一、HCVC区基因在SP2/0细胞及荷瘤小鼠瘤内的表达（论文文献综述）
李仕存[1]（2020）在《旋毛虫对小鼠H22肝癌细胞生长的抑制作用及其机制研究》文中研究表明旋毛虫是一种具有独特生物学特性的食源性人兽共患寄生虫,它的整个生活周期都在同一宿主中完成,并且在不同的发育阶段其在宿主体内寄生的部位也不相同,旋毛虫成虫（Adult worm,Ad）主要寄生于宿主的肠道中,新生幼虫（Newborn larvae,NBL）主要分布在肠道和血液循环系统中,肌幼虫（Muscle larvae,ML）主要寄生于宿主的横纹肌中。为了在宿主体内创造一个适合自身生存的环境,同时又不对宿主产生过度的刺激,旋毛虫能够在各个发育阶段调节宿主的免疫应答,诱导宿主机体产生复杂的免疫反应。研究表明旋毛虫的排泄/分泌产物（Excretory/secretory products,ESP）具有多种生物学功能,ESP可降低旋毛虫入侵宿主细胞时引起的炎症反应、诱导宿主细胞凋亡、参与宿主细胞生理生化特性的改变以及细胞结构的重建等。基于ESP独特的生物学特性以及调控宿主免疫应答的能力,旋毛虫及其ESP已被用于不同疾病的治疗研究。国内外研究表明感染旋毛虫能够提高宿主对肿瘤的抵抗能力,旋毛虫ESP能够在体外抑制肿瘤细胞的增殖。但是目前旋毛虫抗肿瘤作用的具体机制尚不清楚。本研究旨在探究旋毛虫感染以及旋毛虫肌幼虫ESP（ML ESP）和成虫新生幼虫ESP混合物（Ad6 ESP）对小鼠H22肝癌细胞生长的抑制作用及其可能存在的作用机制。本研究采用感染旋毛虫（350条/只）第7 d的BALB/c小鼠,通过右前肢腋下注射5×106个小鼠H22肝癌细胞构建小鼠H22肝癌实体瘤模型,同时设置未感染旋毛虫的实体瘤模型作为对照组,探究旋毛虫感染对小鼠H22肝癌实体瘤的抑制作用,结果显示抑瘤率为63.49%,表明旋毛虫感染能够明显抑制小鼠H22肝癌实体瘤在小鼠体内的生长。为进一步探索旋毛虫感染诱导宿主免疫对抗小鼠H22肝癌实体瘤的作用,本研究将100只BALB/c小鼠随机分成空白组（20只）、旋毛虫组（20只）、荷瘤组（30只）、旋毛虫+荷瘤组（30只）。旋毛虫+荷瘤组小鼠在感染旋毛虫后的第7 d（实验第7天）接种小鼠H22肝癌细胞,荷瘤组与旋毛虫+荷瘤组小鼠接种小鼠H22肝癌细胞的时间点相同。在实验的第7 d,14 d,21 d,28 d,35 d每组各处死3只小鼠并收集脾细胞,一部分细胞用于培养收集上清,一部分细胞-80℃冰箱保存用于提取总RNA。采用qPCR法检测脾细胞中白细胞介素-2（IL-2）、干扰素-γ（IFN-γ）和白细胞介素-4（IL-4）的表达量,ELISA法检测脾细胞培养上清中的白细胞介素-2（IL-2）、干扰素-γ（IFN-γ）和白细胞介素-4（IL-4）的含量。结果显示旋毛虫组和旋毛虫+荷瘤组小鼠脾细胞中IL-2和IFN-γ的表达量在实验第7 d、14 d、21 d呈现较高水平的表达,在实验第28d、35 d旋毛虫组和旋毛虫+荷瘤组IL-2和IFN-γ的蛋白表达量下降且与空白组和荷瘤组相比差异不明显,旋毛虫组和旋毛虫+荷瘤组小鼠脾细胞培养上清中IL-4的表达量在实验第14 d、21 d一直处于高表达状态,表明旋毛虫感染早期诱导宿主产生的Th1细胞因子IL-2、IFN-γ可能抑制肿瘤的进一步发展。此外本实验收集旋毛虫不同时期的ESP,于体外探究其对小鼠H22肝癌细胞的细胞增殖和细胞凋亡的影响,通过建立旋毛虫与肿瘤共感染模型于体内探究旋毛虫感染是否能够诱导肿瘤组织内细胞发生凋亡。CCK-8检测结果显示当旋毛虫ML ESP和Ad6 ESP浓度大于0.2 mg/mL时对小鼠H22肝癌细胞的细胞增殖具有明显的抑制作用。Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测显示浓度为0.4mg/mL的旋毛虫ML ESP和Ad6 ESP刺激小鼠H22肝癌细胞48h后的凋亡率分别为18.02%和14.89%,Western blotting检测结果显示小鼠H22肝癌细胞和肿瘤组织中Bax/Bcl-2比例和Caspase-3的表达量均上调。结果表明ML ESP和Ad6 ESP能够对小鼠H22肝癌细胞的生长产生抑制作用并诱导其发生凋亡,旋毛虫感染的H22荷瘤小鼠肿瘤组织内促凋亡基因Bax和Caspase-3表达量升高,促进了肿瘤组织内细胞凋亡,抑制了小鼠H22肝癌实体瘤的进一步发展。
王栋良[2]（2017）在《鞣花酸抑制人脑胶质母细胞瘤细胞生长的实验研究及机制探讨》文中认为第一部分鞣花酸抑制人脑胶质母细胞瘤U87和U118细胞生长的现象观察目的:探讨鞣花酸（Ellagic acid,EA）对人脑胶质母细胞瘤（Glioblastoma multiforme,GBM）细胞U87、U118细胞增殖、凋亡、侵袭的影响。方法:应用CCK-8法检测EA对U87、U118细胞活性的影响;应用克隆形成实验、EdU实验检测EA对U87、U118细胞增殖能力的影响;应用流式细胞术检测EA对U87、U118细胞周期的影响;应用流式细胞术、Hoechst33342/PI双染法检测EA对U87、U118细胞凋亡的影响;应用细胞划痕实验观察EA对U87、U118细胞迁移能力的影响;应用Transwell assay实验观察EA对U87、U118细胞侵袭能力的影响;结果:EA可以抑制人脑GBM细胞U87、U118的细胞活性,其抑制作用呈浓度、时间依赖性,EA处理瘤细胞48h后,U87、U118细胞的IC50分别为91.2μM、98.6μM。克隆形成实验中,经EA处理的瘤细胞克隆形成数明显低于对照组（P<0.05）,说明EA能有效抑制U87、U118细胞的增殖。EdU实验中,经EA处理的U87、U118细胞的增殖能力大大减弱。流式细胞术检测细胞周期发现,经100μM的EA处理48h后,U87细胞和U118细胞处于细胞周期S期的细胞数分别增加10.89%、11.54%,而处于G1期、G2/M期的细胞数明显减少,差异显着（P<0.05）,说明EA干扰U87、U118细胞的细胞周期进程,使细胞周期阻滞在S期。流式细胞术凋亡检测表明,经100μM的EA处理瘤细胞48h后,U87、U118 细胞的凋亡率分别从（7.58±1.13）%、（9.33±0.27）%上升到（23.49±0.64）%、（19.84±1.06）%,说明 EA 诱导 GBMU87、U118 细胞凋亡。Hoechst33342/PI双染实验发现,EA处理组出现大量呈凋亡形态的细胞。细胞划痕实验中,U87细胞的对照组、50μM的EA处理组划痕的愈合率分别为（51.69±0.29）%,（31.82±0.44）%;U118细胞的对照组、50μM的EA处理组划痕的愈合率分别为（49.75±0.64）%,（29.82±0.69）%;差异显着（p<0.05）,说明 EA 能有效抑制GBMU87、U118细胞的迁移。Transwell侵袭实验中,U87细胞的对照组、l00μM的EA处理组透膜细胞数分别为（82±3）个、（31±1）个;U118细胞的对照组、100μM的EA处理组透膜细胞数分别为（97±6）个、（50±4）个;说明EA能有效抑制GBMU87、U118细胞的侵袭。结论:EA能抑制GBMU87、U118细胞的增殖,促进其凋亡,抑制其侵袭。第二部分鞣花酸抑制人脑胶质母细胞瘤U87和U118细胞生长的机制初探目的:探讨鞣花酸（Ellagic acid,EA）抑制胶质母细胞瘤（Glioblastomamultifore,GBM）U87、U118细胞增殖,促进其凋亡,抑制其侵袭的分子机制。方法:应用免疫荧光化学检测对照组和实验组细胞的DNA双链断裂情况;应用JC-1线粒体膜电位检测试剂盒检测EA对GBMU87、U118细胞线粒体膜电位的影响;应用明胶酶谱实验检测EA对GBMU87、U118细胞中MMP-9、MMP-2活性的影响;应用Western blot检测EA对GBMU87、U118细胞增殖、凋亡、侵袭等相关基因表达水平的影响。结果:EA通过损伤GBM U87、U118细胞的DNA引起细胞周期阻滞,进而抑制细胞增殖。EA能引起GBMU87、U118细胞的线粒体膜电位下降,导致细胞凋亡。