一、中国启东地区肝癌细胞凋亡相关基因的克隆、表达及其与肝癌相关性研究(英文)（论文文献综述）
朱青[1]（2021）在《第一部分：AHR介导黄曲霉毒素B1在肝细胞癌中的毒性研究 第二部分：靶向测序对多种EBV感染相关恶性肿瘤中EBV整合位点分析研究》文中进行了进一步梳理研究背景:肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是主要起源于肝脏上皮细胞的恶性肿瘤,居世界肿瘤发病率和死亡率的第五和第二位,是我国第四位常见的恶性肿瘤。目前,已经确定的肝癌危险因素包括乙型（Hepatitis B virus,HBV）和丙型（Hepatitis C virus,HCV）肝炎病毒的慢性感染,以及饮食中黄曲霉毒素（Aflatoxin）暴露是肝癌的主要病因之一。黄曲霉毒素相关肝癌是我国肝癌患者区别于国外发病患者的一个显着类型,黄曲霉毒素被人体摄取后,进入肝细胞引起细胞发生恶性转化继而诱发肝癌的进程和结局各有不同,因此探寻肝细胞内与黄曲霉毒素代谢和毒性相关的关键分子,寻找黄曲霉毒素的潜在受体,阐述影响黄曲霉毒素代谢的调控机制并发现筛查黄曲霉肝癌易感靶点迫在眉睫。研究目的:（1）明确肝癌细胞内黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1）的结合分子,揭示AFB1进入肝癌细胞后的关键步骤;（2）明确AFB1对下游代谢通路的调控作用,进一步阐明AFB1诱导肝癌发生的分子机制;（3）预测AFB1与关键抗性分子的作用机制;（4）明确黄曲霉相关肝癌（AF-HCC）免疫治疗靶点的可行性。研究方法:本研究基于全基因组CRISPR-Cas9高通量筛选技术,将AFB1作用于肝癌细胞系PLC/PRF/5,经过6轮AFB1的诱导后,收集存活的肝癌细胞,通过二代测序鉴定出能够抵抗AFB1持续诱导的关键基因。利用非靶向代谢组学检测AFB1对AHR敲降前后肝癌细胞代谢物质的丰度变化。通过大肠杆菌体系纯化出AHR蛋白分子的N端和C端蛋白,利用核磁饱和转移差谱技术（STD）确定AFB1与AHR蛋白的结合能力。通过分子对接预测AFB1与AHR的结合位点,检测关键结合位点的AHR突变体蛋白与AFB1的结合力。收集江苏启东地区黄曲霉相关肝癌患者标本,检测AHR表达水平与PD-L1表达的关系。体内实验验证PD-L1抑制剂对AHR高表达肝癌的治疗效果。研究结果:全基因组CRISPR-Cas9高通量筛选发现AHR敲降的肝癌细胞系可以耐受高浓度的AFB1。AFB1可以增加肝癌坏死过程中长链脂肪酸的积累,且AHR是调控长链脂肪酸代谢的关键因子。AFB1可以激活AHR的表达,并且促进AHR蛋白入核过程,与ARNT形成二聚体,调控下游P450代谢通路相关基因的表达。AHR蛋白的N端可以与AFB1直接结合,第208位的异亮氨酸是调控两者结合能力的关系位点。AHR的缺失可以显着降低肝癌细胞内黄曲霉加合物的形成,减少AFB1对肝细胞的损伤,且AHR的高表达会促进肝癌细胞PD-L1表达,使黄曲霉相关肝癌对免疫治疗更加敏感。结论:本课题通过全基因组CRISPR-Cas9高通量筛选和多种分子生物学实验阐明了 AHR是AFB1潜在的胞内代谢性穿梭受体,其在AFB1代谢和毒素诱导的肝癌中起重要作用,可以作为黄曲霉相关肝癌的候选治疗靶标。AHR的激活可以诱导PD-L1的表达,使黄曲霉相关肝癌对免疫治疗更加敏感。研究背景:爱泼斯坦-巴尔病毒（EBV）与多种恶性肿瘤有关,EBV的持续感染会导致多种恶性肿瘤,包括伯基特淋巴瘤,霍奇金淋巴瘤,鼻咽癌,胃癌等。EBV病毒致癌蛋白的表达和慢性炎症的发生是导致肿瘤发生发展的主要机制,但是目前针对EBV整合到人类基因组中破坏基因表达或基因组稳定性的系统系研究仍然较少。研究目的:我们的工作为多种恶性肿瘤的EBV整合图谱提供了大规模的全基因组分析。我们比较了不同肿瘤中EBV整合位点之间的差异,并且探讨了 EBV整合对基因表达的影响,试图阐明EBV整合与肿瘤发生和发展之间的联系。研究方法:我们收集了多个肿瘤的冷冻组织标本,包括NPC（n=177;中山大学肿瘤防治中心和广西医科大学附属第一医院）;胃癌（n=39;中山大学肿瘤防治中心和青岛大学附属医院）;NK/T细胞淋巴瘤（n=25;中山大学癌症中心和瑞金医院）;霍奇金淋巴瘤（n=11;中山大学癌症中心）;鼻咽炎（n=1;中山大学癌症中心）。从这些肿瘤组织中分离基因组DNA,使用靶向EBV的单链DNA探针对基因组DNA进行杂交捕获,并使用生物信息学方法分析全基因组范围内EBV整合位点特征和整合数量差异。同时,我们检测了 EBV常见整合位点附近的基因表达变化,并通过免疫组织化学验证了热点基因与EBV之间的关系。研究结果:我们从33个肿瘤和C666-1细胞系中共鉴定出197个EBV整合位点,其中EBV在胃癌的整合率（25.6%）高于鼻咽癌的整合率（9.6%）。我们发现多个EBV整合位点位于调节TNF-α,NF-κB信号通路的肿瘤抑制基因和炎症相关基因的附近。此外,在EBV基因组中,这些断点经常位于oriP或末端重复序列。这些断点常被微同源序列包围,这与涉及病毒基因组复制和微同源介导的重组的整合机制一致。结论:EBV整合优先发生在宿主基因组染色体不稳定的区域内,整合位点常位于EBV基因组的oriP或末端重复序列周围。多个EBV整合位点位于肿瘤抑制基因的附近,这些基因在癌症进展过程中经常被破坏。EBV整合参与了 EBV复制和微同源性介导的基因重组。
马路园[2]（2021）在《LINC13及ACTR分别调控氧化应激及糖酵解介导肝癌耐药的机制研究》文中研究指明肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）以下简称“肝癌”,占原发性肝癌85%-90%,到2025年估计全球年发病人数将超过100万例,是目前我国第4位常见恶性肿瘤及第2位肿瘤致死病因,严重威胁我国人民的生命和健康。超过60%肝癌患者诊断时已处于疾病中晚期,系统药物治疗是可以选择的最重要的治疗方法。然而药物抵抗是目前中晚期肝癌治疗面临的最突出、最棘手的问题,也是治疗失败最根本的原因。像许多其他癌症一样,肝癌亦具有高度异质性,即便患者具有相似疾病表型,也可能具有不同的分子分型,使得治疗反应不尽相同。在分子水平上对患者进行分层有助于制定个体化治疗方案,提高药物疗效,降低耐药率,改善患者预后。因此,迫切需要阐明肝癌耐药的分子机制,筛选可预测肝癌耐药的分子标记物,并寻找控制耐药的新靶点。奥沙利铂（oxaliplatin,OXA）和索拉非尼分别是目前肝癌系统化疗和靶向治疗最常用的一线药物。OXA属于第三代铂类药物,作为一种双功能烷基化剂,OXA可以共价结合DNA形成铂-DNA复合物,阻断DNA复制和转录,杀伤肿瘤细胞。已有研究报道,铂类药物的化学抗性是导致临床化疗效果欠佳的重要原因,而同一基因的不同改变可能会带来抗药性或增强的药物敏感性。基因水平可反映药物疗效,部分可作为预测药物治疗反应的生物标志物,根据目标基因设计针对肿瘤患者的个性化药物可为临床提供最有效的化疗药物。随着非编码RNA研究的深入,发现部分长链非编码RNA（Long non coding RNA,lnc RNA）在调控基因转录、翻译及功能方面具有重要作用,亦可作为重要分子辅助HCC的诊疗。因此,筛选OXA耐药相关lnc RNA,评估其在肝癌患者OXA化疗耐药中的作用机制具有重要临床意义。索拉非尼是第一个用于晚期肝癌系统治疗的酪氨酸激酶抑制剂（Tyrosine kinase inhibitors,TKI）类药物,也是目前系统治疗的一线靶向药物。目前,索拉非尼耐药已成为限制其临床应用的重要原因,也是晚期HCC治疗中的一个主要挑战。然而,索拉非尼耐药机制尚未明确,亟需探索索拉非尼耐药相关新分子及耐药机制,为临床控制索拉非尼耐药提供新方向。第一部分肝癌OXA耐药相关新分子LINC13及其临床意义目的:通过OXA耐药引起的HepG2细胞差异表达分子确定OXA耐药相关新分子,并探索其临床意义。方法:1.结合目前临床肝癌患者化疗过程中OXA高耐药率的现状,我们首先运用大剂量药物冲击法建立了OXA耐药（OXA resistance,OXA-R）HepG2细胞系,结合克隆形成实验、流式细胞术分析HepG2细胞发生OXA耐药后细胞增殖及凋亡率的变化。提取OXA敏感（OXA sensitive,OXA-S）及OXA-R细胞总RNA,进行转录组测序（RNA sequencing,RNA-Seq）,重点分析OXA耐药引起差异的lnc RNAs。结合逆转录聚合酶链反应（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction,RT-PCR）初步确定与OXA耐药相关性最高的lnc RNA。2.筛选癌症基因组图谱（The cancer genome atlas,TCGA）数据中病理诊断为HCC的患者342例。运用数据库中HCC患者LINC13数据绘制ROC曲线,确定LINC13的cutoff值。将HCC肝癌患者分为LINC13高、低水平2组,统计2组患者临床病理特征（年龄、性别、Child-pugh分期、肿瘤大小、病理分期、临床分期、血管浸润及临床预后）,分析LINC13水平与肝癌患者临床病理特征及预后的关系。3.运用基因表达谱交互分析网站（Gene Expression Profiling Interactive Analysis,GEPIA）分析364例肝癌患者LINC13水平与总生存期（Overall survival,OS）及无病生存期（Diesase free survival,DFS）的关系,并绘制Kaplan-Meier生存曲线。4.回顾性从中国人民解放军总医院、广州医科大学附属肿瘤医院收集肝癌患者的肿瘤组织样本共153例,包括接受OXA静脉化疗的82例和不含OXA静脉化疗的71例,均具有完善的预后信息。提取153例肝癌组织总RNA,通过RT-PCR检测LINC13水平;分析LINC13水平与患者预后（即无进展生存期Progression-free survival,PFS）的关系,绘制Kaplan-Meier生存曲线。肝癌的诊断需符合2019年《原发性肝癌诊治规范》中肝细胞癌的诊断标准,课题经过中国人民解放军总医院、广州医科大学附属肿瘤医院的伦理委员会批准。本课题的相关实验符合赫尔辛基宣言的要求,并得到河北医科大学第三医院伦理委员会的批准。5.根据OXA治疗效果,将接受OXA化疗的82例患者分为OXA-S组及OXA-R组,每组挑选10例肝癌组织蜡块进行荧光探针原位杂交（Fluorescent In Situ Hybridization,FISH）,检测OXA-S及OXA-R肝癌组织LINC13水平,分析LINC13与OXA耐药的关系。结果:1.筛选肝癌细胞OXA耐药相关新分子我们成功建立了OXA-R的HepG2细胞系（耐药指数为3.36）。在OXA刺激下,与OXA-S细胞相比,OXA-R细胞增殖能力较强（P<0.01）、凋亡率较低（P<0.01）。RNA-Seq结合RT-PCR证实,LINC13是OXA-R细胞上调最为明显的lnc RNA（P<0.01）。2.LINC13与肝癌预后的关系分析TCGA数据库中364例HCC患者数据发现,LINC13水平与肝癌大小、临床分期、血管浸润及预后有关（P<0.05）,并且是肝癌预后的独立危险因素（P=0.003）。运用GEPIA网站分析LINC13与肝癌预后关系发现,与低水平LINC13肝癌患者相比,高水平LINC13肝癌患者临床预后较差,表现在患者OS（P=1.3e-05）和DFS较短（P=0.003）。3.LINC13与不同化疗方案患者预后的关系回顾性收集82例接受OXA治疗的肝癌患者,统计发现高水平LINC13患者43例,低水平LINC13患者39例;71例接受不含OXA化疗方案的患者中,高水平LINC13患者48例,低水平LINC13患者23例。分析各组患者LINC13与PFS关系发现,在接受OXA静脉化疗的HCC患者中,与低水平LINC13的患者相比,高水平LINC13患者PFS较短（P=0.001）;在接受不含OXA静脉化疗的HCC患者中,LINC13水平与PFS无关（P=0.306）。4.OXA敏感及耐药肝癌组织LINC13水平荧光探针原位杂交检测10例OXA-S及10例OXA-R肝癌组织荧光探针法LINC13水平,发现与OXA-S患者相比,OXA-R患者肝癌组织LINC13水平较高（P<0.01）。结论:1.LINC13是肝癌OXA耐药相关的新分子。2.LINC13与肝癌进展有关,是肝癌患者预后的独立危险因素。第二部分LINC13调控SM1介导肝癌OXA耐药的可能机制目的:结合转录组测序数据分析OXA耐药相关基因富集所在的信号通路,进一步阐明LINC13调控的靶基因引起OXA耐药的可能机制。方法:1.根据RNA-Seq数据中差异m RNA分析OXA耐药相关的基因所在的信号通路,富集分析（Gene Set Enrichment Analysis,GSEA）探索LINC13水平与OXA耐药相关基因富集的关系;流式细胞术初步探索OXA-S和OXA-R细胞ROS水平。2.统计TCGA数据库中364例肝癌患者LINC13水平,及可能的耐药通路中已经报道与耐药发生有关的基因（SM1、KEAP1、NQO1、BLVRB及GPX2）的水平,分析LINC13与各抗氧化应激基因的相关性,确定与LINC13相关性最高的基因可能为LINC13的靶基因。3.初步确定抗氧化应激基因中与LINC13相关性最高的基因,结合GEPIA网站分析SM1与肝癌患者OS及DFS关系;同时应用RT-PCR检测153例肝癌组织SM1水平,分析SM1水平对接受OXA化疗的82例HCC患者及71例接受不含OXA化疗方案的患者PFS的影响;4.提取OXA-S和OXA-R的HepG2细胞总RNA及总蛋白,检测SM1转录及蛋白水平;免疫组织化学染色法检测10例OXA-S及10例OXA-R肝癌组织SM1的表达水平。5.提取LO2、HepG2、HCC-LM3、Hu H-7、Hep3B、MHCC97H细胞总RNA及总蛋白,分别检测LINC13转录水平及SM1蛋白水平并进行相关性分析;分析SM1与肝癌OXA耐药的关系。6.分子克隆技术构建LINC13及SM1重组质粒,通过细胞转染、RT-PCR、western blot分析LINC13对SM1靶向调控作用。CCK-8法检测HepG2、MHCC97H细胞在不同浓度OXA作用下的存活率,确定IC50。结果:1.OXA耐药相关通路及LINC13与可能耐药通路之间的关系根据RNA-Seq数据分析OXA耐药相关信号通路,发现抗氧化应激通路是OXA耐药相关基因主要富集的通路之一,且GSEA分析发现LINC13与抗氧化应激相关基因富集量正相关（P=0.006）。