1肾上腺素受体激活对Ikr电流的降低作用;提示α1和β肾上腺素受体在对Ikr电流的调控上可能存在交互作用。
姚红[3]（2008）在《β3-肾上腺素受体抗体与心力衰竭的关系》文中提出背景心力衰竭（简称心衰）是扩张型心肌病（DCM）、冠心病、风湿性心脏病、高血压心脏病等多种心血管疾病发展的共同终末阶段,对人类生命构成巨大威胁,已成为全球范围内造成死亡的主要原因之一。心衰的发病过程非常复杂,已知的心衰发生机制主要有心肌损害、血液动力学异常、神经激素的激活和心肌重构等。一项长达10年的临床研究表明,尽管针对心衰发病的上述机制采取了许多积极的治疗措施,但心衰病人的预后并没有明显的改善,其存活率与10年前基本相同。这一结果说明,真正降低心衰的患病率和死亡率非常困难,提示在心衰发生发展过程中还有许多未知因素的存在。进一步探讨这些未知因素,对从根本上预防和治疗心衰将具有重要的理论与实践意义。β肾上腺素受体（βAR）是交感神经系统的重要成员,通过介导体内儿茶酚胺类物质的生理效应,在调节心脏活动中发挥着重要的作用。βAR属于G蛋白偶联受体家族,分为β1、β2和β3AR三个亚型,具有相同的结构特征,即含有7个22～28个氨基酸的跨膜区、3个细胞内环和3个细胞外环。以前认为在心脏中βAR为β1AR和β2AR两种亚型,通过兴奋型G蛋白—腺苷酸环化酶—环磷酸腺苷系统,发挥心肌正性变时、变力和变传导效应。最近的研究发现,在人类等多种种属动物的心肌细胞中有β3AR的表达,但与经典的β1AR和β2AR不同的是,人类心室肌组织β3AR通过与抑制型G蛋白（inhibitory G protcins,Gi）偶联,活化eNOS-NO-cGMP通路,介导心肌负性变力效应。此外,由于β3AR是一种低亲和力受体,即激活β3AR所需儿茶酚胺的浓度明显高于激活β1AR和β2AR所需的浓度,因此在生理情况下,β3AR调节心脏功能的意义可能不大。在心衰发生发展过程中,交感神经系统活性过度增高,心脏β1AR和β2AR由于PKA和βARK的磷酸化等机制而脱敏,受体密度下调,使这些受体对儿茶酚胺的反应性减弱,从而促使机体产生更高浓度的儿茶酚胺类物质。与此相反的是,心衰时β3AR表达水平较正常人上调2—3倍,而且与之偶联的G1蛋白也上调,再加上此时也具备激活β3AR的配体条件—高浓度的儿茶酚胺,所以在心衰时β3AR很有可能被激活。在人类衰竭的左心室中,β1-和β3AR相反的改变导致他们的变力效应不平衡,有可能成为加重心脏功能恶化的因素。但在β3AR转基因小鼠模型中,并没有检测到心肌细胞肥大增生、纤维化等组织学改变,激活β3AR可能不是引发心脏损伤的原因。这提示在心衰发生发展过程的不同阶段,β3AR的活化可能发挥着不同的病理生理作用。上世纪90年代以来,国内外学者相继发现在DCM等心脏疾病患者血清中存在有β肾上腺素受体（β1和β2AR）的自身抗体,这些自身抗体可通过作用于相应受体细胞外第二环而产生类激动剂样效应,且采用相应细胞外第二环肽段长期免疫动物,可使其心脏功能及形态均发生类似DCM病人的变化。由于G蛋白偶联受体家族成员具有相似的结构特征,为证实心衰发病过程中是否有针对β3AR的自身免疫作用的参与,2005年我们以人工合成的人β3AR细胞外第二环的肽段作为抗原,采用酶联免疫吸附实验（ELISA）筛查了217例心衰病人和100例正常人血清中的抗β3AR抗体。结果发现,心衰患者血清中抗β3AR抗体的阳性率明显高于正常人（27%vs11%,P＜0.05）。我们的研究还发现,该抗体具有类β3AR激动剂的负性变时、变力效应,且此效应具有不脱敏现象。但是,上述实验结果还不足以说明针对β3AR细胞外第二环的自身抗体与心衰发病的关系。首先,由于心衰的发病原因不同,其机制及病理改变也存在一定差异。高血压、冠心病、扩心病、肥厚性心肌病及风心病等多种疾病所致心衰的发病过程中均存在免疫系统紊乱,并已得到该研究领域国内外专家的公认,但针对心肌的自身免疫作用的研究结果却不尽相同。例如Rahat S等的研究结果显示抗肌球蛋白抗体在冠心病与扩张性心肌病所致心衰患者中的阳性率及亲和力无明显差异;而Jonathan H等则报道扩张性心肌病所致心衰患者中抗肌球蛋白抗体的阳性率及亲和力高于冠心病所致心衰患者。另Jahns R和Fu ML等的研究结果则显示:虽然继发于扩心病、冠心病、高血压和肥厚性心肌病等疾病的心衰患者体内均检测到β1AR自身抗体,但此抗体却只在扩心病及冠心病心衰过程中发挥作用,而与继发于高血压和肥厚性心肌病的心衰发病无关。那么,在不同原因所致心衰过程中,β3AR自身抗体的阳性率及亲和力是否有所差异,β3AR自身抗体在何种疾病所致心衰的发生发展过程中对心脏功能产生影响尚待进一步证实。其次,尽管诸多研究表明,G蛋白耦联受体细胞外第二环具有T细胞及B细胞表位,有很强的抗原性和免疫原性,是产生自身抗体的主要表位。但也有研究证实,DCM患者体内同样存在针对β1AR细胞外第一环的功能性自身抗体。考虑到β3AR细胞外三个环均具有暴露于机体免疫系统的可能,那么,它们是否均能刺激机体产生相应自身抗体?如果存在这些自身抗体,其各自有何临床意义值得我们去关注。目前关于针对β3AR细胞外第一、第二和第三环自身抗体产生情况的比较研究尚未见有报道。