明胶酶谱实验中,100μM的EA处理瘤细胞24h后,U87细胞MMP-9、MMP-2 的活性水平分别下降（78.31±2.53）%、（32.48±1..37）%;U118 细胞 MMP-9、MMP-2 的活性水平分别下降（60.94±4.47）%、（8.99±1.02）%;差异显着（p<0.05）,说明EA能抑制GBMU87、U118细胞MMP-9、MMP-2的活性。增殖相关基因Western blot 结果显示,实验组细胞中 PCNA、Ki67、CyclinA2、Cyclin D1、CDK-2、CDK-6的表达下调;凋亡相关基因Western blot结果显示,实验组细胞中Bcl-2的表达下调,而 Cleaved PARP、Bax、Active Caspase-3、DR4、DR5 的表达上调;侵袭相关基因Western blot结果显示,实验组细胞E-Cadherin的表达上调,而Snail、MMP-2、MMP-9的表达下调。而且实验组细胞Akt、p-Akt、Notch1、Notch3的表达下调。结论:EA抑制GBMU87、U118细胞的生长,其可能的分子机制是EA通过调控Akt、Notch信号通路而调节细胞的增殖、凋亡、侵袭等相关基因的表达。第三部分 鞣花酸抑制人脑胶质母细胞瘤细胞生长的体内实验研究目的:观察鞣花酸（Ellagic acid,EA）抑制胶质母细胞瘤（Glioblastoma multiforme,GBM）U87细胞异体移植瘤生长的现象,探讨其机制,并评估EA的不良反应。方法:将GBMU87细胞悬液接种在Balb/c裸鼠皮下成瘤,约2周后取出,切碎后二次接种成瘤,造模成功后随机分组,实验组进行EA灌胃,对照组用生理盐水灌胃。观察EA对移植瘤、小鼠体重的影响;对移植瘤行HE染色、免疫组化染色等病理学分析,检测增殖、凋亡、侵袭相关基因的表达水平;同时解剖荷瘤小鼠观察其内脏情况,并进行血常规、肝肾功、心肌酶等血液学分析。结果:EA能明显抑制移植瘤的生长,平均抑制率为37.40%,与对照组相比,差异显着（P<0.05）。HE染色发现实验组肿瘤组织中出现坏死灶、炎性反应减轻、病理性核分裂减少等现象。免疫组化染色发现,实验组肿瘤组织中增殖相关基因PCNA、Ki67、CyclinA2、CyclinD1、CDK-2、CDK-6 的表达下调;凋亡相关基因 Cleaved PARP、Bax、Active Caspase-3、DR4、DR5 的表达上调,而 Bcl-2 的表达下调;侵袭相关基因E-Cadherin的表达上调,而Snail、MMP-2、MMP-9的表达下调。同时实验组肿瘤组织中Akt、p-Akt、Notch1、Notch3的表达下调。实验组和对照组荷瘤小鼠的体重无明显差异;实验组荷瘤小鼠的内脏形态及血液学指标无明显异常。结论:EA通过调节Akt、Notch信号通路抑制U87细胞异体移植瘤的生长,未出现明显的不良反应。
刘珊[3]（2016）在《重组长效透明质酸酶的构建及其在皮下给药与肿瘤治疗中的应用研究》文中进行了进一步梳理透明质酸酶通过降解皮肤组织或者肿瘤微环境中的透明质酸,提高组织的通透性从而有利于药物扩散,在皮下给药以及肿瘤治疗中均有很好的应用前景。但是在皮下给药中,联合透明质酸酶给药之后,大分子药物的生物利用度仍与静脉给药存在较大差距,原因在于天然透明质酸酶无法在皮下长效发挥作用。另一方面在肿瘤治疗的应用中,天然透明质酸酶因其体内循环半衰期短严重影响了药效的发挥。因此,本论文针对透明质酸酶这两大应用领域存在的问题,采用基因工程技术构建重组长效透明质酸酶,以期提升大分子皮下给药的生物利用度以及实现对体内肿瘤的药效提升效果。论文具体开展的研究工作如下：1.重组透明质酸酶分子构建及高表达克隆的筛选。采用分子克隆技术成功构建Igκ-rhPH20、Igκ-rhPH20-HSA与Igκ-rhPH20-Fc的融合基因,DNA片段大小分别为1438 bpV、2012 bp与2077 bp;整合到表达载体之后将其成功转染到宿主细胞中,筛选克隆并进行表达量的比较：对于不同宿主细胞,CHO KSD细胞获得克隆的平均表达水平（18U/24h·mL）高于CHOS细胞（12U/24h·mL）;另外,构建带有IRES-eGFP的双顺反子表达载体,成功根据荧光强度通过流式分选术筛选高表达克隆,该法高效快速,获得克隆稳定性好：并且考察了载体结构对蛋白表达量的影响,载体GC含量高,DNA对转录因子开放,蛋白表达量上调。2.透明质酸酶重组细胞培养并进行蛋白纯化。对三种重组透明质酸酶rhPH20、 rhPH20-Fc以及rhPH20-HSA的克隆40 mL批次培养基础表达量为402 U/mL、596 U/mL以及737 U/mL。在5 L激流式生物反应式实现了培养工艺的优化及放大。确定了不同蛋白的层析柱选择以及层析条件,获得不同蛋白分子量分别为,61 kDa（rhPH20）,79 kDa （rhPH20-HSA）以及190 kDa （rhPH20-Fc）。比较三种重组蛋白比活性：rhPH20为106,724 U/mL; rhPH20-HSA为10,256U/mL,维持原来10%左右的活性,rhPH20-Fc为40,124 U/mL,能维持原来40%的活性。优化了蛋白冻干制剂配方,能够维持较好的赋型效果以及蛋白稳定性。3.以裸鼠为实验对象,考察重组透明质酸酶rhPH20-HSA及rhPH20-Fc的皮下作用效果考察以及联合给药对药代动力学的影响。不同的来源的透明质酸酶,包括牛源蛋白以及人源的天然蛋白与融合蛋白,在同等活性单位条件下,短时间（≤45 min）内对台盼蓝皮下扩散的促进效果差别不大,并且透明质酸酶对染料的促进扩散作用呈现剂量依赖性。而在皮下结构重建方面,重组透明质酸酶rhPH20与提纯的透明质酸酶产品在24h内皮肤结构恢复,rhPH20-Fc与rhPH20-HSA在小鼠皮下更稳定,造成皮下空洞恢复时间由延长到85～120h,成功实现了皮下长效。透明质酸酶与蛋白药物联合给药,均能够增加AUC,增大Cmax,并且Tmax提前。对于Stelara, rhPH20-Fc将其生物利用度由rhPH20组的85.9%提升到93.1%;对于250 kDa的TFI大分子,rhPH20联用生物利用度提升至63.8%,而与长效rhPH20-Fc联用生物利用度提升至96.6%,接近静脉给药。4.比较性研究了透明质酸酶对不同尺寸肿瘤治疗药物的促进扩散作用以及药效提升效果。选取三种不同尺寸的典型抗肿瘤药物：大小约为1.5×1.0×0.7nm的小分子化疗药物阿霉素（Dox）、直径约10～15nm的曲妥珠单抗（Tmab）以及长120nm×宽35 nm的热疗药物金纳米棒（GNR）。透明质酸酶（rhPH20和rhPH20-Fc）对二维细胞水平药物量效关系没有影响,仅在胞外基质以及肿瘤微环境存在的三维细胞培养水平对三种药物的扩散、蓄积及生长抑制表现出不同程度的促进作用。其中对抗体扩散的增幅最大,其扩散系数从4.47×10-4μm2/s分别增大到1.72×10-3μm2/s和1.69×10-3μm2/s。重组透明质酸酶rhPH20-Fc在体内比原始rhPH20更稳定,rhPH20的循环半衰期仅为2.3 min,融合透明质酸酶rhPH20-Fc的循环半衰期提升至2.8 h,是原始蛋白的73倍,大幅提升血液循环时间能够增加透明质酸酶在肿瘤组织的截留。rhPH20-Fc促进瘤内药物扩散,利于药物在瘤内的蓄积,并且增强了化疗药物对肿瘤生长的抑制作用,针对三种药物不同治疗效果进行定量分析,发现对抗体分子的辅助治疗效果最好。