流式细胞术证实OXA耐药细胞较敏感细胞ROS水平低（P<0.01）。2.分析LINC13与抗氧化应激通路部分基因的相关性分析364例TCGA数据库中肝癌患者的基因表达量的相关性,证实LINC13与抗氧化应激相关通路中SM1、KEAP1、NQO1及GPX2正相关,其中LINC13与SM1相关性最高（P<0.0001,R=0.295）。3.SM1与肝癌患者预后及OXA治疗效果的关系结合GEPIA网站分析364例肝癌患者SM1水平与预后的关系,发现高水平SM1患者OS及DFS较短但无统计学意义;分析临床接受OXA静脉化疗的患者SM1水平与预后关系,发现与低水平SM1患者相比,高水平SM1患者PFS较短（p=0.007）;接受不含OXA静脉化疗的肝癌患者SM1水平对PFS无影响。4.SM1在OXA-S及OXA-R肝癌组织的表达水平与OXA-S的HepG2细胞相比,OXA-R细胞SM1转录及翻译水平较高（P<0.01）;与OXA-S肝癌组织相比,OXA-R肝癌组织SM1表达水平较高（P<0.01）。5.LINC13与SM1的关系及调控机制与肝脏LO2细胞相比,HCC细胞中LINC13转录水平及SM1蛋白水平较高,相关性分析发现LINC13转录水平与SM1蛋白水平呈显着正相关（R=0.972,P=0.0012）。与对照组相比,在HepG2细胞过表达LINC13后SM1水平明显升高,在MHCC97H细胞沉默LINC13后SM1水平明显降低（P<0.01）。CCK-8法测定HepG2细胞应用OXA的IC50为9.14μM,MHCC97H细胞应用OXA的IC50为14.87μM。结论:1.LINC13与抗氧化应激反应正相关,可能通过促进抗氧化应激反应导致OXA耐药。2.LINC13靶向调控SM1,可能通过抗氧化应激途径介导OXA耐药。第三部分肝癌细胞中LINC13调控SM1的分子机制目的:分析LINC13调控SM1及OXA在LINC13-SM1途径中的作用。方法:1.通过FISH技术观察LINC13在HepG2及MHCC97H的细胞定位,初步确定LINC13调控SM1发生在转录后翻译水平还是在转录水平。2.从NCBI网站查找SM1的启动子区域,通过PROMO、Gene Cards及UCSC网站联合预测SM1的转录因子,应用韦恩图取网站预测转录因子的交集。结合双荧光素酶报告基因实验检测转录因子（NRF2、STAT3、ATF3、KLF5、SF1）与LINC13共转染后对SM1启动子的激活作用,最终确定SF1为SM1的转录因子。3.根据JASPAR网站预测SF1与SM1结合的序列,继而构建SM1启动子及其突变体重组质粒。通过细胞转染技术、双荧光素酶报告基因实验确定LINC13及SF1对SM1的转录的影响及结合位置。4.双荧光素酶报告基因实验分析LINC13、OXA对SM1启动子的作用;通过Ch IP实验分析LINC13、OXA对SF1转录结合SM1的作用,阐明LINC13、OXA对SM1转录调控机制。5.将HepG2、MHCC97H两个细胞系分为对照组、转染LINC13组、加SF1抑制剂光辉霉素（Mithramycin A,MMA）组、转染LINC13后加MMA组,通过RT-PCR鉴定LINC13转染效率,通过Western blot分析SM1蛋白水平,分析LINC13调控SM1翻译的机制。6.选10例高LINC13水平及10例低LINC13水平的肝癌组织,并取对应的20例癌旁组织进行免疫组织化学染色和荧光探针原位杂交,检测LINC13、SM1、SP1在肝癌组织中的水平,分析LINC13水平与SM1及SF1在组织表达的相关性。结果:1.LINC13在肝癌细胞中的定位观察LINC13在HepG2及MHCC97H两个细胞系的定位,证实LINC13在细胞核及细胞质均有表达,但主要定位于细胞核。2.筛选SM1转录因子及结合启动子的可能位置PROMO、Gene Cards及UCSC网站联合预测发现SF1为SM1的转录因子。结合双荧光素酶报告基因实验证实,NRF2、STAT3、ATF3、KLF5、SF1转录因子中,在LINC13存在条件下SF1可明显提高SM1启动子活性;LINC13可显着提高SM1的启动子活性,转录因子SF1与SM1的结合位点在SM1启动子区域的第二段。3.LINC13、OXA可调控SM1启动子活性双荧光素酶报告基因实验证实LINC13、OXA可提高SM1的启动子活性;Ch IP实验进一步证实LINC13、OXA通过增强SF1募集到SM1启动子区域发挥转录调控SM1的作用。4.LINC13通过SF1调控SM1蛋白表达LINC13可促进SM1表达,MMA可抑制SM1表达,LINC13不可逆转MMA对SM1的抑制作用,证实LINC13通过SF1调控SM1表达。5.临床样本分析LINC13与SF1、SM1相关性肝癌蜡块组织中LINC13水平、SF1、SM1表达鉴定及相关性分析发现,高水平LICN13较低水平LINC13肝癌组织SF1、SM1表达较高,且肝癌组织LINC13、SF1、SM1的水平均显着高于癌旁组织。结论:1.LINC13在转录水平发挥调控SM1的作用。2.LINC13、OXA可通过增强SF募集到SM1启动子区域发挥转录调控作用。3.LINC13与SF1、SM1表达正相关,并且LINC13通过SF1调控SM1表达。第四部分LINC13-SF1-SM1轴促进抗氧化应激反应导致肝癌OXA耐药目的:探索LINC13-SF1-SM1轴调控HCC细胞活性氧及谷胱甘肽水平,分析氧化还原稳态在OXA耐药中的作用。方法:将HepG2细胞分为对照组,过表达LINC13组,过表达SF1组,SM1敲除（knockout,KO）细胞过表达LINC13组,SM1 KO细胞过表达SF1组;将MHCC97H细胞分为对照组,沉默LINC13组,沉默LINC13再回转SM1组。将HepG2细胞分为对照组,过表达LINC13组,加MMA组,过表达LINC13后加MMA组。运用过表达及敲低转染技术进行如上实验。各组细胞加入不同浓度OXA后通过CCK-8法检测细胞存活率;克隆形成实验检测细胞增殖情况;通过流式细胞术分析细胞活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）水平;谷胱甘肽/谷胱甘肽二硫化物（glutathione/glutathione disulfide,GSH/GSSG）试剂盒检测细胞GSH/GSSG比率。结果:1.LINC13-SF1-SM1对OXA作用下肝癌细胞存活率的影响与对照组相比,沉默LINC13、MMA、敲除SM1均可增强OXA杀伤HCC细胞的作用（P<0.01）;过表达LINC13、SF1可减弱OXA对HepG2细胞的杀伤作用。回转SM1可逆转沉默LINC13后OXA对MHCC97H细胞的强杀伤作用;过表达SF1或LINC13不能逆转SM1 KO HepG2后OXA对细胞的杀伤作用;过表达LINC13后不能减弱MMA联合OXA对HepG2细胞杀伤作用。2.LINC13-SF1-SM1对OXA作用下肝癌细胞ROS水平的影响OXA可刺激HCC细胞ROS水平升高;与OXA组相比,过表达LINC13、SF1后可减弱OXA对细胞的刺激作用,ROS水平降低;沉默LINC13、加MMA或SM1 KO可增强OXA对细胞的刺激作用,ROS水平升高;SM1可逆转LINC13沉默的作用;而LINC13、SF1无法逆转SM1KO的作用;且LINC13无法逆转MMA的作用。（P<0.05）3.LINC13-SF1-SM1对OXA作用下肝癌细胞谷胱甘肽水平的影响OXA可降低HCC细胞GSH/GSSG比例;过表达LINC13、SF1后可减弱OXA对细胞的刺激作用,GSH/GSSG较OXA组升高;沉默LINC13、MMA或SM1 KO可增强OXA对细胞的刺激作用,GSH/GSSG较OXA组明显降低;SM1可逆转LINC13沉默的作用;而LINC13、SF1无法逆转SM1 KO的作用;且LINC13无法逆转MMA的作用。（P<0.05）结论:1.LINC13调节SF1-SM1途径,抑制OXA对HCC细胞杀伤作用。2.LINC13-SF1-SM1轴促进HCC细胞抗氧化应激反应导致OXA耐药。第五部分ACTR调控糖酵解作用介导肝癌索拉非尼耐药目的:筛选索拉非尼耐药相关新分子及其调控索拉非尼耐药的机制。方法:1.通过基因表达数据库（Gene Expression Omnibus,GEO）筛选包含索拉非尼治疗敏感及耐药的肝癌RNA-Seq数据集;初步筛选索拉非尼耐药相关基因。在裸鼠接种索拉非尼敏感和耐药细胞,待形成异种移植瘤后提取肿瘤组织总RNA鉴定索拉非尼耐药相关基因水平,初步确定索拉非尼耐药相关新分子。2.结合TCGA数据库中364例HCC临床数据,分析ACTR水平与肝癌患者OS的关系,并在GEPIA网站分析ACTR与糖酵解基因（GLUT1、PKM2及LDHA）的相关性。3.将HepG2细胞分为对照组、加糖酵解抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖（2-Deoxy-D-glucose,2-DG）组、敲除ACTR（ACTR KO）组、ACTR KO加2-DG组、ACTR KO细胞回转ACTR组、ACTR KO细胞加2-DG后再回转ACTR组;将Hu H-7细胞分为对照组、加2-DG组、沉默ACTR组、沉默ACTR后加2-DG组、沉默ACTR再回转ACTR组、沉默ACTR加2-DG再回转ACTR组;通过CCK-8法及克隆形成实验检测各组细胞存活及增殖情况;Seahorse XFe96仪检测细胞外酸化率（extracellular acidification rate,ECAR）和氧消耗率（oxygen consumption rate,OCR）水平。4.回顾性研究纳入初始未经任何治疗、具有肝癌组织样本的患者126例。患者来自中国人民解放军总医院,肝细胞癌的诊断需符合2019年《原发性肝癌诊治规范》的诊断标准,课题已经过中国人民解放军总医院及河北医科大学第三医院伦理委员会批准。对126例患者肝癌组织进行免疫组织化学染色,分析ACTR、LDHA及PKM2表达情况,并进行相关性分析。结合oncomine数据库进一步分析ACTR与部分糖酵解基因的相关性。结果:1.筛选索拉非尼耐药相关新分子从GEO数据库筛选出索拉非尼敏感和耐药异种移植瘤差异基因,发现ACTR在索拉非尼耐药异种移植瘤中明显上调,通过裸鼠成瘤实验分析敏感和耐药移植瘤中索拉非尼耐药基因差异表达情况,初步确定ACTR是索拉非尼耐药上调最明显的基因（P<0.01）。2.ACTR与肝癌患者预后及糖酵解基因的关系分析GEPIA网站中TCGA肝癌患者数据,364例患者中高水平ACTR患者182例,低水平ACTR患者182例。与低水平ACTR患者相比,高水平ACTR患者OS较短（P=0.024）。通过GEPIA网站数据进行相关性分析发现,ACTR与糖酵解基因GLUT1（R=0.32）、PKM2（R=0.38）、LDHA（R=0.40）呈显着正相关（P<0.0001）。3.ACTR-糖酵解途径对索拉非尼作用下细胞存活率及增殖的影响与对照组相比,沉默或敲除ACTR后Hu H-7及MHCC97H细胞生长减慢、增殖减弱,对索拉非尼的敏感性增强。2-DG可增强索拉非尼抗肿瘤作用。回转ACTR可逆转沉默或敲除ACTR增敏索拉非尼的作用,但不能逆转2-DG增敏索拉非尼的作用。4.ACTR-糖酵解途径对索拉非尼作用下细胞外酸化率（extracellular acidification rate,ECAR）及耗氧率（oxygen consumption rate,OCR）的影响与对照组相比,沉默ACTR、索拉非尼可抑制肝癌细胞ECAR水平,抑制糖酵解作用;沉默ACTR可增强索拉非尼抑制ECAR水平,增强抑制索拉非尼抑制糖酵解的作用;回转ACTR后可逆转这一作用,恢复糖酵解能力。与对照组相比,沉默ACTR、加索拉非尼可增强细胞有氧呼吸能力,表现在氧化磷酸化功能增强、耗氧率升高;回转ACTR后可逆转沉默ACTR的作用,减弱细胞有氧呼吸,降低氧化磷酸化水平及耗氧量。（P<0.01）5.临床样本分析ACTR与糖酵解基因的相关性对126例临床样本进行免疫组织化学染色证实,肝癌患者ACTR与LDHA、PKM2表达正相关或（P<0.01）;结合Oncomine网站分析基因相关性,证实ACTR与糖酵解相关基因GLUT1/PKM2/LHDA/PFKL/ENO1等均存在正相关（P<0.05）。结论:1.ACTR是索拉非尼耐药中显着上调的新分子,与糖酵解作用有关。2.ACTR通过调节糖酵解作用导致索拉非尼耐药。结论:1.LINC13是肝癌OXA耐药相关的新分子。2.LINC13调控SF1-SM1途径增强抗氧化应激反应导致OXA耐药。3.ACTR是肝癌索拉非尼耐药相关的新分子。4.ACTR通过调节糖酵解作用导致索拉非尼耐药。