再次,自发现β1AR自身抗体至今已经历了19年的时间,期间又发现了诸多针对G蛋白偶联受体细胞外第二环的自身抗体,并对它们相应的临床意义和病理生理机制进行了大量的研究,但到目前为止,自身抗体产生的免疫学机制还不十分明确。抗原的数量、位置及机体免疫系统功能的变化均是调节抗体产生的重要因素。在正常机体内存在针对自身组织的自身反应性淋巴细胞,当自身抗原存在量达较高危险浓度时就有可能活化相应的自身反应性淋巴细胞,产生自身抗体。而B淋巴细胞是机体体液免疫应答过程中产生抗体的主体,其数量或/和抗体产生能力的改变都将导致机体抗体水平的改变。业已证实,在心衰发生发展过程中,心肌细胞β3AR mRNA和蛋白质水平均有增高,同时机体免疫系统存在持续激活,这些条件可能会导致机体针对β3AR的免疫反应性增加,进而产生针对β3AR的自身抗体,但这一假说需要进一步的研究证实。此外,虽然我们的前期研究证实,β3AR自身抗体具有受体激动剂样效应,可以影响离体心肌细胞活动产生类激动剂样的生物效应,但在整体动物,β3AR自身抗体长期存在下,会对心脏结构及功能产生什么样的作用,尚不清楚。而对这一问题的解释,有利于全面评价β3AR自身抗体存在的可能的病理生理意义,以及对β3AR自身抗体进行深入研究提供方向。综上所述,我们拟在在本课题进行以下三方面的研究:①不同原发疾病所致心衰患者血清中,β3AR自身抗体分布的免疫学特征及其与心衰某些特异性指征的相关性分析,借以分析β3AR自身抗体在不同原发疾病心衰发生中的可能作用;②在β3AR自身抗体阴性的大鼠,建立增大心脏压力后负荷致心衰的动物模型,观察在心衰的发生过程中是否会产生β3AR的自身抗体,如果产生,其产生规律为何;③通过用β3AR细胞外环肽段主动免疫正常大鼠,观察在β3AR自身抗体长期存在下,心脏结构和功能是否会发生改变。一、心力衰竭患者血清中β3AR自身抗体的种类和可能的临床意义目的本研究分别以合成的人β3AR细胞外第一环、第二环和第三环表位肽段作为抗原,应用酶联免疫吸附测定（ELISA）技术,检测不同原发疾病所致心衰患者血清中β3AR的自身抗体,并分析抗β3AR自身抗体的免疫反应性及其对心脏功能活动的影响,以探讨心衰患者血清中抗β3AR自身抗体存在的病理生理意义。方法1.研究对象及标本166例继发于扩张型心肌病（简称扩心病,n=30）、冠状动脉粥样硬化性心脏病（简称冠心病,n=93）、高血压性心脏病（简称高心病,n=33）和风湿性心脏病（简称风心病,n=10）的心衰患者为山西医科大学第一医院、山西省人民医院及山西省心血管疾病研究所2005～2007年的住院病人,心功能Ⅱ～Ⅳ级,左室射血分数（LVEF）均低于45%（病例资料见表1）。全部患者除外内分泌、自身免疫性疾病、各种感染性疾病和免疫缺陷性疾病,采集血样前3d避免服用免疫抑制剂和βAR阻滞剂。正常对照组:健康体检者103例,年龄、性别构成与心衰组均衡,无任何临床症状且心电图、超声心动图、X线胸片、肝肾功能常规检查未见异常。入选者均于空腹12h后采集静脉血液并及时分离血清置于-20℃保存。2.肽段合成3个抗原肽段均由西安美联生物工程公司合成,相当于人β3AR细胞外第一环、第二环及第三环氨基酸序列的特异性抗原决定簇,合成肽段纯度为95%。人β3AR氨基酸序列检索来自NCBI（AC:P13945,GI:461604）（见表2）。合成的肽段储存于-20℃备用。3.检测方法按照我实验室以前的方法,应用SA-ELISA检测方法。抗原包被用量为5μg/ml。主要技术流程如下:包被合成的抗原多肽→加入按一定比例稀释的待测血清→加入标记有生物素的抗人IgG抗体→加入标记有辣根过氧化物酶的亲和素→加入辣根过氧化物酶的底物及显色剂→在酶标仪上测定反应物的光密度值（optical density,OD）。4.判断标准抗体水平以标本1:20稀释时测定的OD值反映。以阳性血清与阴性血清的吸光度之比即P/N比值来判断阳性率,P/N≥2.1为阳性（P/N=标本OD值-空白对照OD值/阴性对照OD值-空白对照OD值）。5.统计学处理采用SPSS 13.0统计软件对实验数据进行统计。率的比较采用x2检验或Fisher’s确切概率法;计数资料均数间显着性差异比较采用方差分析或t检验,等级资料采用秩和检验。结果1.正常人和心衰患者血清中β3AR自身抗体的种类及阳性率经ELISA筛选发现,心衰患者及正常人血清中均存在分别针对β3AR细胞外第一环、第二环和第三环的自身抗体（依次表示为anti-β3-ECⅠ,anti-β3-ECⅡ和anti-β3-ECⅢ）,但各自阳性率不同。其中,扩心病患者anti-β3-ECⅠ及anti-β3-ECⅡ阳性率（33.3%和40.0%）均高于正常人（分别为9.7%和8.7%,P＜0.05）,而anti-β3-ECⅢ阳性率（6.7%）与正常人（5.8%）无差异（P＞0.05）;冠心病患者anti-β3-ECⅡ的阳性率（28.0%）也显着高于正常人（8.7%,P＜0.05）,而anti-β3-ECⅠ及anti-β3-ECⅡ阳性率（19.4%和3.2%）和正常人相比无明显差异（P＞0.05）;高心病和风心病患者血清中anti-β3-ECⅠ,anti-β3-ECⅡ和anti-β3-ECⅢ的阳性率与正常对照比较经x2检验（或Fisher’s确切概率法）均无差异（P＞0.05）（见图1）。