洪波[4]（2015）在《B7-H4在胰腺癌中的表达及其临床意义》文中提出背景与目的：胰腺癌是一种以起病隐匿、生长迅速并早期转移为特征的消化系统恶性肿瘤,是死亡率最高的恶性肿瘤之一,目前尚无有效的治疗措施,其发病率在世界范围内呈逐年上升趋势。由于胰腺组织的解剖位置关系,早期症状不明显且缺乏有效的检测手段,大多数患者就诊时已为中晚期,预后差,5年生存率不足5%。早期发现与早期诊断是改善胰腺癌患者预后的有效措施之一。因此,寻找早期诊断、特异性强、灵敏度高的肿瘤分子标记物对于改善胰腺癌患者的预后具有重要的临床意义,同时也能为胰腺癌新型靶向治疗技术提供依据。B7-H4（也称为B7S1或B7x）是新近发现的B7家族成员,能抑制T细胞增殖、细胞因子产生和细胞周期的进行,从而抑制T细胞介导的免疫应答。B7-H4在肿瘤免疫应答中起重要作用。B7-H4mRNA的在脾、肺、胸腺、胎盘、肝、肾等正常组织中均有表达,然而,免疫组化显示,B7-H4蛋白在正常外周组织中几乎没有阳性表达,而在一些肿瘤组织中有丰富表达,例如乳腺癌、卵巢癌、肾癌、前列腺癌和非小细胞肺癌,并与肿瘤进展密切相关。鉴于目前尚无可用于多种方法检测B7-H4表达的抗体出售,本研究以稳定表达B7-H4的3T3-B7-H4细胞为免疫原,制备了能稳定分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并对其进行了生物学特性分析。同时,应用免疫组织化学染色检测B7-H4在胰腺癌组织中的表达,探讨B7-H4的表达与胰腺癌临床病理特征之间的关系,分析B7-H4在胰腺癌诊疗及预后判断等方面的潜在价值。方法：1.以稳定表达B7-H4胞外段的3T3-B7-H4细胞为免疫原,免疫Babl/C小鼠；应用常规杂交瘤技术将免疫的小鼠脾细胞与Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞融合,使用间接ELISA方法筛选分泌抗B7-H4单克隆抗体的杂交瘤细胞株。并对所获得的单克隆抗体进行亚型鉴定,使用Western blotting、免疫沉淀等方法对单克隆抗体特异性进行鉴定。2.利用制备的小鼠抗B7-H4单克隆抗体,通过免疫组化（IHC）等方法分析B7-H4在胰腺癌组织中的表达特征,并评价其与临床病理特征的关系。结果：1.获得1株亚型为IgM、轻链为κ型的针对B7-H4的鼠源单克隆抗体：特异性抗B7-H4的单抗3E8能用于免疫沉淀（IP）及IHC等方法检测组织及细胞中的B7-H4表达。2.免疫组化显示：胰腺癌组织中B7-H4在胞浆和（或）胞膜弥漫表达,表达量显着高于正常胰腺组织（P<0.05）。B7-H4在临床肿瘤分级较高患者的胰腺癌组织及有淋巴结转移患者的胰腺癌组织中表达显着增强。结论：成功获得了特异性抗B7-H4的单克隆抗体,B7-H4在胰腺癌组织中表达上调,并与患者肿瘤分级和淋巴结转移密切相关。
潘建青[5]（2009）在《重组腺相关病毒介导的转EB病毒潜伏期膜蛋白治疗鼻咽癌的试验研究》文中研究指明背景和目标：鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是我国南方的常见肿瘤。EB病毒（Epstein Barr virus，EBV）是鼻咽癌最重要的病因。鼻咽癌的组织中有EB病毒潜伏期膜蛋白1、2不同程度的表达。研究发现，很少的EB病毒携带者能产生LMP1特异性细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL），这提示我们建立一个针对LMP1和LMP2的特异性细胞毒性T淋巴细胞反应，对鼻咽癌患者应该有长期的治疗效果。腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）是目前最常用的基因治疗载体，它拥有一些独特的优点：可以携带基因转染分裂期和非分裂期细胞、无致病性、能驱动基因在体内长期、稳定的表达。在本研究中，我们利用腺相关病毒载体，以EB病毒潜伏期膜蛋白1、2的基因作为表位，并融合了热休克蛋白作为佐剂，构建了一种鼻咽癌疫苗。方法：1．我们首先克隆了EB病毒LMP1、LMP2基因的编码序列，并构建pAAV-LMP2／1-hsp重组质粒，然后与重组腺相关病毒包装质粒pXX2，辅助质粒phelper，通过磷酸钙沉淀法共转染293细胞，包装制备rAAV-LMP2／1-hsp病毒，同时包装制备对照病毒rAAV-GFP，病毒经纯化后以斑点杂交方法检测其病毒滴度。2．SP2／0细胞转染了pCDNA3．1-LMP2质粒，然后通过G418（400ug／ml）筛选，得到稳定表达LMP2的阳性细胞株SP 2／0-LMP2。3．LMP2228-242肽注射于新西兰白兔的皮下，6周后，收集血清、纯化后得到兔抗LMP2多克隆抗体。4．为确认rAAV转染细胞后嵌合基因是否有表达，我们用1×109的病毒颗粒感染293细胞，2天后提取蛋白，通过免疫印迹法检测嵌合基因的表达。5．我们采用了两个不同的免疫策略。第一种方法：首先肌肉注射rAAV-LMP2／1-hsp或rAAV GFP免疫BALB／c小鼠。3周后，动物皮下注射SP2／0-LMP2或SP2／0细胞成瘤，观察30天，定期测量肿瘤直径。第二种方法：首先BALB／c小鼠皮下注射SP2／0-LMP2或SP2／0细胞，10天后肌肉注射rAAV-LMP2／1-hsp或rAAV GFP免疫动物，定期测量肿瘤直径。6．为分析rAAV疫苗的细胞免疫反应，BALB／c小鼠分为3组，分别肌肉注射rAAV-LMP2／1-hsp、rAAVGFP或PBS，3周后杀死动物，取脾细胞。SP2／0-LMP2或SP2／0细胞作为靶细胞，小鼠脾细胞作为效应细胞，以LDH释放法测定细胞毒性T细胞功能。7．为研究rAAV疫苗的免疫机制，我们把BALB／c小鼠分为3组，分别肌肉注射rAAV-LMP2／1-hsp、rAAV GFP或PBS。3周后杀死动物，取脾细胞，分别以LMP2特异性表位肽或非特异性肽干预，培养4天后，以MTT法测定T细胞增殖。结果：1．经过酶切鉴定、PCR、测序法证实重组腺相关病毒质粒pAAV-LMP2／1-hsp构建成功。2．免疫印迹法证实该病毒转染293细胞后可表达融合蛋白。3．先用rAAVLMP2／1-hsp或rAAV GFP免疫BALB／c小鼠，然后接种SP2／0或SP2／0-LMP2细胞，虽然各组都能成瘤，但是rAAV-LMP2／1-hsp组的肿瘤生长速度明显比其他各组缓慢，而其他各组之间无差异。第35天，rAAV LMP2／1-hsp免疫组的肿瘤体积大约是rAAV GFP免疫组的1／5。4．先接种SP2／0或SP2／0-LMP2细胞，然后用rAAVLMP2／1-hsp或rAAV GFP免疫BALB／c小鼠。rAAV-GFP免疫组的小鼠肿瘤进展迅速，在免疫的第20天全部死亡；而rAAV LMP2／1-hsp免疫组的小鼠肿瘤生长缓慢，生存时间明显延长。5．BALB／c小鼠接种rAAV-LMP2／1-hsp，rAAV-GFP或生理盐水，3周后杀死动物，分离培养脾细胞。用SP2／0-LMP2或SP2／0细胞作为靶细胞，小鼠脾细胞作为效应细胞，以LDH释放法测定细胞毒性T细胞功能，结果显示rAAV-LMP2／1-hsp免疫组的脾细胞在LMP2表位肽的刺激下裂解SP2／0-LMP2和SP2／0细胞，而其他各组不发生裂解。6．以MTT法测定T细胞增殖反应，结果显示来源于rAAV-E7CTL-hsp免疫组的小鼠T细胞在LMP2表位肽的刺激作用下发生增值，而其他组T细胞不增值。结论：利用腺相关病毒载体成功构建了一种鼻咽癌疫苗，以EB病毒潜伏期膜蛋白1、2的基因作为表位，并融合了热休克蛋白作为佐剂，该疫苗可能通过诱导细胞毒性T细胞反应，发挥抗肿瘤的效应。该项研究有希望投入临床应用。
刘艳华[6]（2008）在《小分子重组免疫毒素GnRH-luffinS的制备及其靶向治疗肿瘤的实验研究》文中指出重组免疫毒素是由靶向区和细胞毒性区组成、可以识别并选择性杀伤特定细胞的融合蛋白,是一类重要的肿瘤靶向性治疗药物。靶向区为能与肿瘤细胞表面抗原特异结合的抗体、细胞因子或激素,毒性区为细菌毒素,如铜绿假单胞菌外毒素（PE）和白喉毒素（DT）,或植物毒素,如蓖麻毒素（RT）、美洲商陆抗病毒蛋白（PAP）和皂草素等。重组免疫毒素用于恶性肿瘤的导向治疗已取得很大成功,如以人IL-2为导向分子,以DT为毒性部分的免疫毒素制剂（商品名ONTKA）已获得美国FDA批准,用于治疗皮肤T细胞淋巴瘤（CTCL）,另有多种重组免疫毒素在临床试验研究中也显示出良好的抗肿瘤效果。尽管重组免疫毒素具有广阔的应用前景,但是在临床应用中仍面临许多挑战,如免疫原性强和穿透性差,解决方法之一就是构建小分子的重组免疫毒素。丝瓜毒素（luffin）LuffinP1和luffinS2是从丝瓜籽中分离到的两种只有5kDa和8kDa的小分子量I型核糖体失活蛋白（RIP）,具有N-糖苷酶活性,能特异性水解真核细胞核糖体28s rRNA 4324位的腺嘌呤,使真核细胞核糖体60s大亚基失活,从而抑制蛋白质合成,对兔网织红细胞裂解液的IC50分别为10-9和10-10M左右,可作为潜在的免疫毒素弹头分子。