李彬[3]（2021）在《circ＿0027089通过miR-136-5p/NACC1轴调控乙型肝炎病毒相关肝癌的进程》文中研究指明目的:肝癌在世界范围内约占90%,而世界范围内的肝癌大多数发生在亚太地区。乙型肝炎病毒（HBV）感染是引发肝癌发展的主要危险因素,约50%的肝癌可归因于HBV感染。Meta-analyses显示,乙肝病毒感染者发生肝癌的可能性是非感染者的15-20倍。环状RNA（circRNA）被定义为非编码RNA,其特征是其特殊的共价闭环结构。circRNA的表达模式复杂,表现为组织分期特异性表达,与非肿瘤组织相比,大量circRNA在肿瘤组织中显着上调或下调。前期的研究中发现circ＿0027089在乙肝相关的肝癌组织中高表达,但其在乙肝相关的肝癌中的作用还未见报道。研究发现circRNA可以通过充当分子海绵或竞争性内源性RNA（ce RNAs）,竞争性地抑制miRNA的表达和生物学功能。在线预测网站（circBank）发现circ＿0027089与miR-136-5p具有结合位点,研究报道miR-136-5p在肝癌组织中下调,但其在乙肝相关的肝癌组织中的作用还有待探讨,我们猜测circ＿0027089是通过miR-136-5p发挥功能的,通过进一步的分析,在线预测网站（star Base）预测到miR-136-5p与NACC1具有结合位点,且NACC1高表达加速了肝癌的进程,因此推测circ＿0027089是否通过调控miR-136-5p/NACC1轴调控乙肝相关肝癌的发展过程,旨在为乙肝相关肝癌的治疗提供新方向。研究方法:采用qPCR法检测肝癌细胞系HepG2、HepG2.2.15、HepAD38、HepAD38（tet-off）中HBV DNA水平;采用qRT-PCR法与Western blot法分别检测Control组、肝癌组织（HBV-）、肝癌组织（HBV+）中circ＿0027089、miR-136-5p、NACC1的表达量;采用qRT-PCR法与Western blot法分别检测乙肝相关肝癌细胞HepG2.2.15和HepAD38（tet-off）中circ＿0027089、miR-136-5p、NACC1的表达量;采用Pearson法检测肝癌组织（HBV+）中circ＿0027089与miR-136-5p表达量的相关性,miR-136-5p与NACC1表达量的相关性以及circ＿0027089与NACC1表达量的相关性。以HepG2.2.15和HepAD38（tet-off）细胞为研究对象,实验分组:Vector组、pCD5-circ＿0027089组、si-NC组、si-circ＿0027089#1组、si-circ＿0027089#2组、si-circ＿0027089#2+anti-miR-NC组、si-circ＿0027089#2+anti-miR-136-5p组、miR-NC组、miR-136-5p组、miR-136-5p+pc DNA组、miR-136-5p+NACC1组。采用CCK8实验检测细胞活力;采用平板克隆形成实验检测细胞克隆形成率;采用流式细胞术分别检测细胞凋亡率与细胞周期;采用试剂盒检测Caspase3/7活力;采用划痕实验检测细胞划痕愈合率;采用Transwell小室实验检测细胞侵袭能力;采用双荧光素酶报告基因实验与RIP实验检测circ＿0027089与miR-136-5p的靶向关系,以及miR-136-5p与NACC1的靶向关系。sh-NC、sh-circ＿0027089分别转染入HepG2.2.15细胞后经皮下注射入裸鼠体内建立乙肝相关肝癌裸鼠模型,培养27 d后采用脱颈法处死裸鼠,取出移植瘤组织,分别检测移植瘤组织重量与体积;采用qRT-PCR法与Western blot法分别检测移植瘤组织中circ＿0027089、miR-136-5p、NACC1的表达水平。结果:1、HepG2.2.15细胞HBV DNA水平均明显高于HepG2细胞（P<0.05）,HepAD38（tet-off）细胞中HBV DNA水平均明显高于HepAD38细胞（P<0.05）。2、与Control组比较,肝癌组织（HBV-）、肝癌组织（HBV+）中circ＿0027089与NACC1的表达水平升高（P<0.05）,miR-136-5p的表达水平降低（P<0.05）,且肝癌组织（HBV-）与肝癌组织（HBV+）比较差异有统计学意义;与人肝永生化细胞THLE-2比较,HepG2.2.15和HepAD38（tet-off）细胞中circ＿0027089与NACC1的表达水平升高（P<0.05）,miR-136-5p的表达水平降低（P<0.05）。3、与Vector组比较,pCD5-circ＿0027089组细胞活力升高（P<0.05）,克隆形成率与划痕愈合率升高（P<0.05）,S期细胞比例升高（P<0.05）,侵袭细胞数增多（P<0.05）,凋亡率与Caspase3/7活力降低（P<0.05）,G0/G1期细胞比例降低（P<0.05）。4、与si-NC组比较,si-circ＿0027089#1组、si-circ＿0027089#2组circ＿0027089的表达水平降低（P<0.05）,其中si-circ＿0027089#2组circ＿0027089的表达水平相对较低,因而选用si-circ＿0027089#2进行后续实验。5、与si-NC组比较,si-circ＿0027089#2组细胞活力降低（P<0.05）,克隆形成率与划痕愈合率降低（P<0.05）,S期细胞比例降低（P<0.05）,侵袭细胞数明显减少（P<0.05）,凋亡率与Caspase3/7活力升高（P<0.05）,G0/G1期细胞比例升高（P<0.05）。6、双荧光素酶报告基因实验与RIP实验证实circ＿0027089可靶向调控miR-136-5p,circ＿0027089与miR-136-5p呈负相关（r=-0.5564,P=0.0009）。7、与si-circ＿0027089#2+anti-miR-NC组比较,si-circ＿0027089#2+anti-miR-136-5p组细胞活力升高（P<0.05）,克隆形成率与划痕愈合率升高（P<0.05）,S期细胞比例升高（P<0.05）,侵袭细胞数增多（P<0.05）,凋亡率与Caspase3/7活力降低（P<0.05）,G0/G1期细胞比例降低（P<0.05）。8、双荧光素酶报告基因实验与RIP实验证实miR-136-5p可靶向调控NACC1,miR-136-5p与NACC1呈负相关（r=-0.6363,P<0.001）。9、与miR-NC组比较,miR-136-5p组细胞活力降低（P<0.05）,克隆形成率与划痕愈合率降低（P<0.05）,S期细胞比例降（P<0.05）,侵袭细胞数减少（P<0.05）,凋亡率与Caspase3/7活力升高（P<0.05）,G0/G1期细胞比例升高（P<0.05）。10、与miR-136-5p+pc DNA组比较,miR-136-5p+NACC1组细胞活力升高（P<0.05）,克隆形成率与划痕愈合率升高（P<0.05）,S期细胞比例升高（P<0.05）,侵袭细胞数增多（P<0.05）,凋亡率与Caspase3/7活力降低（P<0.05）,G0/G1期细胞比例降低（P<0.05）。11、circ＿0027089与NACC1呈正相关（r=0.7232,P<0.0001）,与si-NC组比较,si-circ＿0027089#2组NACC1的表达量降低（P<0.05）;与si-circ＿0027089#2+anti-miR-NC组比较,si-circ＿0027089#2+anti-miR-136-5p组中NACC1的表达量升高（P<0.05）。12、与sh-NC组比较,sh-circ＿0027089组裸鼠移植瘤体积与重量均明显降低（P<0.05）,circ＿0027089与NACC1的表达水平降低（P<0.05）,miR-136-5p的表达水平升高（P<0.05）。结论:1、敲低circ＿0027089可明显降低乙肝相关肝癌细胞增殖、克隆形成、迁移及侵袭能力,并可诱导细胞周期阻滞于G0/G1期,还可诱导细胞凋亡。2、miR-136-5p过表达可抑制乙肝相关肝癌细胞增殖、克隆形成、迁移及侵袭,并可诱导细胞周期阻滞,还可促进细胞凋亡,而NACC1过表达可明显拮抗miR-136-5p过表达对乙肝相关肝癌细胞生物学行为的作用。3、敲低circ＿0027089可通过调控miR-136-5p/NACC1分子轴而抑制乙肝相关肝癌裸鼠移植瘤生长。4、circ＿0027089可通过负向调控miR-136-5p的表达而上调NACC1的表达从而参与乙肝相关肝癌发生及发展过程。
李北林[4]（2020）在《松花粉诱导人肝癌细胞株SK-Hep-1细胞增殖、凋亡和自噬及其机制研究》文中进行了进一步梳理目的:松花粉具有保护器官、调节代谢、增强免疫力等药理作用,但松花粉抗肿瘤作用及机制的研究仍不透彻。本研究通过观察松花粉对人肝癌细胞株SK-Hep-1细胞增殖、凋亡、细胞周期和自噬的影响,进一步探讨松花粉抗肝癌作用及其机制,为松花粉的临床应用提供理论和实验依据。方法:体外培养人肝癌SK-Hep-1细胞,随机分为4组,分别为对照组（0 mg/m L松花粉）、实验组（30、45、60 mg/m L松花粉）。（1）采用细胞增殖/毒性检测试剂盒CCK-8,检测不同浓度松花粉干预不同时间（12、24、48和72 h）后的SK-Hep-1细胞抑制率;（2）松花粉作用2 w后,平板克隆实验观察松花粉对SK-Hep-1细胞克隆、增殖的影响;（3）松花粉处理48 h后,倒置相差显微镜观察松花粉干预后的SK-Hep-1细胞形态学变化;（4）Hoechst 33258荧光染色法检测细胞凋亡的形态学变化和Annexin V-FITC/PI双染法结合流式细胞术观察细胞凋亡的情况;（5）流式细胞仪检测SK-Hep-1细胞的细胞周期变化;（6）RT-PCR方法检测自噬相关基因Beclin-1、LC3-Ⅱ、P62 m RNA的表达水平,Western blot法检测自噬相关基因Beclin-1、LC3-Ⅱ、P62的蛋白表达水平;（7）数据处理采用SPSS 23.0统计软件,计量资料以均数±标准差（mean±SD）表示,多组间比较采用one-way ANOVA或非参数检验进行比较,以P<0.05表示差异有统计学意义。结果:（1）CCK-8法检测显示,松花粉能明显抑制SK-Hep-1细胞增殖,并具有时间和剂量依赖性;（2）平板克隆实验显示,随着松花粉浓度的增高,细胞形成集落数量减少;（3）倒置相差显微镜显示,松花粉可以抑制细胞的增殖;（4）Hoechst 33258荧光染色显示,松花粉可以促进细胞凋亡;Annexin V-FITC/PI双染法显示,与对照组比较,松花粉不同浓度组干预后细胞凋亡率明显升高（P<0.05或P<0.01）,并且细胞凋亡率随着药物作用浓度的增高而增加;（5）细胞周期实验显示,松花粉能使SK-Hep-1细胞周期阻滞于G1期,同时S期和G2期的细胞比例也下降;（6）RT-PCR分析显示,经松花粉（30、45、60 mg/m L）处理后,Beclin-1、LC3-Ⅱ的m RNA表达较对照组明显增加（P<0.05或P<0.01）,而P62的m RNA表达较对照组降低（P<0.05或P<0.01）;Western blot法检测自噬相关基因蛋白的表达水平,也同样得出相同的结论。这进一步证明了松花粉对人肝癌SK-Hep-1细胞具有促进自噬的作用。结论:（1）松花粉能明显降低人肝癌SK-Hep-1细胞增殖能力,且呈剂量和时间依赖性;松花粉能促进细胞的凋亡并使细胞阻滞于细胞周期G1期。（2）松花粉可使人肝癌SK-Hep-1细胞中自噬增强,促进人肝癌细胞株SK-Hep-1细胞的自噬作用,其机制可能是通过提高人肝癌SK-Hep-1细胞Beclin-1、LC3-Ⅱ表达,降低SK-Hep-1细胞P62表达,通过诱导自噬从而发挥抗肝癌的作用。
骆诤[5]（2019）在《BIRC5基因型在肝癌中的分布及miR-218靶向BIRC5对肝癌细胞侵袭能力影响的分子机制研究》文中提出背景:肝癌,作为一种高发病率,高死亡率的消化系统肿瘤,严重影响了大多数患者的生活质量。随着新药的不断出现,肝癌的治疗虽然取得了长足的进展,但其预后仍较差,5年生存率仅约10%。肝癌难以通过早期检查发现,且患病早期病患多无明显症状,多数病人就诊时已属晚期,失去手术彻底根治机会。肝癌的复发转移率高是肝癌预后效果差的主要原因,肝癌转移是一个多因素的复杂过程,其过程最主要包含上皮细胞极性转变、肿瘤细胞间黏附变化,运动能力加强,穿透基底膜,血管生成等。已有研究证明多种粘附分子、基质金属蛋白酶、细胞因子及其所参与的信号转导、癌基因和抑癌基因的表达和调控的改变均涉及到肝癌转移的过程。上皮-间质转化是指在某些特殊的生理或病理条件下,具有极性的上皮细胞失去极性,转换成具有活动能力、在细胞基质中自由移动的间质细胞的过程。在肿瘤的发展中,上皮-间质转化令原本不具有迁徙及侵袭能力的细胞获得浸润能力,并最终转移到其他组织和器官,从而使肿瘤形成局部浸润和远端转移,并再次通过间质-上皮转化定植于转移灶。Wnt/β-catenin信号通路被证明多种关键的不可忽略的调节作用,尤其在骨骼发生、发育与再生的各个阶段,Wnt信号通路扮演着十分活跃的角色。有研究表明,上调的β-catenin将进人细胞核与TCF/LEF信号通路发生作用,激活下游众多的靶基因过度表达,与EMT的发生有直接关联。糖原合成酶激酶-3β是Wnt/β-catenin信号通路的组成因子之一。有研究表明,GSK-3β可通过降解β-catenin抑制肿瘤生长,并通过抑制Wnt通路调节肿瘤细胞死亡增殖和凋亡。而BIRC5被普遍认为是Wnt/β-catenin的靶基因之一。生存素（survivin）是凋亡抑制蛋白家族 IAPs（inhibitor of apoptosis proteins）中抗凋亡作用最强,但结构最简单的蛋白。其基因BIRC5位于17q25,长14.7 kb,具有3个内含子及4个外显子,含有一个杆状病毒IAPs的重复序列。BIRC5在胎儿组织和各种人类恶性肿瘤组织中大量表达,但在正常组织或分化良好的成人组织中无表达。既往研究发现,BIRC5基因在肝癌中高表达,并且和肝癌患者不良的预后相关。敲低BIRC5基因会抑制肿瘤细胞的增殖,促进凋亡。miR-218已证实是DNA损伤修复基因,是核苷酸切除修复（NER）途径的限速酶,NER是DNA修复通路之一。NER可以识别修复紫外线损伤的及化学药物损伤的DNA双链螺旋结构。NER通过解开受损部分DNA的双螺旋结构,切除受损部分,重新合成受损部分使其连接于未受损的DNA结构上。研究发现BIRC5基因的mRNA可编码由297个氨基酸组成的蛋白质,其具有核苷酸切除修复的作用。基因BIRC5的表达与DNA的修复酶缺乏基因形成紧密的异二聚体存在,在核苷酸切除修复途径中作为一个整体,具有切除DNA 5’端和识别损伤的双向作用,同时还具有5’-3’核苷酸内切酶活性,在核苷酸切除修复中起到限速或调节的重要作用,而核苷酸切除修复过程需要miR-218的参与。目的:本课题针对我国人群,采用病例对照研究方法,分析我国肝癌的发病相关危险因素,采用分子生物学和传统的流行病学方法相结合,研究BIRC5基因型在肝癌中的分布,并在分子水平上研究miR-218靶向BIRC5并调节GSK-3 β/β-catenin通路对肝癌细胞侵袭转移能力及其他恶性生物学特征的影响。方法:本研究选取2014年1月-2016年12月在山东省立医院住院的204例肝癌患者作为研究对象,年龄在37-78岁范围;所有参与者均获取知情同意并签字。通过MassARRAY技术检测BIRC5基因的SNP位点,并对miR-218靶向蛋白BIRC5与肝癌患病风险进行相关性分析。通过miR-218模拟物（mimic）和阻遏物（inhibitor）转染构建相关细胞系并通过qPCR检测miR-218的表达。经转染后,通过双荧光素酶报告实验证明了 BIRC5与miR-218之间的靶标关系,并通过Western Blot检测EMT相关标志物的蛋白水平。细胞克隆形成实验检测了miR-218是否影响HepG2细胞的克隆形成能力,Transwell小室实验检测了各转染组细胞的侵袭转移情况,CCK8检测miR-218是否影响HepG2细胞的增殖能力,流式凋亡检测方法及免疫荧光实验检测miR-218是否影响HepG2细胞的凋亡,并进一步通过Western blot研究了 miR-218对GSK-3β/β-catenin通路的调控作用。同时,通过裸鼠成瘤实验及HE染色验证了 miR-218对肝癌瘤体的抑制作用。