这一结果提示β3AR自身抗体（主要为anti-β3-ECⅡ抗体）可能与扩心病及冠心病所致心衰的发病过程有关。2.正常人和心衰患者β3AR自身抗体的水平分析β3AR自身抗体阳性血清中的β3AR自身抗体水平（见图2）发现:正常人组内anti-β3-ECⅡ的抗体水平（0.92±0.23）均明显高于anti-β3-ECⅠ（0.28±0.06）和anti-β3-ECⅢ（0.35±0.05,P＜0.05）,同样在各心衰患者组内anti-β3-ECⅡ的抗体水平也均明显高于anti-β3-ECⅠ和anti-β3-ECⅢ。提示正常状态下β3AR细胞外第二环就具有较强的免疫性,anti-β3-ECⅡ具有较强的亲和力,更易于和相应抗原结合而被检测出。此外,在扩心病患者血清中的anti-β3-ECⅡ水平（1.17±0.17）显着高于正常人（0.92±0.23,P＜0.05）,其他三种疾病所致心衰患者的anti-β3-ECⅡ抗体水平和正常人无明显差异（P＞0.05）;而anti-β3-ECⅠ和anti-β3-ECⅢ的抗体水平在正常人和各种原发疾病所致心衰患者间均无明显差异（P＞0.05）。上述结果均提示,anti-β3-ECⅡ是与心衰（尤其是扩心病所致心衰）发病过程有关的主要的β3AR自身抗体的种类。3.β3AR自身抗体与心衰患者心功能之间的关系以心脏左室射血分数（ejection fraction,EF）和NYHA（纽约心脏协会）心功能分级作为反映患者心功能状态的指标,分析在不同原发疾病所致心衰中各类β3AN自身抗体（anti-β3-ECⅠ,anti-β3-ECⅡ和anti-β3-ECⅢ）对心功能的影响。经t检验及秩和检验发现,在扩心病患者中,anti-β3-ECⅡ阳性者较阴性者心功能好,表现为anti-β3-ECⅡ阳性者EF显着高于阴性者（P＜0.05）,同时NYHA心功能分级低于阴性者（P＜0.05）;然而,anti-β3-ECⅠ阳性者较阴性者心功能差,表现为EF低于阴性者（P＜0.05）,而NYHA心功能分级则高于阴性者（P＜0.05）;冠心病患者中,anti-β3-ECⅡ阳性者也优于阴性者,但不具有统计学意义（P＞0.05）,而anti-β3-ECⅠ阳性者心功能则低于阴性者（P＜0.05）（见表3）;风心病及高心病患者β3AR自身抗体阳性患者和阴性患者间心功能指标无差别。这一结果提示,β3AR自身抗体（主要是anti-β3-ECⅡ）与扩心病及冠心病所致的心衰有关,心衰发病过程中,anti-β3-ECⅡ可能对由β1AR自身抗体诱发的心脏功能障碍和心肌损伤中起着心肌保护的作用。关于anti-β3-ECⅠ对心功能的影响,由于其抗体水平较低,观察例数较少,且其功能效应还不明确,故尚难得出明确结论。小结:1.针对β3AR细胞外第二环的自身抗体,在扩心病和冠心病所致心衰患者中的阳性率和/或抗体水平均明显高于正常人,提示它可能与心衰的发病过程有关。2.针对β3AR细胞外第一环的自身抗体,在扩心病患者中也有较高的阳性率,但抗体水平较低;针对β3AR细胞外第三环的自身抗体则与心衰发病无关。3.心衰发病过程中,anti-β3-ECⅡ可能对由β1AR自身抗体诱发的心脏功能障碍和心肌损伤起着一定的心肌保护作用。二、心衰的发生发展过程与β3AR自身抗体产生的关系目的为进一步探讨β3AR自身抗体与心衰发病的关系,我们还在β3AR自身抗体阴性的大鼠身上制备了增大心脏压力后负荷的心衰模型,借以观察在心衰发生发展过程中,β3AR自身抗体的产生规律,并分析β3AR自身抗体的产生与心肌β3AR密度及免疫系统机能变化的联系,以便查明β3AR自身抗体在心衰发生发展过程中所起的作用,加深对心脏疾病发生过程中的自身免疫机制的理解,并为相关疾病的防治提供新思路。方法1.采用缩窄腹主动脉法制备心衰大鼠模型:采用与第一部分相同的ELISA方法和判断标准确定为β3AR自身抗体阴性的健康Wistar大鼠（雄性,10周龄,体重200-250g,山西医科大学动物中心提供）随机分为2组:（1）主动脉缩窄组（AB组,n=80）:根据Doering等的方法实施腹主动脉环扎术。（2）伪手术对照组（sham组,n=40）:仅分离腹主动脉而不结扎,其他操作与主动脉缩窄组相同。2.大鼠血清中p3AR自身抗体的测定:所有实验动物于手术前及手术后每两周采用剪尾法收集血清,-20℃备用,采用ELISA方法（与第一部分相同）检测模型形成前后针对β3AR细胞外第二环的自身抗体（根据第一部分研究结果选择）。抗原肽段序列由西安美联生物工程公司合成,相当于大鼠β3AR细胞外第二环氨基酸序列（176aa～200aa,RVGADAEAQECHSNPRCCSFASNMP,检索自NCBI AC:P26255,GI:543882）,合成肽段纯度为95%。合成的肽段储存于-20℃备用。3.大鼠在体心功能测定:两组大鼠均于术后4周、8周、12周和16周称体重,用25%乌拉坦麻醉后,仰卧固定于手术台上,颈前正中作一约4厘米的切口,分离颈前肌群至气管,分离右侧颈总动脉并结扎远心端,近心端用小动脉夹阻断血流,用眼科剪剪V字形口,将充满肝素生理盐水的导管经右颈总动脉插入心室并结扎固定,打开动脉夹。