人Ⅰ型促性腺激素释放激素（ gonadotropin-releasing hormone, GnRH或luteinizing hormone-releasing hormone, LHRH）是下丘脑分泌的一种十肽类激素,用于调控脑垂体促黄体生成素（LH）和促卵泡激素（FSH）的分泌。GnRH受体通常分布于脑垂体、性腺的细胞膜上,但研究发现,GnRH受体也高表达于某些癌细胞表面,如乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、胰腺癌、前列腺癌及肝癌细胞等。因此GnRH和相关肽已经应用于妇科学和肿瘤学领域的研究,如用于性腺机能减退、不育症和性腺依赖性肿瘤的治疗。另外,肿瘤细胞表面的GnRH受体与GnRH有较高的亲和力,因此GnRH可以作为肿瘤靶向治疗中的导向分子。如制备的LHRH-PE40重组免疫毒素对人多种肿瘤细胞系有明显的杀伤作用,目前已进入临床试验阶段。因此,以GnRH为导向分子、以luffinP1或luffinS2为毒性部分构建的重组免疫毒素是一种潜在的免疫原性低、穿透力强的小分子抗肿瘤药物。本文首先克隆并原核表达了luffinP1和luffinS2蛋白,测定其蛋白合成抑制作用,筛选活性较高的蛋白作为重组免疫毒素的毒性部分;随后将GnRH与luffinS2进行基因融合,原核表达并纯化GnRH-luffinS2和luffinS2-GnRH融合毒素,测定其体外细胞毒作用;因为铜绿假单胞菌外毒素转膜区（PEⅡ区）具有蛋白酶识别位点和转膜功能,能提高重组免疫毒素的转膜效率,并能使重组免疫毒素的毒性部分和导向部分在胞内分离,从而提高重组免疫毒素的细胞毒作用,所以将其插入到GnRH和luffinS2之间,构建GnRH-PEⅡ-luffinS重组免疫毒素,表达纯化后测定其体内外抑肿瘤活性。具体的实验内容和结果如下:1. luffinP1和luffinS2全长基因的克隆、表达和活性研究（1）利用Codon软件,设计luffinP1和luffinS2的重叠PCR引物,通过对重叠PCR反应体系和条件的优化,扩增得到了luffinP1和luffinS2的全长基因。（2）luffinP1和luffinS2分别与表达载体pET-His、pET32a、pQE30和pBV220连接,构建pET-His/luffinP1、pET-His/luffinS2、pET32a/luffinP1、pET32a/luffinS2、pQE30/luffinP1、pQE30/luffinS2、pBV220/luffinP1和pBV220/luffinS2表达载体,转化宿主菌,并诱导表达。结果只有pET32a/luffinP1和pET32a/luffinS2转化BL21（DE3）大肠埃希杆菌后获得表达,且均为可溶性表达。经亲和层析纯化后,获得Trx-luffinP1和Trx-luffinS2融合蛋白。随后,利用重组肠激酶（rEK）将Trx-luffinP1和Trx-luffinS2融合蛋白切割,获得rluffinP1和rluffinS2。（3）测定rluffinP1和rluffinS2对兔网织红细胞裂解液的蛋白合成抑制作用。结果表明,rluffinP1和rluffinS2的IC50分别为9.51μg/ml和1.58μg/ml,因此选择luffinS2作为重组免疫毒素的毒性部分。2. GnRH-luffinS2和luffinS2-GnRH融合蛋白的克隆、表达和活性研究（1）因为无法确定GnRH和luffinS2的连接顺序对GnRH和luffinS2的活性是否有影响,因此设计了GnRH-luffinS2（GnRH在N端）和luffinS2-GnRH（GnRH在C端）融合蛋白,并对其二级进行预测。（2）利用Codon软件,设计了GnRH-luffinS2和luffinS2-GnRH的重叠PCR引物,通过对重叠PCR反应体系和条件的优化,扩增得到了GnRH-luffinS2和luffinS2-GnRH的全长基因。（3）GnRH-luffinS2和luffinS2-GnRH分别与pET-His、pET32a、pQE30和pBV220连接,构建pET-His/GnRH-luffinS2、pET-His/luffinS2-GnRH、pET32a/GnRH-luffinS2、pET32a/luffinS2-GnRH、pQE30/GnRH-luffinS2、pQE30/luffinS2-GnRH、pBV220/GnRH-luffinS2和pBV220/luffinS2-GnRH原核表达载体,转化宿主菌,并诱导表达。结果只有pET32a/GnRH-luffinS2和pET32a/luffinS2-GnRH转化BL21（DE3）后获得表达,且均为可溶性表达。经亲和层析纯化后,获得了Trx-GnRH-luffinS2和Trx-luffinS2-GnRH。随后,利用rEK将Trx-GnRH-luffinS2和Trx-luffinS2-GnRH融合蛋白切割,获得rGnRH-luffinS2和rluffinS2-GnRH。（4）采用XTT法测定rGnRH-luffinS2和rluffinS2-GnRH对体外肿瘤细胞Hela、A549、HepG-2、SP2/0和CEF细胞毒性作用。结果表明,rGnRH-luffinS2对上述细胞的IC50分别为67.19μg/ml、70.42μg/ml、84.44μg/ml和106.25μg/ml,rluffinS2-GnRH对上述细胞的IC50分别79.5μg/ml、76.7μg/ml、96.2μg/ml和137μg/ml,两种融合毒素对CEF均无毒性,表明rGnRH-luffinS2和rluffinS2-GnRH具有一定的抗肿瘤作用,但活性不高。3. GnRH-PEⅡ-luffinS2融合蛋白的克隆、表达和抗肿瘤活性研究（ 1 ）利用PEⅡ具有转膜区和蛋白酶识别位点的特性,设计GnRH-PEⅡ-luffinS重组毒素并对其二级进行预测。（2）利用Codon软件,设计了GnRH-PEⅡ-luffinS的重叠PCR引物,通过对重叠PCR反应体系和条件的优化,扩增得到了GnRH-PEⅡ-luffinS的全长基因。（3）选择pET32a为表达载体,构建pET32a/GnRH-PEⅡ-luffinS表达载体,转化BL21（DE3）大肠埃希杆菌后获得表达,蛋白以包涵体形式存在。经亲和层析纯化后,获得了Trx-GnRH-PEⅡ-luffinS融合蛋白,蛋白经透析复性和超滤浓缩后,利用rEK将Trx-GnRH-PEⅡ-luffinS融合蛋白切割为Trx和rGnRH-PEⅡ-luffinS。（4）采用XTT法测定rGnRH-PEⅡ-luffinS在体外对Hela、A549、HepG-2、SP2/0和CEF细胞毒性作用。结果表明,rGnRH-PEⅡ-luffinS对上述细胞的IC50分别为13.50μg/ml、13.74μg/ml、16.79μg/ml和26.07μg/ml,对CEF无作用,表明具有较强的抗肿瘤作用。（5）建立BALB/c小鼠的SP2/0实体瘤模型,检测rGnRH-PEⅡ-luffinS体内抗肿瘤活性。结果表明,剂量为100μg/只,瘤区内穿刺注射,连续10d给药时,rGnRH-PEⅡ-luffinS对SP2/0实体瘤的抑瘤率为50.3%,显示rGnRH-PEⅡ-luffinS具有一定的抗肿瘤作用。综上所述,本研究原核表达了luffinP1和luffinS2蛋白,利用兔网织红细胞裂解液证实luffinS2具有较高的蛋白合成抑制作用;然后构建了以GnRH为导向分子,以luffinS2为毒性分子的小分子重组免疫毒素GnRH-luffinS2和luffinS2-GnRH,体外对Hela、A549、HepG-2、SP2/0细胞毒实验表明,GnRH-luffinS2和luffinS2-GnRH的细胞毒性较低;为提高重组免疫毒素的细胞毒性,将PEⅡ插入到GnRH和luffinS之间,构建了GnRH-PEⅡ-luffinS重组免疫毒素。体外细胞毒实验表明,其细胞毒性获得明显提高,体内抑瘤实验表明,GnRH-PEⅡ-luffinS具有一定抗肿瘤活性,为进一步探讨其作为抗肿瘤药物的临床应用奠定了基础。