结果:1.BIRC5 rs3212986rs2298881,rs1 1615 和 rs6498486 基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡遗传平衡定律（P>0.05）,其SNP中的MAF与NCBI中的dbSNP数据库中所描述的普通中国人特征类似,并且SNP的MAF均大于10%。而rs2276466不符合Hardy-Weinberg平衡遗传平衡定律（P=0.02）。2.分析发现BIRC5 rs3212986与GG基因型比较,TT基因型和T等位基因肝癌发病风险略微增高(95%CIs 为 1.93（0.96-3.94）与 1.49（0.95-2.13）,BIRC5 rs11615 TT和T等位基因肝癌发病风险增高(95%CIs为1.59（0.96-2.98）和1.42（0.97-2.26）。3.BIRC5的rs2276466和rs6498486与肝癌发病风险无相关性。4.提取志愿者的肝癌及癌旁组织,结果显示,癌旁组织中niR-218的表达明显较高,而BIRC5的表达较低。与癌旁组织相比,miR-218的表达在不同分期肝癌组织中均明显下降,而BIRC5的表达则均明显上升,且分期越晚,癌组织中的miR-218及BIRC5与癌旁组织的表达差异越大。5.双荧光素酶实验的结果显示,当HepG2细胞转染了克隆有BIRC5 3’-UTR载体质粒后,miR-218过表达组荧光素酶活性明显受到抑制,与对照组相比较差异明显。而转染克隆有BIRC5 3’-UTR突变型载体质粒后,miR-218组荧光素酶的活性值之间无明显差异。同时,BIRC5的蛋白表达水平也通过Western blot进行检测。结果显示,与空白对照组相比,BIRC5在miR-218过表达组的表达明显降低,在miR-218 inhibitor组的表达明显升高,而miR-218 overexpression NC及miR-218 interference NC之间的BIRC5含量差异无统计学意义,因此证明了BIRC5与miR-218之间的靶标关系。6.HepG2组中肉眼可见明显克隆集落,克隆形成率为59±5.568%。与对照组相比,miR-218过表达时克隆集落数量明显减少,克隆形成率为47.67±4.163%,而miR-218 inhibitor组中克隆集落明显增多,克隆形成率为76.67±4.726%。由此可知,靶向BIRC5的miR-218抑制了 HepG2细胞的克隆形成能力（p=0.0038）。7.Transwell小室实验中,对照组中可见一定数量的侵袭及转移细胞,与对照组相比,转染miR-218 mimic的细胞的侵袭及转移均受到了明显的抑制,二者的差异具有统计学意义（p=0.0032）。8.转染 miR-218 mimic 后抑制细胞 EMT 的转化,Vimentin、β-catenin、N-cadherin的表达下调,而E-cadherin的表达上调。与此同时miR-218 inhibitor组,由于干扰了 miR-218在细胞中的表达,Vimentin、β-catenin、N-cadherin的表达上调,E-cadherin的表达上调。（p<0.05）9.采用CCK8实验检测各转染组细胞的增殖情况。与microRNA对照组相比,转染针对BIRC5的miR-218组的细胞的生长受到了明显的抑制,二者的差异具有统计学意义（p=0.0002）。10.采用流式细胞仪验证HepG2细胞凋亡,以此探讨靶向BIRC5的miR-218是否可以诱导了 HepG2细胞的凋亡。对照组中HepG2细胞凋亡比率为9.64±0.59%,miR-218mimic组的细胞凋亡数明显增加,其比例达到20.52±0.58%。同时,miR-218 inhibitor处理组中细胞凋亡减少至5.6±0.63%,相比对照组,miR-218 inhibitor处理组中细胞凋亡明显减少。同时,通过免疫荧光染色检测了细胞凋亡相关因子caspase3及caspase6的表达,与对照相比,靶向BIRC5的miR-218 caspase-3及caspase6的表达明显上升。11.与HepG2组相比,miR-218过表达后G1期比例明显上升,S期细胞显着下降,而miR-218 inhibitor组中G1期比例明显下降,S期细胞也有上升的趋势。（p=0.0101）。而G2期的比例变化无统计学意义。12.通过Western blot检测Wnt/β-catenin通路中沿路分子的蛋白表达。经检测发现,当miR-218过表达时,BIRC5表达下降,同时GSK-3β的磷酸化表达下降,TCF7、LEF1及β-catenin的表达均有明显下降（p=0.0023）,而Wnt3a,Dvl,GSK-3β的表达变化无统计学意义。13.在BALB/c-nu小鼠皮下成瘤实验8周后,可明显发现实验组（注射miR-218 mimic质粒转染后的HepG 2细胞株）所生成瘤体长径、短径、重量、体积均明显小于对照组（注射HepG 2细胞株）所生成的瘤体。进一步通过HE染色观察可发现,对照组肿瘤组织体积较大,有小片坏死区域,肿瘤细胞生长旺盛,细胞核异型性明显,间质血管丰富,而实验组的肿瘤切片坏死区域明显增大,间质血管稀少,可见明显纤维化形成,肿瘤细胞生长受到明显抑制。BIRC5的免疫组化证明,BIRC5表达于HepG2细胞质内,对照组中BIRC5表达较高,而miR-218 mimic质粒的转染明显抑制了 BIRC5的表达。14.肝癌细胞系中的miR-218能靶向BIRC5,高表达的miR-218通过下调BIRC5调节GSK-3β/β-catenin通路,抑制肝癌细胞株HepG2中EMT相关基因Vimentin、β-catenin及N-cadherin的表达并上调E-cadherin表达,抑制钙黏蛋白转换的过程,以此抑制了 EMT的发生。同时,高表达的miR-218通过下调BIRC5抑制HepG2细胞株增殖及克隆能力,并促进细胞的凋亡。结论:在中国人群中BIRC5 rs3212986和rs11615基因多态性与肝癌发病风险有相关性。rs2276466和rs6498486与肝癌发病风险无相关性。miR-218可能通过抑制BIRC5基因转录活性,并通过下调BIRC5调节GSK-3β/β-catenin通路,下调β-catenin表达,从而抑制HepG2细胞株的侵袭转移能力并抑制EMT的发生发展过程,抑制HepG2细胞株增殖及克隆能力,并促进细胞的凋亡,以此抑制肝癌的发生和发展。
宋伟[6]（2019）在《HBx上调的LncRNA TRERNA1在促进肝细胞癌进展及预后不良中作用机制研究》文中认为肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是一种具有高复发率和高死亡率的恶性肿瘤疾病。乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）编码的X蛋白（HBx）以多种方式,包括基因畸变和失调、表观遗传学修饰改变及非编码RNA（non-coding RNA,nc RNA）调控等在HCC细胞增殖和转移等过程中发挥重要生物学作用。长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）是一类长度超过200 bp不编码蛋白质的RNA分子,通过挥信号、诱饵、指导或支架的作用方式参与肿瘤的多种生物学过程。HCC中lncRNA的研究结果提示lncRNA可影响HCC的增殖、转移、凋亡等多种功能,HBx亦可通过调控相关分子表达,特别是表观遗传调控方式参与肝癌的发生发展。进一步探究HBx诱导lncRNA及其在HCC恶性进展中的作用机制,将有助于肝癌的有效诊断和靶向治疗策略的制定。本研究应用lncRNA芯片和m RNA芯片分析HBx影响HCC细胞差异表达的lncRNA表达谱和m RNA表达谱;lncRNA TRERNA1因其在过表达HBx细胞中差异表达显着而作为进一步研究的候选分子;通过HBx质粒转染以及RNA干扰（RNAi）方法检测HBx对lncRNA TRERNA1的表达水平的关系;实时定量PCR（Quantitative Real-time PCR,q-PCR）方法检测TRERNA1与HBx在HCC病例组织和HCC细胞中表达水平相关性;细胞划痕实验,Transwell迁移和Matrigel侵袭实验检测TRERNA1对HCC细胞迁移和侵袭能力的影响;裸鼠尾静脉注射建立肿瘤转移模型,以苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin staining,H&E）染色方法检测TRERNA1在体内转移结节的形成;Q-PCR、Western blot分别检测TRERNA1对可能靶基因CDH1 m RNA和蛋白表达水平的影响;RNA免疫共沉淀（RNA Immunoprecipitation,RIP）、免疫共沉淀（Immunoprecipitation,IP）实验检测TRERNA1与EHMT2、SNAI1三者之间的相互结合。染色质免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation,Ch IP）方法分析EHMT2与CDH1启动子区的结合;Q-PCR法检测CDH1在HCC病例中的表达水平及其与TRERNA1转录水平之间的关系;RNA原位杂交方法评估TRERNA1在HCC病例中的表达情况及其对HCC预后不良的关系;通过GO和KEGG Pathway分析TRERNA1可能参与的生物学功能和信号通路;CCK-8增殖实验、平板克隆形成、流式细胞术以及裸鼠皮下成瘤实验检测TRERNA1对HCC细胞增殖能力的影响;Western blot用于检测细胞周期相关蛋白的表达;CCK-8法用于检测TRERNA1对索拉菲尼治疗HCC敏感性的影响,同时Western blot检测TRERNA1对Raf-MEK-ERK磷酸化通路的影响。通过以上研究获得如下研究结果:1 HBx上调了lncRNA TRERNA1的表达,且TRERNA1表达水平与HBx表达存在剂量依赖关系;2 HCC组织中的研究发现TRERNA1的表达水平与HCC转移和分期密切相关,且与HCC患者预后不良有关;3体内外实验研究结果表明,表达上调的TRERNA1不仅促进HCC细胞的迁移和侵袭能力,TRERNA1高表达促进了HCC细胞的增殖和裸鼠移植瘤的生长;4高表达的TRERNA1降低了索拉非尼对HCC细胞的敏感性,与HCC预后不良有关;5结合GO和KEGG Pathway分析过表达TRERNA1表达诱导的差异基因表达谱,发现TRERNA1参与调控的基因主要集中在调控细胞增殖、细胞周期等相关功能;6 TRERNA1以分子支架功能,通过招募EHMT2/SNAI1复合体使CDH1启动子区发生H3K9二甲基化从而抑制CDH1表达,同时TRERNA1发挥增强子样功能激活其邻近基因SNAI1的表达,促进HCC细胞的侵袭转移能力;7 TRERNA1抑制p21蛋白的表达,上调细胞周期调控分子Cyclin D1、CDK2和CDK4的表达,促进HCC细胞G1/S期的转换,增强HCC细胞的增殖能力;8 TRERNA1通过激活磷酸化Raf-MEK-ERK信号通路降低了HCC靶向药物索拉菲尼对HCC治疗的敏感性。综上所述,我们通过研究首次揭示,受HBx诱导的lncRNA TRERNA1通过招募EHMT2/SNAI1复合体抑制了CDH1的表达从而促进HCC的转移。TRERNA1通过激活磷酸化Raf-MEK-ERK通路,降低了索拉菲尼对HCC细胞的敏感性。深入研究lncRNA TRERNA1作用将有助于揭示促进HCC进展的分子机制,并有利于评估HCC靶向药物治疗疗效,将为HCC患者的诊断和治疗提供新的研究策略。
张义[7]（2019）在《RNF5促进肝细胞癌增殖及侵袭转移的研究》文中研究指明实验第一部分RNF5在HCC中高表达与病人恶性预后密切相关目的:探讨RNF5在肝细胞癌中的表达及其临床病理意义和对预后的影响。方法:利用RT-PCR和免疫组化技术分别检测肝癌病人癌和相应癌旁组织中RNF5在m RNA水平（70对）和蛋白水平（67对）的表达,分析RNF5在癌中的表达与患者临床病理特征的相关性及对预后的影响。结果:在m RNA水平癌组织RNF5表达高于癌旁组织（p<0.001）;蛋白水平RNF5在癌组织内的表达也明显高于癌旁组织（p=0.002）,且RNF5在癌内表达水平与肝癌患者的肿瘤大小（p=0.030）、卫星灶（p=0.017）及AFP（p=0.030）密切相关。Kaplan–Meier模型分析显示肝癌组织中RNF5蛋白表达高生存短,Cox回归模型分析表明RNF5高表达是肝癌患者预后的独立危险因素（p=0.021）。结论:RNF5在肝癌中的异常高表达,与肝癌患者增殖及转移指标相关,其高表给患者带来更差的预后。故RNF5可作为一个肝癌预后评价的重要指标,有望成为肝癌全身治疗的新靶点。实验第二部分RNF5促进肝细胞增殖及转移目的:研究RNF5对肝癌细胞增殖及侵袭转移能力的影响,探讨可能的作用机制;探讨RNF5对HBV相关肝炎、肝纤维化的作用。方法:构建稳定过表达和敲低RNF5的肝癌细胞系,进行CCK8、克隆形成、凋亡实验、Transwell小室实验,研究RNF5对肝癌细胞增殖及侵袭转移能力的影响;利用质谱及CO-IP探讨RNF5的作用机制;通过构建动物模型、临床标本研究RNF5在HBV相关肝炎、肝纤维化过程中的作用。结果:RNF5过表达促进SMMC-7721及SK细胞的增殖及侵袭转移能力,敲低内源性RNF5削弱PLC,Huh7细胞增殖及侵袭转移能力。体内实验进一步证实过表达RNF5后肝癌细胞在裸鼠皮下成瘤的能力增强,反之则减弱。感染人HBV后树鼩肝脏组织RNF5轻度表达,阳性率为72%,未感染HBV的肝组织中RNF5少量表达,阳性率仅为28%,两组阳性率差别具有统计学意义（p<0.001）。在四氯化碳致肝硬化动物模型及肝纤维化患者肝穿标本中未检出到RNF5的表达。细胞实验表明RNF5可能通过稳定ATP1A1发挥促癌功能。结论:实验证实RNF5促进肝癌细胞增殖及转移,抑制RNF5的表达可以达到抑制肝癌增殖及侵袭转移,故RNF5可成为肝细胞癌的治疗的新靶点。