导管的另一端借三通管连接P—50压力换能器,压力信号输入MS2000生物信号记录分析系统,记录各心功能参数,包括左心室收缩压（LVSP）,左心室舒张末期压（LVEDP）以及室内压上升和下降的最大速率(±dp/dtmax)。测定结束后,开胸,迅速取出心脏,洗净心腔内积血、擦干,去除心脏周围组织及血管,称量全心重,计算心脏重量与体重的比值,部分心肌组织固定于10%中性福尔马林,其余组织于-70℃保存备用。同时按无菌操作法分离大鼠脾脏。4.心脏组织形态学检测:大鼠心肌置于10%中性福尔马林固定48小时,常规脱水,石蜡包埋。制作4μm组织切片,采用Masson染色及HE染色,于光学显微镜下观察心肌形态,并利用图象分析技术进行心肌染色切片胶原容积百分比（CVF）的测定。5.蛋白免疫印迹技术（Western Blot）测定心肌细胞β3AR含量:大鼠左心室组织细胞膜蛋白提取按照膜相/水相蛋白提取试剂盒（TansMem proteinisolation system instructions,Applygen Technologies Inc）说明书操作。蛋白含量采用BCA法测定。30μg变性蛋白经10%SDS-PAGE凝胶分离后转膜,分别与大鼠β3AR特异性抗体及二抗孵育,采用化学发光法测定。6.大鼠B淋巴细胞含量测定:脾脏研磨成悬液,采用Ficol淋巴细胞分离液2500rpm离心30分钟,收获单个核细胞层细胞,洗涤两次,调整细胞数为1×107/ml。台盼兰染色查活细胞数应大于90%。取100μl脾淋巴细胞（1×106个）与适量PE标记的抗大鼠CD45R单克隆抗体混合,室温下避光孵育20分钟后洗涤,应用流式细胞仪FACSCalibur进行检测。Ceil quest收集细胞（总数10000个细胞）,并分析流式结果。7.B淋巴细胞抗体生成能力测定:用20%绵羊红细胞（SRBC）生理盐水悬液腹腔免疫大鼠,4天后无菌取出脾脏,用RPMI1640洗一次后置平皿中不锈钢筛网上,用无菌注射器针芯研磨成悬液,RPMI1640洗涤两次,调整细胞数为5×106/ml。台盼兰染色查活细胞数应大于90%。按照Jerne和Nordin等改良的直接及间接溶血空斑实验测定B淋巴细胞抗体生成能力。空斑数量采用VilBer Lourmat capt软件测定.结果1.模型大鼠术后生存率:实施腹主动脉狭窄术后第2周,手术组大鼠存活44只,伪手术组大鼠存活36只,存活率分别为55%（44/80）和90%（36/40）。之后,两组大鼠在处死前均未出现意外死亡。2.大鼠心衰模型成功指标:2.1大鼠心重/体重比:实施腹主动脉狭窄术后4周,手术组大鼠心脏重量与体重的比值（0.32±0.01）较同期伪手术组（0.27±0.01）显着增加（P＜0.05）。术后8周,手术组心脏重量的增加（0.36±0.01）与术后4周相比进一步加剧（P＜0.05）;在术后12周和16周,手术组心脏重量与体重的比值（分别为0.34±0.01和0.34±0.02）与术后8周相比无统计学差异（P＞0.05）,与同期假手术组相比（分别为0.26±0.01和0.27±0.01）仍有显着性差异（P＜0.01）（见图3）。2.2心功能变化:实施腹主动脉狭窄术后4周,手术组大鼠的LVSP和±dp/dtmax均低于伪手术组,LVEDP高于伪手术组,但无统计学差异（P＞0.05）;术后8周,手术组上述左室收缩、舒张功能各参数改变进一步加剧,与同期伪手术组具有明显差异;术后12周和16周,两组模型中反映左心室功能的上述各项指标与术后8周相比,心功能障碍无进一步加重的趋势,而与同期假手术组相比,各参数仍有明显的差异（P＜0.01）。见表4。2.3心肌形态学改变:通过Masson染色和HE染色技术结合光学显微镜观察及图象分析技术等证实,腹主动脉缩窄手术组大鼠随着时间的发展,发生了明显的心肌细胞形态改变及胶原纤维化,同时伴随程度不同的淋巴细胞浸润（见表5,图4,图5）。以上结果显示,心衰模型建立成功。3.心衰模型形成过程中,大鼠血清中β3AR自身抗体的产生和变化规律:心衰模型大鼠血清中β3AR自身抗体水平（O.D.值）在术后2周（0.37±0.01）开始与术前（0.20±0.01）及同期伪手术组（0.20±0.02）相比,即有明显升高（P＜0.05）,之后平稳上升至8周时达峰值（0.71±0.04）,并保持至10周（0.70±0.05）。术后12周,心衰模型手术组大鼠血清中β3AR自身抗体开始下降（0.60±0.07）,但直至16周（0.52±0.06）仍维持在高于术前水平,而在14周及16周与同期伪手术组相比已无统计学差异（P＞0.05）。伪手术组大鼠血清β3AR自身抗体测定结果也呈现一种平稳升高的态势,但直至实验结束,其差别也未具有统计学意义（P＞0.05）（见图6）。这一结果提示,在心衰发生发展过程中β3AR自身抗体具有逐渐产生、缓慢增高、维持、自然消退的变化规律。4.心衰模型形成过程中,心肌细胞β3AR的含量改变:与同期伪手术组大鼠相比,手术组大鼠心肌细胞膜β3AR的含量在术后4周已有轻微增加;在术后8周明显升高,差异具有统计学意义（P＜0.05）;术后12周和16周,β3AR的含量一直持续在较高的水平（见图7）。而伪手术组心肌细胞膜β3AR的含量在整个实验进程中均未发生明显改变（P＞0.05）。