张存[7]（2008）在《B7-H1疫苗增强HER-2疫苗抗肿瘤免疫效应的研究》文中认为虽然肿瘤疫苗在动物和人体内可诱发特异性的抗肿瘤免疫反应,但其临床治疗效果较差。免疫系统不能引起肿瘤消退是肿瘤疫苗研究中所面临的一个巨大难题。已知肿瘤存在多种逃避免疫系统识别和攻击的机制,研究肿瘤免疫逃逸机制对于提高肿瘤疫苗的治疗效果具有重要意义。B7-H1是共刺激分子家族新成员之一。通过与T细胞和B细胞表面的PD-1和非PD-1受体结合参与T细胞功能调节和细胞因子分泌。B7-H1蛋白分子在正常组织中几乎不表达,但普遍存在于人肺癌、卵巢癌、结肠癌、肾癌和黑色素瘤等多种肿瘤细胞表面,并且与肿瘤的进展程度相关。在外周组织,肿瘤细胞表面的B7-H1能诱导肿瘤特异性CTL凋亡从而抑制机体对肿瘤的免疫反应;而在淋巴器官内,抗原呈递细胞表面的B7-H1与初始T淋巴细胞相互作用诱导T淋巴细胞的无能。因此,理论上,B7-H1即可以作为一种肿瘤抗原,又是参与肿瘤免疫逃逸的重要分子;阻断B7-H1,既能直接抑制肿瘤的生长,又能抑制肿瘤的免疫逃避,提高初始T细胞的激活能力和CTL的杀伤活性,从而提高其它抗原的免疫反应。HER2/neu蛋白是一种肿瘤相关抗原,在多种肿瘤细胞中过表达,并且与肿瘤的预后不良相关,是肿瘤免疫治疗的理想靶点。HER-2的单抗Herceptin于1998年被美国FDA批准上市,在治疗HER-2阳性乳腺癌转移患者中取得了明显疗效;但Herceptin有心脏毒性的毒副作用。HER-2的主动免疫治疗——疫苗,能够激活CTL,诱导多克隆抗体反应,从而更好的激发抗体依赖的效应功能,与被动的单抗治疗相比有更大优势。多年来,针对HER-2的疫苗研究层出不穷,类型多样,包括多肽疫苗,基因疫苗,细胞疫苗等。但是由于HER-2是自身抗原,难以突破免疫耐受;肿瘤又存在多种免疫逃避的方式,疫苗实验始终不能诱导有效的免疫反应。本实验室之前工作已证实B7-H1蛋白疫苗免疫小鼠可诱导出高滴度的抗B7-H1抗体,并能够明显抑制B7-H1+SP20转移瘤的生长.本课题旨在证实B7-H1蛋白疫苗能否切实阻断一般转移瘤的免疫逃避,提高相应肿瘤抗原的免疫反应和抑瘤效果。在本课题中,我们根据文献报道,选取了HER-2分子中包含抗原表位较多,抗原性较强的胞外区近膜端一段序列,构建HER-2疫苗。将分泌性较强的人Ig的信号肽序列融合HER-2基因片段,插入真核表达载体pRC-CMV中构建了HER-2基因疫苗——pRC-CMV-信号肽-HER2-ECD片段（简称为CH疫苗）;又将这段HER-2序列插入原核表达载体pQE-30中,构建了pQE-30-rhHER2重组质粒,转化大肠杆菌,进行了蛋白的表达与纯化,得到HER2-ECD多肽疫苗（简称为pH疫苗）。另外,活化本实验室保存的包含pQE-30-TT-B7-H1IgV重组质粒的菌种,按之前的工艺表达纯化B7-H1IgV蛋白。分别用CH疫苗和pH疫苗与B7-H1疫苗联合免疫BALB/c小鼠,用ELISA,ELISPOT方法检测抗体滴度和CTL反应,观察疫苗是否具有协同效应,结果显示B7-H1疫苗能增强CH疫苗和pH疫苗诱导的体液和细胞免疫反应。进一步观察疫苗联合应用能否具有更强的抗肿瘤效果,小鼠免疫后,接种HER-2/neu+小鼠乳腺癌细胞株EMT6,结果显示疫苗能够抑制转移瘤的生长,并且疫苗联合应用抑瘤效果最好,说明疫苗具有协同作用,B7-H1疫苗能增强CH疫苗和pH疫苗的抑瘤效果。又观察了疫苗对荷瘤小鼠的治疗作用,结果显示疫苗能在一定程度上抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长。虽然荷瘤小鼠的肿瘤个体差异很大,但能看出疫苗联合应用更有效的抑制了肿瘤的生长。最后,本实验分析了疫苗应用的毒理作用。常规免疫BALB/c小鼠,分别观察各实验组小鼠的进食,体重等一般状况,血液学和血清生化学指标,重要脏器组织的大体病理学,组织病理学情况及相对重量,CD4/CD8细胞百分率和比值。结果显示基因疫苗组的小鼠体重减轻,说明基因疫苗有一定毒性。血液学和血清生化学检查有个别组的个别指标上下浮动;各脏器未发生显着的异常所见,也未发现小鼠明显的组织病理学病变。免疫组的CD4+细胞百分率普遍增高,说明引起了免疫反应。本实验证实了B7-H1疫苗与HER-2肿瘤疫苗联合应用具有协同作用,B7-H1疫苗能显着增强HER-2肿瘤疫苗诱导的体液和细胞免疫反应,并能进一步提高HER-2肿瘤疫苗的抑瘤效果。为构建既能提高抗肿瘤特异性免疫反应,又可阻断肿瘤免疫逃避的肿瘤疫苗提供新的设计思路和实验依据。
张媛媛[8]（2007）在《旋毛虫抗Hepa1-6肿瘤效应的研究》文中研究说明本试验分别于荷瘤前11d及荷瘤后7d给C57BL/6小鼠接种未经处理的旋毛虫、Co60处理旋毛虫和紫外线处理旋毛虫;于免疫旋毛虫可溶性粗抗原和ES抗原后7d荷瘤,通过对肿瘤的体积、重量、抑瘤率和免疫指标的分析,观测旋毛虫虫体和旋毛虫抗原对体内Hepa1-6肝癌细胞是否有抑制作用。然后用ELISA方法初步确定旋毛虫抗原与Hepa1-6肝癌细胞之间是否存在相关抗原,最后通过SDS-PAGE、Western-blot进一步确定两者相关抗原分子量大小。试验结果表明:未经处理的旋毛虫抑制Hepa1-6肝癌细胞的效果优于Co60处理旋毛虫和紫外线处理旋毛虫（P<0.05）;旋毛虫肌幼虫ES抗原和旋毛虫可溶性粗抗原都有较好的抑瘤效果（P<0.05）;ELISA检测发现旋毛虫与Hepa1-6肝癌细胞间存在相关抗原,Western-blot结果显示:旋毛虫可溶性抗原与Hepa1-6肝癌细胞高免血清反应条带的相对分子量为26.0 kDa左右及130kDa,Hepa1-6肝癌抗原与旋毛虫高免血清反应条带的相对分子量为94.0kDa,35.0kDa和14.4kDa。
甘愉[9]（2007）在《腺病毒介导的HCCS1基因抗肿瘤作用及其机制的研究Prohibitin（PHB）作为肿瘤血清标志物的初步研究》文中认为HCCS1是通过对肝细胞癌病人染色体17p13.3区域的杂合性缺失进行分析发现的新抑癌基因。研究显示，在肝细胞癌组织中HCCS1的表达水平明显低于癌旁正常组织。将HCCS1基因克隆后转染人肝癌细胞株发现，其在体外和体内均可以明显抑制肝癌细胞的生长。上述结果显示了HCCS1基因在肝癌的发生、发展过程中起着重要的作用，同时提示了其作为抗肿瘤治疗基因的应用价值。本实验以腺病毒为载体探讨HCCS1作为治疗基因在肿瘤生物治疗中的运用前景，并对其抑癌作用的分子机制做了初步的探索。我们利用AdEasy系统构建并包装携带有HCCS1基因的复制缺陷型腺病毒Ad-HCCS1，并通过半定量RT-PCR和Western blot确定证实Ad-HCCS1感染能介导细胞HCCS1的高表达。将重组病毒感染293细胞进行大量扩增，通过CsCl梯度离心纯化病毒，并运用293细胞空斑形成实验对纯化的Ad-HCCS1和对照腺病毒Ad的滴度进行测定，其滴度分别为4.5×1010和3×1010。细胞存活试验结果显示Ad-HCCS1对人肝癌细胞BEL7404和人结肠癌细胞SW620的生长具有显着的抑制作用（P＜0.01），而对人正常胚肺成纤维细胞NHLF的作用较弱。同时，在荷人结肠癌SW620的裸鼠模型中，瘤内注射Ad-HCCS1能明显抑制移植肿瘤的生长（P＜0.01），并发现重组腺病毒介导HCCS1的高表达能诱导细胞出现凋亡特征性的凋亡小体，TUNEL试验和Annexin V结合试验也表明细胞凋亡的发生。对其分子机制的研究发现，在HCCS1诱导的细胞凋亡过程中，Bcl-2家族成员Bax而非Bid被剪切，并插入线粒体膜，引起细胞线粒体膜电位的改变，从而导致细胞色素C（Cyto C）的释放。释放到胞浆的Cyto C进一步通过活化caspase-9和caspase-3促进细胞的凋亡，caspase-9特异性抑制剂或caspase广谱抑制剂都能明显缓解HCCS1诱导的细胞凋亡。而在凋亡过程中则未检测到caspase-8和caspase-12的活化。HCCS1高表达也能导致AIF从线粒体释放到胞浆，但其并不进一步转位入细胞核促进凋亡。此外，还发现HCCS1的高表达能引起溶酶体蛋白酶cathepsin D释放到胞浆，而抑制cathepsin D的活性能明显减弱HCCS1诱导的细胞凋亡。