周勇[8]（2019）在《LncRNA H19通过miR-15b/CDC42信号轴调控肝癌生物学行为及EMT进程的实验研究》文中研究说明背景肝癌之所以是人类难治性的恶性肿瘤,与肝脏的解剖学特点相关。肝癌可以在极早期就出现肝内的广泛转移或者肝外转移,而上皮间质转化（EMT）是恶性肿瘤侵袭转移的始动环节。因此研究肝癌的生物学行为的调控机制极为重要,尤其是EMT的调控机制更为重要。在我们的前期研究中发现:lncRNAH19、miR-15b、及CDC42在肝癌中异常表达,通过生物学软件发现这三者可能存在着相关的调控位点。因此本课题从临床肝癌标本、肝癌细胞株入手研究这三者的表达状况、与临床病理特点之间的关系,以及在细胞系水平的调控机制,为进一步探索其调控肝癌生物学行为和EMT进程的机制打下一定的基础。第一部分:lncRNAH19、miR-15b和CDC42在肝癌中的表达及关系分析目的 探讨lncRNAH19、miR-15b和CDC42在人肝癌组织及癌旁组织、人肝癌细胞株及正常肝细胞株中的表达差异:探讨lncRNAH19、miR-15b和CDC42在肝癌组织中表达的相关性及潜在临床意义。方法 收集46例人肝癌组织及配对癌旁组织,取对数生长期多种肝癌细胞株和人正常肝细胞株,Trizol法提取Total RNA,采用特异性反转录引物反转录制备cDNA。根据Genebank中的lncRNA H19和miR-15b的全序列,设计针对lncRNA H19和miR-15b的PCR检测引物,实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测lncRNA H19和miR-15b的表达水平。取对数生长期多种肝癌细胞株及人正常肝细胞株,提取细胞总蛋白,BCA法行蛋白定量,Western blot检测CDC42蛋白含量。对46例肝癌组织及配对癌旁组织行免疫组织化学检测CDC42蛋白表达情况。分析lncRNA H19、miR-15b和CDC42在人肝癌组织及癌旁组织、人肝癌细胞株及正常肝细胞株中的表达差异;进一步探讨lncRNAH19、miR-15b和CDC42在肝癌组织表达的相关性及其与肝癌患者临床病理特征的关系。结果 QRT-PCR检测显示,lncRNA H19在人肝癌组织及细胞株中高表达（与癌旁组织和人正常肝细胞株比较,p<0.05）;miR-15b在人肝癌组织及细胞株中低表达（与癌旁组织和人正常肝细胞株比较,p<0.05）;Western blot结果显示:CDC42蛋白则在人肝癌细胞株中高表达（与人正常肝细胞株比较,p<0.05）。免疫组织化学结果显示:CDC42蛋白在人肝癌组织中高表达（与癌旁组织比较,p<0.05）。我们发现lncRNAH19在50.0%（23/46）的肝癌组织中高表达,而在32.6%（15/46）的肝癌组织中低表达;miR-15b在47.8%（22/46）的肝癌组织中低表达,而在30.4%（14/46）的肝癌组织中高表达;CDC42在54.3%（25/46）的肝癌组织中高表达,而在19.6%（9/46）的肝癌组织中低表达。进一步的统计分析显示lncRNAH19的表达水平与病灶数目（χ2=9.698,P=0.002）与分化程度（χ2=4.934,P=0.026）相关,而与年龄、性别、AFP水平、肿瘤大小、门静脉癌栓及AJCC分期等特征无明显相关（P>0.05）;miR-15b的表达水平与病灶数目（χ2=7.066,P=0.008）相关,而与年龄、性别、AFP水平、肿瘤大小、门静脉癌栓、分化程度及AJCC分期等特征无明显相关（P>0.05）;CDC42的表达水平与AJCC分期（χ2=5.275,P=0.022）与分化程度（χ2=5.100,p=0.024）相关,而与年龄、性别、AFP水平、门静脉癌栓、肿瘤大小及病灶数目等特征无明显相关（P>0.05）。结论 lncRNAH19和CDC42在人肝癌组织及细胞株中高表达,miR-15b在人肝癌组织及细胞株中低表达。lncRNAH19表达水平和CDC42呈正相关,而miR-15b表达水平与lncRNAH19和CDC42呈负相关。lncRNAH19、miR-15b和CDC42的表达水平与肝癌病灶数目、分化程度或者AJCC分期相关。第二部分:lncRNAH19、miR-15b和CDC42之间调控关系分析目的 分析lncRNA H19和miR-15b、miR-15b和CDC42之间的调控关系。方法 生物信息学软件预测lncRNA H19与miR-15b、miR-15b与CDC42之间可能存在的结合位点。分别合成miR-15b mimics和miR-15b inhibitor;设计合成针对lncRNAH19 的短发夹 RNA,并克隆至 pSicoR 质粒载体（shH19）。将 shH19、miR-15b mimics、miR-15b inhibitor 分别转染 HepG2 和 Bel-7402 细胞株,qRT-PCR 检测转染前后细胞 lncRNA H19、miR-15b 和 CDC42 mRNA 表达水平。将 H19、CDC42 3’UTR区及其突变体克隆到萤光素酶载体psiCHECK-2中,构建H19、CDC42 3’UTR区野生型和突变型质粒。将H19、CDC42 3’UTR区野生型和突变型重组质粒分别与miR-15b mimics、miR-15b inhibitor、miR-15b mimics 阴性对照或 miR-15b inhibitor 阴性对照在293T细胞中共转染。收集细胞后通过双萤光素酶报告系统检测不同组别的萤光素酶活性,从而对lncRNAH19和miR-15b、miR-15b和CDC42的之间的靶向调节关系进行验证。结果生物信息学软件发现lncRNA H19与miR-15b、miR-15b与CDC42 3’UTR区存在潜在结合位点。shH19转染HepG2和Bel-7402细胞后,lncRNA H19、CDC42mRNA的表达水平较空白对照和阴性对照组显着下降,而miR-15b表达水平较空白对照和阴性对照组明显增加（p<0.05）。miR-15b mimics转染HepG2和Bel-7402细胞后,CDC42 mRNA的表达水平较空白对照和阴性对照组显着下降,miR-15b表达水平较空白对照和阴性对照组显着增加（p<0.05）;而miR-15b inhibitor转染HepG2和Bel-7402细胞后,CDC42 mRNA的表达水平较空白对照和阴性对照组显着增加,miR-15b表达水平较空白对照和阴性对照组明显降低（p<0.05）。双萤光素酶报告基因检测系统显示,miR-15b mimics分别与H19野生型和突变型重组质粒共转染293T细胞后,H19野生型双萤光素酶活性较空白对照组明显降低（p<0.05）;miR-15b inhibitor分别与H19野生型和突变型重组质粒共转染293T细胞后,H19野生型双萤光素酶活性较空白对照组明显增加（p<0.05）。而miR-15b mimics分别与CDC423’UTR野生型和突变型重组质粒共转染293细胞后,CDC42 3’UTR区野生型双萤光素酶活性较空白对照组明显降低;miR-15b inhibitor分别与CDC42 3’UTR野生型和突变型重组质粒共转染293T细胞后,CDC42 3’UTR野生型双萤光素酶活性较空白对照组明显增加（p<0.05）。而 miR-15b 模拟物、miR-15 binhibitor 对 H19 突变型、CDC423’UTR突变型萤光素酶活性无明显影响（p>0.05）。结论 lncRNAH19能靶向结合miR-15b,CDC42为miR-15b的靶基因。在肝癌细胞中,H19可以通过靶向调控miR-15b的表达而上调CDC42的表达。第三部分:lncRNAH19/miR-15b/CDC42信号轴对肝癌细胞生物学行为的影响目的 构建不同lncRNAH19、miR-15b表达水平的细胞模型,探讨其对CDC42表达水平的影响及对细胞增殖、侵袭迁移和凋亡生物学进程的影响。方法 分别用 shH 19、miR-15b mimics、miR-15b inhibitor 和 shH19/miR-15b inhibitor 复合物脂质体转染 Bel-7402、HepG2 细胞,qRT-PCR、Western blot 检测转染前后细胞CDC42mRNA及蛋白表达水平;此外,通过平板克隆实验、划痕试验、Transwell实验和细胞凋亡实验观察转染前后细胞增殖、侵袭迁移和凋亡等生物学行为的改变。结果 shH19、miR-15b mimics转染后,细胞增殖、侵袭迁移能力和CDC42表达水平较空白对照组明显降低,而凋亡能力明显增加（p<0.05）;miR-15b inhibitor转染后,细胞增殖、侵袭迁移能力和CDC42表达水平显着升高,而凋亡能力明显降低（p<0.05）。此外shH19/miR-15b inhibitor复合物转染肝癌细胞后,细胞增殖、侵袭迁移能力和CDC42表达水平较shH19单转染组明显增加,而细胞凋亡能力明显降低（p<0.05）。结论 miR-15b inhibitor可逆转shH19介导的肝癌细胞增殖、侵袭迁移和凋亡生物学行为的改变。lncRNAH19可通过靶向调控miR-15b/CDC42信号轴而参与肝癌细胞增殖、侵袭迁移和凋亡生物学进程。第四部分:lncRNAH19通过miR-15b/CDC42信号轴调控肝癌细胞EMT进程的初步研究目的:探讨lncRNAH19/miR-15b/CDC42信号轴在肝癌EMT进程中的作用。方法:分别用 shH19、miR-15b mimics、miR-15b inhibitor 和 shH19/miR-15b inhibitor复合物脂质体转染Bel-7402、HepG2细胞,qRT-PCR检测转染前后细胞CDC42、PAK1及EMT相关基因mRNA的表达情况;Western blot检测转染前后细胞CDC42、p-PAK1及EMT相关蛋白表达情况。对46例肝癌组织及其配对癌旁组织行qRT-PCR、Western blot检测,分析EMT相关基因及蛋白表达情况及其与lncRNAH19表达水平的相关性。结果:shH19 和 miR-15b mimics 转染后,细胞 CDC42、PAK1、N-cadherin、Vimentin mRNA和CDC42、p-PAK1、N-cadherin、Vimentin蛋白表达水平较空白对照组明显降低,而E-cadherin mRNA和蛋白表达水平较空白对照组明显增高（p<0.05）;miR-15b inhibitor 转染后,细胞 CDC42、PAK1、N-cadherin、Vimentin mRNA和CDC42、p-PAK1、N-cadherin、Vimentin蛋白表达水平较空白对照组明显增加,而E-cadherin mRNA和蛋白表达水平较空白对照组明显降低（p<0.05）;此外shH19/miR-15b inhibitor 复合物转染后,细胞 CDC42、PAK1、N-cadherin、Vimentin mRNA 和 CDC42、p-PAK1、N-cadherin、Vimentin 蛋白表达水平较 shH19 单转染组明显增加,而E-cadherin mRNA和蛋白表达水平较shH19单转染组明显降低（p<0.05）。与癌旁组织相比,肝癌组织中E-cadherin mRNA和蛋白表达水平明显降低,而N-cadherin和Vimentin表达水平明显增加（p<0.05）。Spearman相关性分析发现:肝癌组织中H19表达水平与E-cadherin表达水平呈负相关,而与N-cadherin和Vimentin呈正相关。结论:miR-15b inhibitor可逆转shH19介导肝癌细胞EMT相关蛋白的调控作用。lncRNA H19可通过靶向miR-15b活化CDC42/PAK1信号通道而促进肝癌细胞EMT进程。lncRNA H19可通过miR-15b/CDC42信号轴参与肝癌EMT进程。
卢海[9]（2018）在《PRIM1在肝细胞癌中的作用及临床意义研究》文中提出尽管人们对肝细胞癌外科的手术治疗、全身的系统治疗的体系的逐步的完善,同时也随着对分子病理生理机制水平深入的基础研究,对于肝细胞癌的认识越来越清晰,但目前并没有改变肝细胞癌发病率逐渐升高、死亡率仍在升高的这个趋势,仍需要在肝细胞癌发生机制方面做深入研究,尤其是肝细胞癌细胞的DNA复制的启动点的研究需要更加深入。DNA合成酶的作用是开始DNA合成。真核细胞核DNA引物合成酶含有PRIM1和PRIM2 2个亚基。PRIM1是异四倍体真核生物多醚菌素α/引物酶合成物最小亚基,它单独携带有酶的催化作用和引物的延伸作用,然而PRIM2基于完全没有这些酶的活性作用。在整个细胞周期过程中,PRIM1基因的mRNA水平的表达是不断调整的,没有PRIM1基因的催化作用,DNA的起始点的复制是无法进行的,所以PRIM1基因在肿瘤的形成过程中扮演非常重要的角色,目前已有在膀胱癌、乳腺癌、骨肉瘤等肿瘤细胞中是报道。很多微点阵研究证实细胞循环周期的异常在肝细胞癌是一个连贯事件,PRIM1突变影响细胞循环周期G1到S期过渡。Wurmbach等研究证实PRIM1基因可以作为早期肝细胞癌的潜在的标记物,在肝细胞癌发展过程中的一个重要特征是向上调节的PRIM1基因同时参与细胞的损伤、DNA的修复与复制。鉴于PRIM1参与DNA合成的催化和引物的延伸作用,且已有研究表明在肝肿瘤细胞中PRIM1高表达,本课题组提出PRIM1促进肝细胞癌细胞增殖的假设,我们拟借助TCGA（The Cancer Genome Atlas）肿瘤标本数据库成熟的样本信息,利用生物信息学分析对获得50对配对的肿瘤样本RNAseq数据进行统计分析获得PRIM1基因信息,以实现以下目标:1.利用现有的肿瘤标本数据库,运用生物信息学及统计学分析方法获得PRIM1基因信息同时证明其与临床具有相关性;2.设计PRIM1干扰靶点基因干扰肝细胞癌细胞系,鉴定肝细胞癌细胞增殖情况;3.制备Affymetrix表达谱芯片同时推测PRIM1基因在肝细胞癌形成过程中的信号调控通路等研究。具体包括以下四部分研究内容:一、TGCA肿瘤数据库,获得50对配对的的肝细胞样本信息,利用生物信息学分析获得PRIM1基因信息二、以目的基因PRIM1基因为模板,设计PRIM1基因干扰靶点基因序列,同时进行慢病毒包装获得干扰质粒;三、干扰BEL-7 4 04、SMMC-7 72 1肝细胞癌细胞中PRIM1基因表达,鉴定肝细胞癌细胞增殖情况;四、制备Affymetrix表达谱芯片制备及利用Pathway探索PRIM1基因下游调控蛋白表达检测;目的探寻PRIM1基因在肝细胞癌形成中的作用机制及其临床的意义。方法我们通过癌症和肿瘤基因图谱计划（The Cancer Genome Atlas,TCGA）肿瘤数据库获获得50对配对的肝细胞癌样本RNAseq数据,再利用Trimmed Mean of M-values 进行数据标准化、Biological coefficient of variation 进行数据质控、Log2（Cancer/Normal）过滤等统计学方法获得PRIM1目的基因信息,同时也用Mann-Whitney U检验法对PRIM1基因在不同临床资料的不同水平上的表达水平的差异显着性进行分析,进而说明PRIM1基因不同的临床T分期、N转移、M转移和病理分级分组的患者癌组织中的表达的差异性。