此外,β3AR含量的上调高峰出现在术后8周,与β3AR自身抗体到达高峰的时程相符,这一结果提示,在心衰的发生发展过程中,β3AR的上调和β3AR自身抗体的生成之间,在时间点上有较明确的对应关系,说明二者在功能作用上的一致性。但由于实验设计中观察时间点的限制,本实验还无法分析β3AR上调和β3AR自身抗体产生之间是否有因果关系。5.B淋巴细胞数量及抗体产生能力的改变:采用流式细胞仪技术测定实验大鼠脾淋巴细胞中B细胞的数量,结果显示在整个实验过程中手术组大鼠与同期伪手术组相比,其脾脏B淋巴数目并未明显改变（P＞0.05）（见图8）。同时采用直接及间接溶血空斑实验来测定实验大鼠脾淋巴细胞的功能（即抗体生成能力）,结果表明,与伪手术组比较,手术组大鼠直接溶血空斑数量在术后4周已有明显升高,术后8周达到最高峰,在术后12周降至与伪手术组相似的水平（图9）;而手术组大鼠间接溶血空斑数目同样在术后4周明显升高,术后8周达到高峰,并保持至术后12周,在术后16周降至与伪手术组相似的水平（图10）。说明在实验大鼠心功能改变过程中出现免疫系统抗体生成能力的变化,而且抗体生成能力的变化与血清中β3AR自身抗体的变化规律十分相似。这一结果提示,β3AR自身抗体的产生可能与心衰发生发展过程中机体免疫系统功能的改变具有内在联系。小结1.在建立压力后负荷型大鼠心衰模型的过程中,原为β3AR自身抗体阴性的大鼠血清中开始出现高水平的β3AR自身抗体,但该抗体具有一定的产生、维持和减退的自我消长的时间过程;2.β3AR的产生过程与脾淋巴细胞抗体生成能力的改变趋势一致,但与B淋巴细胞数量无关;3.β3AR自身抗体水平出现峰值的时间与大鼠心肌细胞膜受体β3AR的上调时间一致,说明二者在功能作用上有一致性;4.本实验证实在心衰的发生发展过程中,心脏的病理生理改变促进了β3AR自身抗体的产生,但其启动β3AR自身抗体产生的确切机制还有待进一步探讨。三、β3AR自身抗体长期存在对在体大鼠心脏结构及功能的影响目的我们的前期研究证实,心衰病人血清中存在β3AR自身抗体,主要针对β3AR细胞外第二环,具有类激动剂样负性变时、负性变力效应,且此效应具有不脱敏现象,与DCM及冠心病等患者的心衰发生发展过程可能有一定的关系。但在在体情况下,此抗体的长期持续作用会对心脏结构及功能产生何种影响尚不清楚,而此研究对进一步理解在心衰发展过程中不同类别的受体抗体是如何发挥相互作用的,进而加深对扩心病等心脏疾患发病中自身免疫机制的理解,可能具有较重要意义。因此,本研究采用β3AR细胞外第二环的合成肽段主动免疫正常大鼠六个月,观察被免疫大鼠在β3AR自身抗体的持续刺激下心脏结构及功能的改变,并探讨β3AR自身抗体可能的信号转导通路,借以分析β3AR自身抗体在心衰发病过程中可能的作用机制。方法1.动物免疫:选用8周龄、重量为100-160g、健康雄性Wistar大鼠20只（山西医科大学动物中心提供）,随机分成两组:对照组（n=8）和β3AR免疫组（n=12）。β3AR免疫组根据人β3AR细胞外第二环第179～203位氨基酸残基的序列人工合成抗原进行免疫,首次免疫时用合成的抗原肽段（0.4μg/kg）加完全佐剂进行,2周后采用合成的抗原肽段加不完全佐剂进行加强免疫,以后每隔两周加强一次,共免疫6月（24周）;对照组除不加抗原外,余同免疫组。2.血清中β3AR自身抗体的测定:上述两组大鼠均于免疫前及每次加强免疫前1天鼠尾采血,分离血清,用SA-ELISA方法测定其血清β3AR自身抗体水平,测定方法见第一部分方法3。3.大鼠在体心功能测定:分别于初次免疫后3月（12周）及6月（24周）两个时间点,随机选取实验动物进行在体心功能测定,具体操作同第二部分方法3。心功能测定结束处死大鼠,留取新鲜心肌组织,部分以适当方法固定用于光学显微镜检查和电子显微镜检查,其余组织置于-70℃保存备用。4.心肌形态学指标的测定:采用光学显微镜及电子显微镜技术测定。5.心肌组织β3AR及eNOS含量的测定:采用WestemBlot技术进行检测。6.心肌组织cAMP及cGMP含量测定:采用放射免疫技术测定,操作过程严格按照试剂盒说明书进行。7.心肌组织总NO（NOx）含量测定:采用比色法测定,具体操作按照试剂盒说明书进行。结果1.β3AR细胞外第二环肽段主动免疫模型的建立:首次免疫后2周,β3AR免疫组大鼠血清中β3AR自身抗体水平（2.08±0.18）已明显升高,与免疫前（0.28±0.03）及同期对照组（0.33±0.08）相比差异均具有统计学意义（P＜0.01）,随后抗体水平缓慢升高并维持在一个高水平。对照组大鼠血清中β3AR自身抗体水平始终无明显改变（P＞0.05）。（见图11）提示主动免疫模型制备成功。2.主动免疫过程中大鼠心功能的变化:初期免疫后3月及6月,β3AR免疫组大鼠在体左心室功能参数LVSP和±dp/dtmax均高于对照组,而LVEDP低于对照组,但这些差异均无显着性（见表6）。提示β3AR自身抗体的持续作用并未造成实验大鼠心功能的明显改变,但有改善心功能的倾向。3.主动免疫过程中大鼠心肌形态学改变特点:β3AR免疫组大鼠在初期免疫后3月及6月,通过染色技术结合光学显微镜技术证实,心肌组织形态基本正常,未出现心肌细胞肥大、变性、坏死、大量炎性细胞浸润、胶原纤维化等病理改变;通过电子显微镜技术观察到β3AR免疫组大鼠心肌细胞肌原纤维排列整齐,线粒体结构清晰完整（见图12）。