综上所述，本课题通过所构建的携带有HCCS1基因的重组腺病毒证实了HCCS1的抑癌作用，并对HCCS1作为治疗基因在抗肿瘤基因治疗中的应用前景做了初步的研究。同时，研究结果显示HCCS1可通过诱导细胞凋亡来发挥其抑癌作用。对凋亡机制的研究发现，线粒体／caspase-9／caspase-3途径在HCCS1诱导的细胞凋亡中起着重要的作用。此外，HCCS1高表达还能够触发溶酶体途径的细胞凋亡。PHB作为一种潜在的抑癌基因，其不仅定位于线粒体发挥分子伴侣的作用，同时也在细胞核内发挥转录调控的作用，在细胞增殖、分化及凋亡等重要过程中起着重要的作用。近来的研究显示发现，PHB不仅在多种肿瘤细胞及肿瘤组织中表达增高，其在肿瘤病人血清中也高表达，提示了PHB作为肿瘤标志物的运用价值。本研究通过考察PHB在本地区胃癌及结肠癌病人组织及血清中的表达情况，对其作为胃癌及结肠癌血清肿瘤标志物的可能进行探讨。我们构建PHB的原核表达载体pQE30-PHB，并用IPTG诱导蛋白表达，以Ni-NTA树脂亲和层析柱纯化蛋白。用纯化的PHB蛋白作为抗原免疫BALB／c小鼠，取免疫小鼠的脾细胞与SP 2／0骨髓瘤细胞融合后筛选分泌抗PHB蛋白的杂交瘤细胞，将其接种小鼠制备腹水并用Protein A亲和层析柱纯化抗体。通过筛选及进一步鉴定获得的1株效价较高的抗PHB单克隆抗体。用免疫组化检测肿瘤组织中PHB表达水平的改变。结果显示在胃癌及结肠癌组织中PHB的表达水平明显高于癌旁正常组织（p＜0.01），且肿瘤组织中PHB的水平和肿瘤的分化程度也存在相关性，即分化程度较低的肿瘤PHB表达水平较高（p＜0.01）。在此基础上，我们建立PHB的时间分辨免疫荧光分析方法（TRIFA），进一步检测肿瘤病人血清中PHB表达水平的改变。结果显示胃癌病人和结肠癌病人血清PHB水平和相应正常血清PHB水平没有明显差别（p＞0.05），而本研究中年龄、性别等混杂因素并未对统计结果造成偏移。而对正常人血清PHB的检测分析发现，不同性别间的血清PHB表达水平不一致。我们的结果提示了PHB作为一种肿瘤标志物和肿瘤发生、发展密切相关，肿瘤组织PHB表达检测结果为其可进一步将其运用于临床肿瘤疾病的辅助诊断、治疗、病程分析及预后判定奠定了基础。而PHB作为一种血清肿瘤标志物有待于进一步的研究。
彭其胜[10]（2005）在《IL-1023-57-PE40免疫毒素的制备及细胞毒活性研究》文中指出通过对白细胞介素10（IL-10）与其受体（IL-10R）结合位点的分析,参考国外学者的研究成果,设计了以IL-10 模拟功能短肽IL-1023-57为导向的免疫毒素IL-1023-57-PE40,为了证明设计的合理性,另设计了IL-1018-57-PE40 为其对照组。利用DNA 重组技术在大肠杆菌中构建、表达免疫毒素,初步研究了该免疫毒素的表达调控机制。然后采用合适的条件对成功表达的大肠杆菌发酵,利用蛋白质结构软件分析免疫毒素的结构及性质,设计纯化程序,纯度达到90%以上。对纯化的毒素进行细胞毒活性实验、免疫荧光检测、细胞ELISA 检测、荷瘤小鼠组织学检测,结果证明,我们构建的IL-1023-57-PE40 符合免疫毒素的作用机理。本博士论文在国内外首次提出以细胞因子的模拟短肽作为免疫毒素的导向,发展了免疫毒素的构建思路,同时为构建新型靶向药物用于单核巨噬瘤治疗提供了细胞学实验依据。
二、HCVC区基因在SP2/0细胞及荷瘤小鼠瘤内的表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、HCVC区基因在SP2/0细胞及荷瘤小鼠瘤内的表达（论文提纲范文）
（1）旋毛虫对小鼠H22肝癌细胞生长的抑制作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩写表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 寄生虫对肿瘤发生与发展的影响 |
| 1.1 寄生虫对癌症发生的正向调控 |
| 1.2 寄生虫对肿瘤发生发展的负向调控 |
| 1.3 小结 |
| 第二章 旋毛虫抗肿瘤研究进展 |
| 2.1 旋毛虫抗肿瘤作用研究进展 |
| 2.2 旋毛虫相关抗原的抗肿瘤作用研究进展 |
| 2.3 小结 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 旋毛虫感染对H22荷瘤小鼠实体瘤抑制作用研究 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 旋毛虫感染对H22荷瘤小鼠体内细胞因子的影响 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 旋毛虫对H22肝癌细胞的体内外凋亡作用研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介及在学期间成果 |
| 致谢 |
（2）鞣花酸抑制人脑胶质母细胞瘤细胞生长的实验研究及机制探讨（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 引言 |
| 第一部分 鞣花酸抑制人脑胶质母细胞瘤U87和U118细胞生长的现象观察 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 附图 |
| 第二部分 鞣花酸抑制人脑胶质母细胞瘤U87和U118细胞生长的机制初探 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 附图 |
| 第三部分 鞣花酸抑制人脑胶质母细胞瘤细胞生长的体内实验研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 综述(一) 人脑胶质母细胞瘤侵袭性及其机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述(二) 凝花酸的生物学功能及其抗癌作用研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间科研成果 |
| 致谢 |
（3）重组长效透明质酸酶的构建及其在皮下给药与肿瘤治疗中的应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1. 文献综述 |
| 1.1 透明质酸及透明质酸酶的生化特性 |
| 1.1.1 透明质酸结构、功能及分布 |
| 1.1.2 透明质酸酶的生理功能 |
| 1.1.3 透明质酸酶的分类 |
| 1.1.4 PH20的理化性质 |
| 1.2 以透明质酸酶为关键技术的皮下给药平台 |
| 1.2.1 胞外基质是药物传递的主要物理屏障 |
| 1.2.2 克服胞外基质屏障的策略 |
| 1.2.3 透明质酸酶产品的发展历史及应用范围 |
| 1.2.4 重组人源透明质酸酶联合给药生物利用度的考察及提升空间 |
| 1.3 透明质酸酶用于靶向微环境肿瘤治疗 |
| 1.3.1 实体瘤的生理生化特征 |
| 1.3.2 透明质酸对肿瘤发展的意义 |
| 1.3.3 靶向透明质酸的肿瘤治疗 |
| 1.4 重组蛋白药物长效改造策略 |
| 1.4.1 定点突变 |
| 1.4.2 化学修饰 |
| 1.4.3 融合蛋白 |
| 1.5 重组蛋白的表达及其关键技术 |
| 1.5.1 重组蛋白表达系统 |
| 1.5.2 基因表达策略 |
| 1.5.3 细胞培养工艺 |
| 1.5.4 四种常规层析手段 |
| 1.6 论文的立题思想 |
| 2. 重组透明质酸酶分子构建、转染与克隆筛选 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与仪器 |
| 2.2.1 实验材料与药品 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.3 分子设计思路与构建策略 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 信号肽序列与目的基因的扩增 |
| 2.4.2 融合基因的扩增 |