以PRIM1目的基因为模板设计并完成其目的基因干扰靶点的序列,获得LV-PRIM1-RNAi质粒,利用慢病毒将获得的干扰靶点质粒转染进入B E L-7 4 0 4、S M M C-7 7 2 1细胞,借助Celigo仪器、Caspase3/7Assay试剂盒、流式细胞仪、MTT测定慢病毒转染后基因敲减效率大于50%的肝细胞癌细胞的增殖及凋亡情况;再将含有干扰靶基因的慢病毒液转染后的B E L-7 4 0 4细胞接种至4周龄的雌性的SCID小鼠的皮下,连续动态观察其注射部位形成的肿瘤重量及荧光的表达量。同时提取慢病毒转染后基因敲减效率大于70%的肝细胞癌细胞的总得RNA制备Affymetrix基因表达谱,利用一体化的在线整合分析软件（IPA）分析转染后的肝细胞癌的基因、蛋白质之间的属性及相互作用关系网络,同时利用Western Blot验证基因与蛋白之间的关系。结果对TCGA肿瘤数据库获得的50对配对的肝细胞癌的样本RNAseq数据,进行TMM、BCV等生物信息学分析,说明获得的肝细胞癌的样本数据具有很高的稳定性,可以用于后续的分析,Log2（Cancer/Normal）分析方法获得PRIM1基因信息;Mann-Whitney U统计学检验方法对PRIM1在不同临床资料的不同水平上的表达水平的差异显示其具有显着的差异性,且PRIM1在不同T分期、N转移、M转移和病理分级分组的患者癌组织中的表达具有显着的差异性,从而也说明PRIM1与肝细胞癌的临床病理分期具有相关性。将以PRIM1目的基因为模板获得的经过基因测序结果正确的干扰靶基因质粒经过慢病毒包装系统转染进B E L-7 4 0 4、S M M C-7 7 2 1细胞后,对于QPCR检测到肿瘤细胞中PRIMI基因敲减效率达50%的肝细胞癌细胞通过Celigo仪器、Caspase3/7 Assay试剂盒、流式细胞仪、MTT测定显示转染后的肝细胞癌细胞的增殖能力减弱、凋亡能力增加;慢病毒转染后B E L-7 4 0 4细胞接种至4周龄的雌性的SCID小鼠皮下,连续动态观察显示转染后干扰组形成的肿瘤重量及荧光的表达量均较对照组减少。Affymetrix表达谱分析、IPA整合软件及Western Blot检测显示下游的PRIM1基因EGR1蛋白表达下调32.2%,WNT5A蛋白表达下调47.2%,IRS1蛋白表达下调37.3%。结论干扰肝细胞癌中PRIM1基因的表达,能够显着抑制肝细胞癌细胞的增殖,同时也促进肝细胞癌细胞的凋亡,PRIM1可能是通过WNT5a蛋白调控通路调节肝细胞癌的增殖与凋亡。
廖芝玲[10]（2007）在《uPA及V-ATPase在肝细胞癌的表达及其与浸润转移的关系》文中进行了进一步梳理研究背景和目的:肝癌是我国高发的恶性肿瘤,而广西又是高发地区。肝癌的复发和转移是治疗和预后不良的关键。恶性肿瘤的转移过程主要包括肿瘤细胞从原发部位脱离,浸润细胞外基质,侵入淋巴管或血管,粘附在血管远处内皮细胞壁并向血管外迁移,形成新的转移灶等步骤。细胞外基质的降解是癌转移的必经步骤,基质蛋白水解主要通过组织蛋白酶/uPA/uPAR/MMPs/纤溶酶原网络系统实现,尿激酶型纤溶酶原激活物（urokinase typeplasminogen activator,uPA）在该过程中起关键作用。它被组织蛋白酶激活,继而激活纤溶酶原,再激活基质金属蛋白酶（Matrix Metalloproteinases,MMPs）,发挥降解细胞外基质的作用。uPA和MMPs的过表达与许多肿瘤转移相关。大多数实体肿瘤是缺氧的,癌细胞通过葡萄糖酵解获得能量,酵解代谢过程产生多量的酸性产物,癌细胞尤其是有高转移潜能的癌细胞通常采取质子泵即Vacuolar-type H（+）-ATPase（V-ATPase）的途径将多产生的H+泵出细胞外,从而维持细胞内pH值稳定在正常范围,以保证细胞不因酸中毒而凋亡,同时造成癌细胞外酸性微环境。研究表明,能够在酸性环境中生存的癌细胞浸润能力增强,在酸性环境中组织蛋白酶、uPA和MMPs分泌增多且发生重新分布,在癌细胞表面和侵袭前缘分布增多,有利于侵袭、浸润和转移的发生。抑制V-ATPase能够抑制癌细胞酸性产物的排出,导致细胞内酸中毒凋亡,同时削弱癌细胞外酸性环境,不利于基质蛋白水解酶的分泌及细胞外基质的降解。过去关于HCC的研究以癌基因及旁路通道为主,尚未见将肿瘤微环境与肝癌相联系研究的报道。我们研究uPA和V-ATPase与肝癌发生和转移的关系,同时探讨抑制V-ATPase、干扰癌细胞H+泵出,使癌细胞酸中毒凋亡,寻找临床治疗的一个新的有效的靶点。材料和方法:1.标本来源:肝癌组织标本来源于2004年9月-2006年4月广西医科大学第一附属医院肝胆外科肝癌患者手术切除的病例共45例,取癌和癌旁组织,以距离癌肿边缘2cm以远为癌旁组织,其中,男39例,女6例,年龄21-72岁。以7例肝血管瘤旁组织做对照组。低转移潜能肝癌细胞株HCC97L购于复旦大学上海中山医院肝癌研究所。2.用RT-PCR和免疫组化SP法检测肝癌组织中uPA、MMP-9和V-ATPasemRNA和蛋白的表达;并分析它们表达间的相关性;将实验结果与病理、临床资料（伴有静脉癌栓及肝内外转移形成、乙型肝炎病毒感染、病理分级、血清AFP水平、肿瘤直径）进行比较分析。3.从肝癌组织中提取RNA,克隆uPA基因,构建原核表达载体,酶切鉴定,并送测序。4.构建真核表达载体,将重组质粒pCMV-uPA-HA送测序。将其转染低转移肝癌HCC97L细胞株,用抗生素筛选法筛选稳定转染细胞株,用RT-PCR和Western blot鉴定转染是否成功。5.用RT-PCR和western blot以及细胞免疫化学检测转染uPA细胞株和转染空载体细胞株中uPA及V-ATPase mRNA和蛋白的表达;6.肿瘤细胞体外迁移实验比较转染uPA基因和转染空载体细胞株的迁移能力;7.在细胞培养基中分别加入50和100nM浓度的V-ATPase抑制剂Bafilomycin A 1,肿瘤细胞体外迁移实验比较转染uPA基因细胞在Bafilomycin A 1的作用下迁移能力的变化;8.在细胞培养基中分别加入300、400、500nM的Bafilomycin A 1,12小时后收集细胞,用流式分析仪检测细胞凋亡情况;9.在细胞培养基中分别加入500、600、700nM Bafilomycin A 1,用CKK-8试剂盒检测在药物作用下细胞受抑制情况。结果:1.45例肝癌组织中伴有门静脉癌栓和/或肝内外转移者20例,不伴者25例,其它尚按病理分级、肿物直径、乙肝病毒感染、AFP水平分组;2.uPA mRNA在肝癌组、癌旁组和对照组表达阳性率分别为100%（45/45）、84.44%（38/45）,和28.57%（2/7）;癌与癌旁组及正常对照组比较均有显着性差异（P＜0.01,P＜0.05）。uPA蛋白表达阳性率在肝癌组、癌旁组和对照组分别为75.56%（34/45）、26.67%（12/45）、28.57%（2/7）,癌组分别与癌旁组及对照组比较有显着性差异（P＜0.01,P＜0.05）。肝癌组织中uPA mRNA和蛋白的表达与肝内外转移明显有关（P＜0.01）,而与乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染、病理分级、血清AFP水平以及肿瘤直径无明显关系（P＞0.05）。3.MMP-9 mRNA在肝癌组、癌旁组和对照组表达阳性率分别为100%（45/45）、86.67%（39/45）、57.14%（4/7）;癌组分别与癌旁组及对照组比较有显着性差异（P＜0.01,P＜0.05）。MMP-9蛋白表达阳性率在肝癌组、癌旁组和对照组分别为66.67%（30/45）、22.22%（10/45）、14.29%（1/7）,癌组与癌旁组相比、癌组与对照组相比有显着性差异（P＜0.01,P＜0.05）。MMP-9 mRNA和蛋白的表达与静脉癌栓形成、肝内外转移明显有关（P＜0.01）,而与HBV感染、病理分级、血清AFP水平以及肿瘤直径无明显关系（P＞0.05）。4.V-ATPase mRNA在肝癌组、癌旁组和对照组表达阳性率分别为100%（45/45）、86.67%（39/45）和71.43%（5/7）;癌与癌旁组及正常对照组的阳性表达比较均有显着性差异（P＜0.05,P＜0.05）。V-ATPase蛋白在肝癌组、癌旁组和对照组表达阳性率分别为82.22%（30/45）、51.11%（10/45）、42.86%（3/7）,癌与癌旁组及正常对照组的阳性表达比较均有显着性差异（P＜0.05,P＜0.05）。V-ATP-ase mRNA和蛋白的表达与静脉癌栓形成、肝内外转移明显有关（P＜0.01）,而与HBV感染、病理分级、血清AFP水平以及肿瘤直径无显着相关（P＞0.05）。uPA mRNA与MMP-9 mRNA的表达呈正相关,uPA蛋白与MMP-9蛋白的表达亦呈正相关;uPA mRNA与V-ATP-ase mRNA的表达呈正相关,uPA蛋白与V-ATP-ase蛋白的表达亦呈正相关。5.从人肝癌组织中成功克隆uPA基因编码区,长度1332bp;成功构建真核表达载体pCMV-uPA-HA并测序,转染低转移潜能肝癌细胞株,获得稳定转染pCMV-uPA-HA HCC97L肝癌细胞株。经RT-PCR和Western blot检测,稳定转染株pCMV-uPA-HA细胞的uPA mRNA和uPA蛋白表达明显强于转染pCMV-HA细胞株和未转染细胞株。6.RT-PCR和Western blot方法检测表明,uPA、V-ATPase mRNA和蛋白的表达在转染uPA基因细胞株均强于转染空载体细胞株;细胞免疫化学显示,uPA和V-ATPase在转uPA基因细胞株的阳性表达明显强于转空载体细胞株,阳性物质定位于细胞浆和细胞膜,V-ATPase在胞膜的表达突出。7.肿瘤细胞体外迁移实验结果显示,转uPA基因细胞株覆盖创痕的速度快于转空载体株,提示细胞uPA合成、分泌和表达增强,促进癌细胞的迁移、浸润和转移。8.培养基中加入Bafilomycin A 1,细胞覆盖创痕的速度降低;100 nM浓度的抑制用作强于50nM;提示Bafilomycin A 1抑制V-ATPase,继而抑制细胞的迁移运动能力。9.流式仪器检测细胞凋亡实验:培养基中加入药物浓度为300、400、500nM的Bafilomycin A1,对照组凋亡率是1.22%,药物实验组凋亡率分别为4.31%、7.48%和20.6%;10.CKK-8试剂盒检测细胞抑制率:在培养基中加入500、600、700nM的bafilomycin A1药物,用CKK-8试剂检测,细胞抑制率分别为:32.63%、51.14%、58.67%。结论:1.uPA、MMP-9和V-ATPase mRNA和蛋白在肝癌组织中呈高表达,这种高表达与肝癌的浸润转移有关。2.随着肝癌细胞转移潜能的增高,V-ATPase表达增强,在细胞膜分布增加;3.用Bafilomycin A 1抑制V-ATPase,肝癌细胞的迁移能力降低,加大Bafilomycin A 1剂量,细胞受到抑制并出现凋亡。4.抑制V-ATPase会导致癌细胞向细胞外排出酸性物质的能力降低,细胞因酸中毒而死亡,可以考虑作为临床治疗肝癌的一个靶点。
二、中国启东地区肝癌细胞凋亡相关基因的克隆、表达及其与肝癌相关性研究(英文)（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、中国启东地区肝癌细胞凋亡相关基因的克隆、表达及其与肝癌相关性研究(英文)（论文提纲范文）
（1）第一部分：AHR介导黄曲霉毒素B1在肝细胞癌中的毒性研究 第二部分：靶向测序对多种EBV感染相关恶性肿瘤中EBV整合位点分析研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词 |
| 第一部分: AHR介导黄曲霉毒素B1在肝细胞癌中的毒性研究 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验试剂及设备 |
| 3.实验方法 |
| 实验结果 |
| 1. AHR是AFB1在肝癌细胞中发挥毒性的关键分子 |
| 2. AHR的缺失提高了肝癌细胞对AFB1的耐受能力 |
| 3. AFB1增加了由AHR活性诱导的长链脂肪酸的积累 |
| 4. AFB1可以提高AHR及其下游基因的表达水平 |
| 5. AFB1诱导了AHR蛋白的入核且可以与AHR蛋白的N端结合 |
| 6. AHR在黄曲霉相关肝癌中高表达 |
| 7. AHR的激活可以增加抗PD-L1治疗效果 |
| 讨论 |
| 第二部分: 靶向测序对多种EBV感染相关恶性肿瘤中EBV整合位点分析研究 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验试剂及设备 |
| 3.实验流程及方法 |
| 实验结果 |
| 1. EBV整合位点在人基因组中的分布情况 |
| 2. EBV整合位点常分布于肿瘤抑癌基因和炎症相关基因附近 |
| 3. EBV整合对CDK15,TNFAIP3和PARK2基因表达的影响 |
| 4. EBV整合位点在EBV基因组中的分布情况 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 芳香烃受体在肿瘤发生发展中的研究 |
| 参考文献 |
| 基金资助 |
| 发表文章 |
| 致谢 |
（2）LINC13及ACTR分别调控氧化应激及糖酵解介导肝癌耐药的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 肝癌OXA耐药相关新分子LINC13 及其临床意义 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 LINC13 调控SM1 介导肝癌OXA耐药的可能机制 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 肝癌细胞中LINC13 调控SM1 的分子机制 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分 LINC13-SF1-SM1轴促进抗氧化应激反应导致OXA耐药 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第五部分 ACTR调控糖酵解作用介导肝癌索拉非尼耐药 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 长链非编码RNA在肝细胞癌耐药中的作用机制及研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）circ＿0027089通过miR-136-5p/NACC1轴调控乙型肝炎病毒相关肝癌的进程（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 circ_0027089 在乙肝相关肝癌细胞中的表达及功能研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 细胞与主要试剂 |