提示在主动免疫6个月的情况下,β3AR自身抗体的持续作用并未造成实验大鼠心肌结构发生明显改变。这提示需要进一步延长免疫时间或建立被动免疫心衰模型大鼠,以便最终确定β3AR自身抗体在心衰发生发展过程中的作用机制。4.主动免疫过程中大鼠心肌组织β3AR的含量:在免疫3月及6月,β3AR免疫组大鼠心肌细胞膜β3AR的含量均稍有增加,但与同期免疫对照组大鼠相比并无明显差异（P＞0.05）（见图13）。提示β3AR自身抗体持续作用6个月对大鼠心脏β3AR的含量未产生明显影响。5.主动免疫过程中大鼠心肌组织eNOS的含量:与免疫对照组相比,β3AR免疫组大鼠心肌组织eNOS的含量在免疫3月及免疫6月时均有显着增加（P＜0.05）（见图14）。提示eNOS可能是介导β3AR自身抗体作用的一个信号通路分子。6.主动免疫过程中大鼠心肌组织cAMP和cGMP的含量:与免疫对照组组相比,免疫3月时β3AR免疫组大鼠心肌组织cGMP的含量有明显升高（25.35±1.10 vs 21.10±1.33 pmol/g,P＜0.05）;免疫6月时cGMP含量升高更为显着（26.97±1.05 vs 20.45±1.58 pmol/g,P＜0.01）（见图15）。同期β3AR免疫大鼠心肌组织cAMP的含量与免疫对照组组相比也有升高的趋势,但无显着差异（P＞0.05）（见图16）。进一步比较不同免疫时期大鼠心肌组织cAMP/cGMP的比值,发现此值在β3AR免疫组大鼠免疫6月时明显低于免疫3月（5.38±0.22 vs 6.59±0.16,P＜0.05）而相应免疫对照组却无明显改变（6.71±0.17 vs 6.80±0.37,P＞0.05）（见图17）。说明在长期β3AR免疫过程中心肌组织cGMP较cAMP确实有显着升高。提示cGMP可能是介导β3AR自身抗体作用的一个重要信号通路分子。7.主动免疫过程中大鼠心肌组织总NO（NOx）含量:与免疫对照组组相比,免疫3月及6月时β3AR免疫组大鼠心肌组织NOx的含量均有所升高,但未具有显着性差异（P＞0.05）,（图18）提示β3AR自身抗体可能刺激了NO产生。未出现显着意义的原因也许是由于本次实验为初探性研究,实验中所用动物数量较少造成的。小结1.在用β3AR细胞外第二环肽段主动免疫6个月的条件下,高水平β3AR抗体较长时间的存在,对大鼠心脏功能及结构均未产生有统计学显着意义的影响,但有改善心功能的倾向;2.在主动免疫过程中,大鼠心肌组织β3AR的含量均有增加的倾向,但未达到有统计学显着意义的水平:3.β3AR抗体存在时,大鼠心肌细胞中eNOS-NO-cGMP信号转导途径中的主要信号分子均有明显增加。提示β3AR自身抗体可能通过eNOS-NO-cGMP信号转导途径发挥其病理生理作用。结论1.在不同原发疾病所致心衰患者及正常人血清中均存在有分别针对β3AR细胞外第一环、第二环和第三环的自身抗体,但其中以针对β3AR细胞外第二环的自身抗体（anti-β3-ECⅡ）出现的阳性率和抗体水平为最高（显着高于一、三环的自身抗体）,且在心衰病人显着高于正常人,提示anti-β3-ECⅡ是重要的功能性抗体,参与了心衰（主要是扩心病和冠心病所致心衰）的病理生理过程,可能对由β1AR自身抗体诱发的心脏功能障碍和心肌损伤起着心肌保护的作用。2.心衰大鼠模型在心衰发生发展过程中产生了β3AR自身抗体,且该抗体具有一定的产生、维持和减退的自然消长过程;β3AR自身抗体的产生过程与脾淋巴细胞抗体生成能力增高的趋势一致,而与B淋巴细胞数量无关;伴随β3AR自身抗体的增高,心肌组织β3AR的数目也有上调,说明二者在功能上的一致性,高度提示其在心衰中具有一定的作用;3.在主动免疫6个月条件下,β3AR自身抗体对在体大鼠的持续作用未能引发心脏结构和功能的明显改变,但有改善心功能的倾向:此外,β3AR抗体长期存在,可以使大鼠心肌组织中eNOS-NO-cGMP信号转导途径活跃,提示β3AR自身抗体可能通过该途径发挥其病理生理作用。
Yong-zhen ZHANG, You-yi ZHANG, Ming-zhe CHEN, Qi-de HANInstitute of Vascular Medicine, Peking University Third Hospital; Key Laboratory of Ministry of Education for Molecular Cardiovasology, Beijing 100083, China[4]（2004）在《β-Adrenoceptors potentiate α1-adrenoceptor-mediated inotropic response in rat left atria》文中提出AIM: To investigate whether stimulation of β-adrenoceptor （AR） and its subtypes augment α1-AR-evoked positive inotropic response and inositol phosphate （InsP） accumulation in isolated rat left atria. METHODS: Inotropic response was determined by contractile function experiment in isolated electrically driven rat left atria. 3H-InsP accumulations were measured by 3H-inositol incorporation and column chromatography. RESULTS: （1）