| 2.4.3 克隆载体的构建及测序 |
| 2.4.4 重组表达载体的构建 |
| 2.4.5 含融合基因片段的双顺反子表达载体的构建 |
| 2.4.6 去除双顺反子表达载体的抗性筛选标记 |
| 2.4.7 重组表达载体转化宿主细胞与克隆筛选 |
| 2.4.8 克隆以及细胞表达能力的比较 |
| 2.4.9 流式细胞术进行细胞分析与分选 |
| 2.4.10 蛋白质免疫斑点杂交法 |
| 2.4.11 透明质酸酶活性检测方法的建立 |
| 2.5 实验结果 |
| 2.5.1 分段扩增各段目的基因以及重叠PCR获得全长 |
| 2.5.2 克隆载体、表达载体以及双顺反子表达载体的构建 |
| 2.5.3 克隆表达水平与亚克隆 |
| 2.5.4 不同宿主细胞系对蛋白表达量的影响 |
| 2.5.5 载体结构对蛋白表达量的影响 |
| 2.5.6 顺反子表达载体对克隆筛选的作用及筛选标记neo对表达量的影响 |
| 2.5.7 高通量透明质酸活性检测方法的建立 |
| 2.6 本章小结 |
| 3. 细胞培养与蛋白纯化工艺摸索 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与仪器 |
| 3.2.1 实验材料与药品 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 重组细胞无血清悬浮驯化 |
| 3.3.2 批次实验考察40 mL摇瓶中悬浮培养基础表达量 |
| 3.3.3 40 mL摇瓶中流加培养 |
| 3.3.4 L摇瓶中流加培养 |
| 3.3.5 激流式生物反应器中流加培养 |
| 3.3.6 蛋白质免疫印迹分析(Western blot) |
| 3.3.7 细胞培养液残糖测定 |
| 3.3.8 镍柱亲和层析分离带有His标签的rhPH20 |
| 3.3.9 采用离子交换介质对rhPH20-HSA进行快速捕获 |
| 3.3.10 蓝胶对rhPH20-HSA进行中度纯化 |
| 3.3.11 Phenyl疏水层析柱纯化条件摸索 |
| 3.3.12 采用亲和介质分离重组蛋rhPH20-Fc |
| 3.3.13 冻干制剂配方筛选 |
| 3.3.14 重组蛋白制剂稳定性考察 |
| 3.3.15 聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE分析 |
| 3.3.16 高效液相色谱 |
| 3.4 实验结果与讨论 |
| 3.4.1 高表达克隆无血清悬浮批次筛选 |
| 3.4.2 40 mL摇瓶流加培养及初步工艺 |
| 3.4.3 3L摇瓶流加培养工艺放大 |
| 3.4.4 5L激流式反应器流加培养工艺优化 |
| 3.4.5 镍柱亲和层析分离带有His标签的rhPH20蛋白 |
| 3.4.6 采用Q SFF对rhPH20-HSA纯化条件及结果 |
| 3.4.7 复合填料蓝胶分离rhPH20-HSA条件优化 |
| 3.4.8 疏水介质分离rhPH20-HSA条件优化 |
| 3.4.9 采用MabSelect对rhPH20-Fc亲和层析纯化结果 |
| 3.4.10 三种重组蛋白比活性的比较 |
| 3.4.11 重组蛋白冻干制剂配方筛选与稳定性考察 |
| 3.5 本章小结 |
| 4. 透明质酸酶在皮下给药中的应用 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与仪器 |
| 4.2.1 实验材料与药品 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 重组透明质酸酶在台盼蓝皮下扩散过程中的影响 |
| 4.3.2 不同浓度透明质酸酶对台盼蓝皮下扩散的影响 |
| 4.3.3 皮下注射透明质酸酶后小鼠皮肤重建实验 |
| 4.3.4 单抗药物Stelara联合重组透明质酸酶皮下给药 |
| 4.3.5 体药物TNFR Ⅱ-Fc-IL1ra联合重组透明质酸酶联皮内给药 |
| 4.3.6 检测方法 |
| 4.4 实验结果与讨论 |
| 4.4.1 不同重组透明质酸酶对台盼蓝皮内扩散的影响 |
| 4.4.2 透明质酸酶的剂量依赖性 |
| 4.4.3 重组透明质酸酶皮下稳定性 |
| 4.4.4 透明质酸酶与大分子蛋白药物联合皮下给药 |
| 4.5 本章小结 |
| 5. 透明质酸酶对不同尺寸肿瘤治疗药物促进效果的比较性研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与仪器 |
| 5.2.1 实验材料与药品 |
| 5.2.2 实验仪器 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 细胞培养以及构建荷瘤小鼠 |
| 5.3.2 细胞杀伤效果检测 |
| 5.3.3 3D细胞球内药物扩散 |
| 5.3.4 3D细胞透明质酸免疫组化 |
| 5.3.5 3D细胞球生长曲线 |
| 5.3.6 TUNEL检测 |
| 5.3.7 透明质酸酶的体内稳定性研究 |
| 5.3.8 肿瘤IFP检测 |
| 5.3.9 肿瘤透明质酸免疫组化 |
| 5.3.10 体内肿瘤抑制效果考察 |
| 5.4 实验结果与讨论 |
| 5.4.1 二维、三维培养水平的细胞毒性比较以及透明质酸酶的影响 |
| 5.4.2 透明质酸酶对不同药物3D细胞球内扩散促进效果 |
| 5.4.3 3D细胞球生长抑制 |
| 5.4.4 透明质酸酶体内稳定性考察 |
| 5.4.5 肿瘤微环境的变化 |
| 5.4.6 瘤内药物分布与蓄积 |
| 5.4.7 肿瘤生长曲线及分析 |
| 5.5 本章小结 |
| 6. 结论与展望 |
| 6.1 主要结论 |
| 6.2 创新点总结 |
| 6.3 今后工作建议 |
| 7. 缩写词 |
| 8. 参考文献 |
| 个人简历及发表文章目录 |
| 致谢 |
（4）B7-H4在胰腺癌中的表达及其临床意义（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 插图和附表清单 |
| 缩略词表 |
| 目次 |
| 引言 |
| 第一部分 B7-H4单克隆抗体的制备及鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 第二部分 B7-H4在胰腺癌中的表达及其临床意义 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 第三部分 讨论 |
| 第四部分 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在学期间所取得的科研成果 |
（5）重组腺相关病毒介导的转EB病毒潜伏期膜蛋白治疗鼻咽癌的试验研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 重组腺相关病毒介导的转EB病毒潜伏期膜蛋白治疗鼻咽癌的实验研究 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 |
| 附录 |
| 撰写论文 |
| 致谢 |
（6）小分子重组免疫毒素GnRH-luffinS的制备及其靶向治疗肿瘤的实验研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 一、国内外研究现状 |
| 二、研究方法和思路 |
| 第一部分 luffin 原核表达质粒的构建、表达及活性检测 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 第二部分 重组毒素 GnRH-luffinS2 的构建、表达及活性 检测 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 第三部分 GnRH-PEⅡ-luffinS 的构建、表达及其活性检测 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 讨论 |
| 1. 重组毒素的构建 |