| 2.2 实验仪器 |
| 2.3 配置溶液 |
| 2.4 肝癌组织来源 |
| 2.5 细胞培养 |
| 2.6 qPCR检测肝癌细胞中HBV DNA水平 |
| 2.7 细胞转染 |
| 2.8 实验分组 |
| 2.9 qRT-PCR实验检测circ_0027089 的表达水平 |
| 2.10 CCK8 实验检测细胞活力 |
| 2.11 平板克隆形成实验检测细胞克隆形成能力 |
| 2.12 流式细胞术检测细胞凋亡率 |
| 2.13 Caspase3/7 活力测定 |
| 2.14 检测细胞周期 |
| 2.15 划痕实验 |
| 2.16 Transwell小室实验检测细胞侵袭 |
| 2.17 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 乙肝相关的肝癌细胞中HBV DNA复制水平 |
| 3.2 circ_0027089 在肝癌组织和细胞中的表达 |
| 3.3 过表达circ_0027089 可促进乙肝病毒相关肝癌细胞增殖,并抑制凋亡 |
| 3.4 过表达circ_0027089 促进细胞周期进程 |
| 3.5 过表达circ_0027089 促进细胞迁移和侵袭 |
| 3.6 敲低circ_0027089 可抑制乙肝病毒相关肝癌细胞增殖,并促进凋亡 |
| 3.7 敲低circ_0027089 抑制细胞周期进程 |
| 3.8 敲低circ_0027089 抑制细胞迁移和侵袭 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 circ_0027089/miR-136-5p/NACC1 在乙肝相关肝癌细胞中的分子机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 细胞与主要试剂 |
| 2.2 实验仪器 |
| 2.3 细胞培养 |
| 2.4 主要溶液配制 |
| 2.5 细胞转染 |
| 2.6 实验分组 |
| 2.7 qRT-PCR实验检测miR-136-5p、NACC1 mRNA的表达水平 |
| 2.8 CCK8 实验检测细胞活力 |
| 2.9 平板克隆形成实验检测细胞克隆形成能力 |
| 2.10 流式细胞术检测细胞凋亡率 |
| 2.11 Caspase3/7 活力测定 |
| 2.12 检测细胞周期 |
| 2.13 划痕实验 |
| 2.14 Transwell小室实验检测细胞侵袭 |
| 2.15 双荧光素酶报告基因实验 |
| 2.16 RIP实验 |
| 2.17 Western blot实验检测NACC1 蛋白表达量 |
| 2.18 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 circBank、双荧光标记和 RIP实验预测circ_0027089和miR-136-5p靶向结合 |
| 3.2 miR-136-5p在肝癌组织和细胞中低表达 |
| 3.3 circ_0027089 基因敲低通过增加miR-136-5p的表达抑制肝癌细胞增殖和周期,并促进凋亡 |
| 3.4 circ_0027089 基因敲低通过增加miR-136-5p的表达抑制细胞周期进程 |
| 3.5 circ_0027089 基因敲低通过增加miR-136-5p的表达抑制细胞迁移和侵袭 |
| 3.6 starbase、双荧光素酶标记和RIP实验预测NACC1与miR-136-5p存在靶向关系 |
| 3.7 NACC1 在肝癌组织和细胞中高表达 |
| 3.8 过表达 NACC1 可以恢复过表达 miR-136-5p对细胞增殖和凋亡的影响 |
| 3.9 过表达 NACC 1 可以恢复过表达 miR- 136-5p对细胞周期的影响 |
| 3.10 过表达 NACC1 可以恢复过表达 miR-136-5p对细胞迁移和侵袭的影响 |
| 3.11 circ_0027089 可通过靶向作用miR-136-5p调控NACC1 的表达 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分 敲低circ_0027089 抑制了体内肿瘤的生长 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 敲低circ_0027089 抑制体内肿瘤生长 |
| 3.2 敲低circ_0027089对miR-136-5p和 NACC1 表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 非编码RNA在肝癌发生及发展过程中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）松花粉诱导人肝癌细胞株SK-Hep-1细胞增殖、凋亡和自噬及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英汉缩略词对照表 |
| 前言 |
| 第一部分 :松花粉对人肝癌SK-Hep-1细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响 |
| 1 材料和试剂 |
| 2 方法与步骤 |
| 3 实验结果 |
| 4 本章小结 |
| 第二部分 :松花粉对人肝癌SK-Hep-1细胞自噬的影响 |
| 1 材料和试剂 |
| 2 方法与步骤 |
| 3 实验结果 |
| 4 本章小结 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 不足与展望 |
| 创新点 |
| 全文结论 |
| 综述 松花粉的药理作用及抗肿瘤作用研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文及获得的科研成果 |
（5）BIRC5基因型在肝癌中的分布及miR-218靶向BIRC5对肝癌细胞侵袭能力影响的分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文部分 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩写对照表 |
| 前言 |
| 第一部分 BIRC5的基因型分布与肝癌发病率的相关性 |
| 第1章 材料与方法 |
| 1 研究对象 |
| 2 实验方法 |
| 3 Hardy-Weinberg遗传平衡检验结果 |
| 4 统计学分析 |
| 第2章 实验结果 |
| 1 研究对象的基本特征 |
| 2 BIRC5各种SNP基因型特征 |
| 3 BIRC5各种SNP基因型与肝癌发病风险 |
| 第二部分 MIR-218在肝癌细胞中的表达及其对肝癌细胞侵袭能力的影响 |
| 第1章 材料与方法 |
| 1 细胞培养 |
| 2 RT-PCR验证miR-218在不同肝癌细胞株中的表达 |
| 3 质粒转染 |
| 4 Western blot检测 |
| 5 CCK8实验检测细胞增殖水平 |
| 6 Transwell迁移实验 |
| 7 克隆形成实验 |
| 8 流式凋亡检测方法 |
| 9 免疫荧光 |
| 10 双荧光素酶实验 |
| 11 细胞周期检测 |
| 12 裸鼠成瘤实验 |
| 13 HE染色 |
| 14 免疫组化染色 |
| 15 统计学处理 |
| 第2章 结果 |
| 1 四株肝癌细胞株中miR-218基因的表达情况 |
| 2 不同分期肝癌组织中miR-218及BIRC5的表达 |
| 3 质粒转染后miR-218的表达 |
| 4 BIRC5是miR-218的靶基因 |
| 5 靶向BIRC5的miR-218对HepG2细胞克隆能力的影响 |
| 6 靶向BIRC5的miR-218对HepG2细胞侵袭转移能力的影响 |
| 7 EMT相关标志物的蛋白水平检测 |
| 8 靶向BIRC5的miR-218对HepG2细胞增殖能力的影响 |
| 9 靶向BIRC5的miR-218的表达对肿瘤细胞凋亡的影响 |
| 10 靶向BIRC5的miR-218对HepG2细胞周期的影响 |
| 11 miR-218通过下调BIRC5的表达调节GSK-3β/β-catenin通路 |
| 12 裸鼠成瘤实验 |
| 第三部分 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 肝癌相关基因突变与肝癌遗传易感性的研究 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间所得的科研成果 |
| 学位论文及答辩辩情况表 |
| 附件 |
| 英文部分(大论文英文版) |
| Abstract |
| Chinese and English abbreviations table |
| Before the speech |
| The first part is the correlation between the genotype distribution of BIRC5 andthe incidence of liver cancer |
| Chapter 1 Materials and methods |
| 1 Research object |
| 2 experimental methods |
| 3 Hardy-Weinberg genetic balance test results |
| 4 statistical analysis |
| Chapter 2 The experimental results |
| 1 Basic characteristics of the research object |
| 2 Various SNP genotypes of BIRC5 |
| 3 Various SNP genotypes of BIRC5 and the risk of liver cancer |
| The two part expression of mir-218 in hepatocellular carcinoma cells and its effect on invasion ability of hepatocellular carcinoma cells |
| Chapter 1 Materials and methods |
| 1 Cell culture |
| 2 Rt-pcr confirmed the expression of mir-218 in different liver cancer cell lines |
| 3 Plasmid transfection |
| 4 Western blot test |
| 5 CCK8 assay was used to detect cell proliferation |
| 6 Transwell migration experiment |
| 7 Clone formation experiment |
| 8 Flow detection of apoptosis |
| 9 Immunofluorescence |
| 10 Double luciferase experiment |
| 11 Cell cycle detection |
| 12 Tumor formation in nude mice |
| 13 HE dyed |
| 14 Statistical processing |
| Chapter 2 Bear fruit |
| 1 Expression of mir-218 gene in four hepatocellular carcinoma cell lines |
| 2 Expression of mir-218 and BIRC5 in liver cancer tissues of different stages |
| 3 Expression of mir-218 after transfection with plasmid |
| 4 BIRC5 is the target gene of mir-218 |
| 5 Effect of mir-218 targeting BIRC5 on the cloning ability of HepG2 cells |
| 6 Effect of mir-218 targeting BIRC5 on invasion and metastasis of HepG2 cells |
| 7 Detection of protein level of EMT related markers |
| 8 Effect of mir-218 targeting BIRC5 on proliferation of HepG2 cells |
| 9 Effect of mir-218 targeting BIRC5 on apoptosis of tumor cells |
| 10 Effect of mir-218 targeting BIRC5 on HepG2 cell cycle |
| 11 Mir-218 regulates gsk-3 beta/beta-catenin pathway by down-regulating BIRC5expression |
| 12 Tumor formation in nude mice |
| The three part Discussion |
| Conclusion |
| Reference |
| Literature Review Study on the genetic susceptibility of hepatocellular carcinoma to hepatocellular carcinoma |
| Reference |