袁沛雄[5]（1995）在《肾上腺素受体亚型基因表达变化在缺氧性肺动脉高压右心室肥厚发病中的作用》文中进行了进一步梳理肾上腺素受体亚型基因表达变化在缺氧性肺动脉高压右心室肥厚发病中的作用 慢性阻塞性肺疾病是严重危害人们健康的常见病、多发病。因通气障碍、肺泡缺氧等，使肺小动脉持续收缩、肺血管结构重建，可形成肺动脉高压，久之即发展为肺心病。本室建立的常压缺氧大鼠肺动脉高压肺心病模型较减压缺氧模型更接近由慢性阻塞性肺疾患演变成的肺动脉高压和肺心病。我们以往通过对常压缺氧大鼠模型的肺组织和肺动脉肾上腺素受体（Adrenoceptor，AR）亚型及其基因表达的一系列研究，初步认为AR亚型基因表达变化在低氧性肺动脉高压发病中可能起重要作用。但因方法所限，对肺动脉的分离难以达到肺内小动脉和微动脉水平（而这种血管对缺氧的反应更为重要），故未对缺氧大鼠肺内小动脉上受体亚型基因表达情况进行研究。此外，缺氧后心肌细胞也发生适应性变化，形成心肌肥厚，但对其发生机制及与心功能的关系尚缺乏较深入的研究。本实验在本室以往研究的基础上，从不同层次观察和研究了缺氧后不同时间、大鼠肺循环血流动力学、左、右心室舒缩功能、肺内小动脉壁相对厚度、心肌细胞横径、心肺组织的不同结构上肾上腺素受体亚型分布密度及其基因表达水平的变化，并观察了受体阻断剂对它们的影响，以期加深对缺氧性肺动脉高压肺心病发病机理的认识，为临床应用受体药物防治该类疾病提供理论依据。 实验用成年雄性Wistar大鼠，随机分为正常常氧对照组、缺氧1、2、4周组，正常常氧对照+Prazosin组，缺氧二周+Prazosin组共六组，每组8只。缺氧大鼠置于常压缺氧舱内间断
二、β-Adrenoceptors potentiate α_1-adrenoceptor-mediated inotropic response in rat left atria（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、β-Adrenoceptors potentiate α_1-adrenoceptor-mediated inotropic response in rat left atria（论文提纲范文）
（1）α1肾上腺素受体自身抗体在原发性高血压患者血清中的分布及其对血管功能的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文正文 |
| SECTION 1 Screening of Autoantibodies against α_1-Adrenoceptor in Sera from Patients with Primary Hypertension and the Potential Significance |
| Abstract |
| Introduction |
| Methods |
| Results |
| Discussion |
| References |
| SECTION 2 The Vasoconstrictive Effects of Autoantibodies against the Second Extracellular Loop of α_1-Adrenoceptor and the Regulatory Role of Endothelium and Nitric Oxide |
| Abstract |
| Introduction |
| Methods |
| Results |
| Discussion |
| References |
| SECTION 3 Effect of Active Immunization with Peptides Corresponding to the Second Extracellular Loop of α_1-Adrenoceptor on Vascular Function and Structure in Rats |
| Abstract |
| Introduction |
| Methods |
| Results |
| Discussion |
| References |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 致谢 |
（2）α1、β肾上腺素受体调控快激活延迟整流钾电流的机制（论文提纲范文）
| 中英文缩略语 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 豚鼠心室肌细胞快激活延迟整流钾电流的描记 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 α_1肾上腺素受体对快激活延迟整流钾电流的调节 |