| 2. 重组毒素的表达 |
| 3. 重组毒素包涵体的复性 |
| 4. 重组毒素的蛋白酶切割 |
| 5. 重组毒素的生物学活性 |
| 6. 荷瘤动物模型的建立与体内抑肿瘤实验 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 文献综述：免疫毒素治疗肿瘤的研究进展 |
| 发表文章：小分子GnRH-luffinS 重组嵌合毒素的制备与其细胞毒性检测 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（7）B7-H1疫苗增强HER-2疫苗抗肿瘤免疫效应的研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 正文 |
| 第一部分 疫苗的制备 |
| 1 实验设计和目的 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 第二部分 疫苗联合应用的抑瘤实验 |
| 1 实验设计和目的 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 第三部分 疫苗的毒理学研究 |
| 1 实验设计和目的 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（8）旋毛虫抗Hepa1-6肿瘤效应的研究（论文提纲范文）
| 提要 |
| 英文缩写词表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 旋毛虫抗原的研究进展 |
| 第二章 肝癌基因治疗的研究进展 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 旋毛虫对C57BL/6 小鼠体内 Hepa1-6 肝癌细胞抑制作用观察 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 旋毛虫抗原抗Hepa1-6 肝癌细胞作用观察 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 旋毛虫与Hepa1-6 肝癌细胞间相关抗原的初步鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 旋毛虫与Hepa1-6 肝癌细胞相关抗原分子量的初步确定 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 致谢 |
| 导师及作者简介 |
（9）腺病毒介导的HCCS1基因抗肿瘤作用及其机制的研究Prohibitin（PHB）作为肿瘤血清标志物的初步研究（论文提纲范文）
| 第一部分 腺病毒介导的HCCS1基因抗肿瘤作用及其机制的研究 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 HCCS1重组腺病毒抗肿瘤作用的研究 |
| 前言 |
| 实验材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第二章 HCCS1高表达诱导细胞凋亡及分子机制的研究 |
| 前言 |
| 实验材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 Prohibitin(PHB)作为肿瘤血清标志物的初步研究 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 实验材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 新抑癌基因HCCS1的研究进展 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 在校期间发表文章及所获奖励 |
| 致谢 |
（10）IL-1023-57-PE40免疫毒素的制备及细胞毒活性研究（论文提纲范文）
| 前言 |
| 第一部分:文献综述 |
| 综述一 白细胞介素10 的研究进展 |
| 1 IL-10 的结构和表达 |
| 2 IL-10 受体 |
| 3 IL-10 同源分子 |
| 4 IL-10 对免疫细胞的作用 |
| 5 IL-10 在免疫系统中的作用 |
| 6 IL-10 与肿瘤的关系 |
| 7 IL-10 对肿瘤的作用模式 |
| 8 IL-10 与几种疾病的相关性 |
| 9 结论 |
| 综述二 绿脓杆菌外毒素 A 的研究进展 |
| 1 PEA 性质 |
| 2 作用机制 |
| 3 PEA 的基本结构与功能的关系 |
| 4 PE 构建的重组免疫毒素 |
| 5 临床上的应用 |
| 6 存在的问题 |
| 7 展望 |
| 第二部分 研究内容 |
| 实验一 IL-10_(23-57) 和 IL-10_(18-57) 的设计 |
| 1 IL-10 与IL-10R 结合位点的分析 |
| 2 我们拟设计的 IL-10 模拟短肽 |
| 3 IL-10_(23-57) 基因的生成 |
| 4 对照组 IO-10_(18-57) 的设计 |
| 5 小结 |
| 实验二 IL-10_(23-57) -PE40 融合蛋白的构建与表达 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 实验三 IL-10_(23-57)-PE40 表达条件与表达途径的探索 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 实验四 IL-10_(18-57)-PE40 的构建、表达及调控分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 实验五 IL10_(18-57)-PE40 及IL10_(23-57)-PE40 发酵与纯化 |
| 1 材料 |
| 2 发酵和纯化方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 实验六 IL-10_(23-57)-PE40 和 IL-10_(18-57)-PE40 体外细胞毒性实验 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 实验七 IL-10_(23-57)-PE40 细胞毒性机理检测 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 致谢 |
| CURRICULUM VITAE |
| 导 师 简 介 |
四、HCVC区基因在SP2/0细胞及荷瘤小鼠瘤内的表达（论文参考文献）
- [1]旋毛虫对小鼠H22肝癌细胞生长的抑制作用及其机制研究[D]. 李仕存. 吉林大学, 2020(01)
- [2]鞣花酸抑制人脑胶质母细胞瘤细胞生长的实验研究及机制探讨[D]. 王栋良. 武汉大学, 2017(06)
- [3]重组长效透明质酸酶的构建及其在皮下给药与肿瘤治疗中的应用研究[D]. 刘珊. 中国科学院研究生院(过程工程研究所), 2016(11)
- [4]B7-H4在胰腺癌中的表达及其临床意义[D]. 洪波. 浙江大学, 2015(09)
- [5]重组腺相关病毒介导的转EB病毒潜伏期膜蛋白治疗鼻咽癌的试验研究[D]. 潘建青. 华中科技大学, 2009(11)
- [6]小分子重组免疫毒素GnRH-luffinS的制备及其靶向治疗肿瘤的实验研究[D]. 刘艳华. 中国人民解放军军事医学科学院, 2008(11)
- [7]B7-H1疫苗增强HER-2疫苗抗肿瘤免疫效应的研究[D]. 张存. 第四军医大学, 2008(01)
- [8]旋毛虫抗Hepa1-6肿瘤效应的研究[D]. 张媛媛. 吉林大学, 2007(05)
- [9]腺病毒介导的HCCS1基因抗肿瘤作用及其机制的研究Prohibitin（PHB）作为肿瘤血清标志物的初步研究[D]. 甘愉. 复旦大学, 2007(06)
- [10]IL-1023-57-PE40免疫毒素的制备及细胞毒活性研究[D]. 彭其胜. 吉林大学, 2005(06)