（6）HBx上调的LncRNA TRERNA1在促进肝细胞癌进展及预后不良中作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一章 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 细胞系 |
| 1.2 肝癌临床病例组织 |
| 1.3 实验动物 |
| 1.4 菌株及表达质粒载体 |
| 1.5 小干扰RNA |
| 1.6 质粒扩大及培养 |
| 1.7 细胞培养及转染 |
| 1.8 RNA提取,cDNA逆转录及real-time PCR |
| 1.9 引物合成 |
| 1.10 Western blot试剂 |
| 1.11 细胞增殖试剂 |
| 1.12 细胞周期试剂 |
| 1.13 IP(免疫共沉淀) |
| 1.14 RIP(RNA免疫沉淀)试剂 |
| 1.15 ChIP(染色质免疫共沉淀)试剂 |
| 1.16 细胞核质分离试剂 |
| 2.主要耗材和仪器 |
| 3.方法 |
| 3.1 过表达基因及干扰基因表达载体的构建 |
| 3.2 细胞培养及转染 |
| 3.3 肝癌细胞和组织RNA的提取 |
| 3.4 逆转录反应 |
| 3.5 Real time quantitative RT-PCR(qPCR) |
| 3.6 Western blot检测目的基因的蛋白表达 |
| 3.7 细胞划痕法实验 |
| 3.8 Transwell细胞迁移实验 |
| 3.9 Transwell细胞侵袭实验 |
| 3.10 CCK-8(Cell Counting Kit-8)检测细胞增殖能力 |
| 3.11 平板克隆形成实验 |
| 3.12 流式细胞仪检测细胞周期 |
| 3.13 裸鼠皮下成瘤实验 |
| 3.14 体内异种移植裸鼠尾静脉注射转移模型 |
| 3.15 RIP(RNA Immunoprecipitation,RIP)实验 |
| 3.16 ChIP实验 |
| 3.17 核质分离 |
| 3.18 免疫沉淀反应(IP) |
| 第二章 实验结果 |
| 第一节 LncRNA TRERNA1与HBV的 HBx表达水平相关性分析 |
| 引言 |
| 结果 |
| 1.1 HBx诱导HCC细胞中lncRNA的差异表达谱分析 |
| 1.2 HCC细胞中lncRNA TRERNA1 的表达水平受HBx表达影响 |
| 1.3 HCC病例组织中HBx与 TRERNA1 的表达水平呈正相关 |
| 小结 |
| 第二节 高表达TRERNA1 促进HCC细胞侵袭转移能力作用机制的研究 |
| 引言 |
| 结果 |
| 2.1 TRERNA1 的异常高表达与HCC的转移相关 |
| 2.2 体外实验研究TRERNA1 高表达对HCC细胞的迁移和侵袭能力的影响 |
| 2.3 体内实验研究TRERNA1 对裸鼠HCC细胞转移及肝转移结节的形成 |
| 2.4 TRERNA1 负调节肿瘤转移抑制因子CDH1 的表达 |
| 2.5 TRERNA1 通过结合EHMT2 抑制CDH1 的表达 |
| 2.6 TRERNA1 招募EHMT2使CDH1 启动子区发生H3K9 二甲基化 |
| 2.7 TRERNA1 招募EHMT2与SNAI1 形成复合物抑制CDH1 的表达 |
| 2.8 TRERNA1 增强了SNAI促进HCC细胞的转移能力 |
| 2.9 TRERNA1 作为增强子样lncRNA调节SNAI1 的表达 |
| 2.10 HCC中 TRERNA1和CDH1 的表达水平之间呈负相关关系 |
| 2.11 TRERNA1 影响实验小鼠肝脏组织中Cdh1和Snai1 基因的表达水平 |
| 小结 |
| 第三节 TRERNA1 促进HCC细胞增殖能力机制的研究 |
| 引言 |
| 结果 |
| 3.1 高表达TRERNA1的HCC患者预后不良 |
| 3.2 TRERNA1 可能调控的基因与细胞增殖、细胞周期等生物学过程相关 |
| 3.3 TRERNA1 促进了HCC细胞的增殖和克隆形成能力 |
| 3.4 TRERNA1 促进了HCC细胞细胞周期G1/S期的转换 |
| 3.5 TRERNA1 促进了实验裸鼠HCC移植瘤的生长 |
| 3.6 TRERNA1 可能参与了HCC细胞中Raf-MAPK信号通路的激活 |
| 小结 |
| 第四节 TRERNA1 的高表达影响了HCC细胞对索拉非尼治疗敏感性 |
| 引言 |
| 结果 |
| 4.1 TRERNA1 影响HCC细胞中索拉菲尼的敏感性 |
| 4.2 受 HBx调控的高表达的TRERNA1 降低了索拉非尼对HCC细胞的敏感性 |
| 4.3 TRERNA1 促进了Raf-MEK-ERK的磷酸化信号通路的激活 |
| 小结 |
| 第三章 全文讨论 |
| 存在的问题与今后的展望 |
| 结论 |
| 第四章 文献综述 长链非编码RNA 肝癌中的研究动态及诊疗意义 |
| 前言 |
| 1. 长链非编码RNA的简介 |
| 2. LncRNA发挥功能的研究 |
| 3. LncRNA参与调控机制的研究 |
| 4. HCC中的LncRNA |
| 5. LncRNA在肝癌临床中的应用价值 |
| 6. 前景与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表研究论文情况 |
（7）RNF5促进肝细胞癌增殖及侵袭转移的研究（论文提纲范文）
| 英文缩略表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 原发性肝癌 |
| 1.1.1 原发性肝癌的研究概况 |
| 1.1.2 原发肝癌发生发展分子机制研究及进展 |
| 1.2 RNF-5 |
| 1.2.1 RNF5基因的基本结构 |
| 1.2.2 生物学功能 |
| 1.2.3 RNF5与相关疾病 |
| 1.2.4 RNF5与肿瘤 |
| 1.3 本研究目的、内容、意义 |
| 第二章 RNF5在肝癌内高表达与病人恶性预后密切相关 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 主要仪器设备 |
| 2.2.2 主要试剂材料 |
| 2.2.3 病理组织标本 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 qPCR引物的设计与合成 |
| 2.3.2 组织RNA抽提 |
| 2.3.3 提取的RNA浓度和纯度检测 |
| 2.3.4 cDNA合成 |
| 2.3.5 RT-PCR扩增实验 |
| 2.3.6 免疫组化技术(Immunohistochemistry,IHC) |
| 2.3.7 HE染色,苏木精-伊红染色法 |
| 2.3.8 HE及免疫组化结果判定方法及标准 |
| 2.3.9 病例随访 |
| 2.3.10 统计学分析方法 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 RNA提取及质控 |
| 2.4.2 肝癌及癌旁组织标本中RNF5在mRNA水平上的表达 |
| 2.4.3 肝癌及癌旁组织中RNF5蛋白表达水平的检测 |
| 2.4.4 肝癌组织中RNF5表达水平与临床病理指标相关性分析 |
| 2.4.5 肝癌组织中RNF5的表达与肝癌患者预后的关系 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 RNF5促进肝癌细胞增殖及侵袭转移 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 主要仪器设备 |
| 3.2.2 主要试剂材料 |
| 3.2.3 菌株和质粒载体 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 RNF5敲低肝癌细胞系的构建 |
| 3.3.2 RNF5过表达肝癌细胞系的构建 |
| 3.3.3 蛋白质免疫印迹 |
| 3.3.4 CCK8 细胞增殖实验 |
| 3.3.5 克隆形成实验 |
| 3.3.6 Transwell迁移和侵袭实验 |
| 3.3.7 感染人乙肝病毒实验树鼩动物模型的建立 |
| 3.3.8 大鼠肝纤维化模型的建立 |
| 3.3.9 裸鼠成瘤实验 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 体外实验中RNF5促进肝癌细胞增殖、迁移及侵袭 |
| 3.4.2 RNF5抑制细胞凋亡 |
| 3.4.3 RNF5表达与乙肝病毒感染 |
| 3.4.4 RNF5与肝纤维化 |
| 3.4.5 RFN5可能通过作用于ATP1A1发挥其功能调节 |
| 3.4.6 体内实验中RNF5促进肝癌细胞增殖 |
| 3.5 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 泛素化连接酶RNF5与肝癌研究综述 |
| 参考文献 |
（8）LncRNA H19通过miR-15b/CDC42信号轴调控肝癌生物学行为及EMT进程的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 lncRNA H19、miR-15b和CDC42在人肝癌组织、细胞株中的表达情况 |
| 引言 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 lncRNA H19、miR-15b与CDC42之间调控关系分析 |
| 引言 |
| 材料 |
| 方法 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 lncRNA H19/miR-15b/CDC42信号轴对肝癌细胞生物学行为的影响 |
| 引言 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 H19通过miR-15b/CDC42信号轴调控肝癌细胞EMT进程的初步研究 |
| 引言 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 小结 |
| 综述 长链非编码RNA在肝癌中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 英文缩写注释表 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（9）PRIM1在肝细胞癌中的作用及临床意义研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 附技术路线 |
| 第一章 生物信息学分析获得PRIM1基因信息 |
| 1. 方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 设计PRIM1干扰靶点基因及慢病毒包装获得干扰质粒 |
| 一、目的基因RNAi干扰慢病毒载体制备 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 二、慢病毒包装及质量检测 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 干扰BEL-7404、SMMC-771肝细胞癌细胞中PRIM1基因表达,鉴定肝细胞癌细胞增殖情况 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 Affymetrix表达谱芯片制备及PRIM1下游基因表达检测 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 中英文缩写词表 |
| 在职博士研究生期间论文发表情况 |
| 致谢 |
（10）uPA及V-ATPase在肝细胞癌的表达及其与浸润转移的关系（论文提纲范文）
| 一、英文缩写一览表 |
| 二、论文摘要 |
| 1.中文摘要 |
| 2.英文摘要 |
| 三、论文正文 |
| 前言 |
| 第一部分 uPA、MMP-9、V-ATPase在肝癌组织中表达的研究 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 第二部分 uPA与肝癌转移关系的研究 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 第三部分 V-ATPase与肝癌转移关系的研究 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 全文讨论 |
| 全文总结 |
| 本研究的创新点及展望 |
| 参考文献 |
| 四、文献综述 |
| 五、攻博期间发表论文 |
| 六、致谢 |
四、中国启东地区肝癌细胞凋亡相关基因的克隆、表达及其与肝癌相关性研究(英文)（论文参考文献）
- [1]第一部分：AHR介导黄曲霉毒素B1在肝细胞癌中的毒性研究 第二部分：靶向测序对多种EBV感染相关恶性肿瘤中EBV整合位点分析研究[D]. 朱青. 北京协和医学院, 2021
- [2]LINC13及ACTR分别调控氧化应激及糖酵解介导肝癌耐药的机制研究[D]. 马路园. 河北医科大学, 2021(02)
- [3]circ＿0027089通过miR-136-5p/NACC1轴调控乙型肝炎病毒相关肝癌的进程[D]. 李彬. 中国医科大学, 2021(02)
- [4]松花粉诱导人肝癌细胞株SK-Hep-1细胞增殖、凋亡和自噬及其机制研究[D]. 李北林. 右江民族医学院, 2020(04)
- [5]BIRC5基因型在肝癌中的分布及miR-218靶向BIRC5对肝癌细胞侵袭能力影响的分子机制研究[D]. 骆诤. 山东大学, 2019(03)
- [6]HBx上调的LncRNA TRERNA1在促进肝细胞癌进展及预后不良中作用机制研究[D]. 宋伟. 东南大学, 2019
- [7]RNF5促进肝细胞癌增殖及侵袭转移的研究[D]. 张义. 福建医科大学, 2019(02)
- [8]LncRNA H19通过miR-15b/CDC42信号轴调控肝癌生物学行为及EMT进程的实验研究[D]. 周勇. 苏州大学, 2019(04)
- [9]PRIM1在肝细胞癌中的作用及临床意义研究[D]. 卢海. 南方医科大学, 2018
- [10]uPA及V-ATPase在肝细胞癌的表达及其与浸润转移的关系[D]. 廖芝玲. 广西医科大学, 2007(10)