| 第一节 α_1肾上腺素受体及其亚型对I_(kr) 电流的调控作用 |
| 第二节 α_1A肾上腺素受体对I_(kr)电流的调控机制 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 β肾上腺素受体对快激活延迟整流钾电流的调节 |
| 第一节 β肾上腺素受体及其亚型对I_(kr)电流的调控 |
| 第二节 β_1肾上腺素受体对I_(kr)电流的调控机制 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分 α_(1A) 、β_1肾上腺素受体对I_(kr)调控的交互作用 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
（3）β3-肾上腺素受体抗体与心力衰竭的关系（论文提纲范文）
| 目录 |
| 中文摘要 |
| Section Ⅰ:Determination and Clinical Implication of Autoantibodies against β_3-Adrenoceptor in Patients with Heart Failure |
| Abstract |
| Introduction |
| Methods |
| Results |
| Discussion |
| Brief Summary |
| References |
| Section Ⅱ:Changes in Autoantibodies against β_3-Adrenoceptor during Development of Heart Failure in Rats |
| Abstract |
| Introduction |
| Methods |
| Results |
| Discussion |
| Brief Summary |
| References |
| Section Ⅲ:Effects of Immunization with Synthesized Receptor Peptide ofβ_3-Adrenoceptor on Cardiac Activity in Rats in vivo |
| Abstract |
| Introduction |
| Methods |
| Results |
| Discussion |
| Brief Summary |
| References |
| Summary |
| 附录 |
| 文献综述1 |
| 文献综述2 |
| 个人简介 |
| 致谢 |
（5）肾上腺素受体亚型基因表达变化在缺氧性肺动脉高压右心室肥厚发病中的作用（论文提纲范文）
| 缩略词 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 一.材料 |
| 二.实验方法 |
| 实验结果 |
| 一.常压缺氧大鼠肺动脉高压模型及Prazosin对其影响 |
| 二.常压缺氧大鼠肺组织α_1-AR和β_1-AR亚型分布密度的变化 |
| 三.缺氧大鼠心脏α_1-AR和β_1-AR分布密度的变化 |
| 四.分子生物学实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 论文图表 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 致谢 |
四、β-Adrenoceptors potentiate α_1-adrenoceptor-mediated inotropic response in rat left atria（论文参考文献）
- [1]α1肾上腺素受体自身抗体在原发性高血压患者血清中的分布及其对血管功能的影响[D]. 闫莉. 山西医科大学, 2009(09)
- [2]α1、β肾上腺素受体调控快激活延迟整流钾电流的机制[D]. 王森. 南京医科大学, 2009(12)
- [3]β3-肾上腺素受体抗体与心力衰竭的关系[D]. 姚红. 山西医科大学, 2008(06)
- [4]β-Adrenoceptors potentiate α1-adrenoceptor-mediated inotropic response in rat left atria[J]. Yong-zhen ZHANG, You-yi ZHANG, Ming-zhe CHEN, Qi-de HANInstitute of Vascular Medicine, Peking University Third Hospital; Key Laboratory of Ministry of Education for Molecular Cardiovasology, Beijing 100083, China. Acta Pharmacologica Sinica, 2004(01)
- [5]肾上腺素受体亚型基因表达变化在缺氧性肺动脉高压右心室肥厚发病中的作用[D]. 袁沛雄. 中国协和医科大学, 1995(11)