一、腺病毒绿色荧光表达载体追踪皮肤组织工程种子细胞的转归（论文文献综述）
黄德清,Gary Balian[1]（2013）在《活体生物发光成像追踪大鼠跟腱内移植干细胞》文中进行了进一步梳理背景:移植脂肪源干细胞在活体内的归巢、迁移、增殖和分化的机制仍未得到充分阐明。活体生物发光活体成像技术是近来发展起来的一种可以直接检测活细胞在动物体内生物学行为的新的技术方法。目的:探讨用活体生物发光成像技术检测大鼠跟腱内移植的经荧光基因修饰的脂肪源干细胞可行性。方法:分离培养大鼠腹腔来源的脂肪源干细胞,用浓度为3×1010L-1携带虫荧光素酶的腺病毒载体对其进行转染,观察转染对脂肪源干细胞的影响;将转染的脂肪源干细胞移植到大鼠跟腱缺损处,移植后1,4,7,14d用活体生物发光成像技术检测移植脂肪源干细胞荧光素酶的表达,移植后28d跟腱标本冰冻切片在荧光显微镜下观察。结果与结论:在体外,腺病毒转染对脂肪源干细胞的生长和增殖无明显影响（P>0.05）。细胞移植后1,4,7,14d,活体生物发光成像技术在实验侧修复段跟腱检测到的荧光表达强度分别为（1.22±0.43）×106、（1.81±0.76）×106、（1.88±0.69）×106和（0.89±0.26）×105光子/s（n=6）。而对照侧跟腱修复段未检测到荧光表达;移植后28d,实验侧跟腱冰冻切片在荧光显微镜下见到大量表达荧光的细胞。表明活体生物发光成像技术可成功追踪大鼠跟腱内移植的经荧光基因修饰的脂肪源干细胞。脂肪源干细胞有望成为肌腱组织工程的种子细胞。
廖云君[2]（2011）在《应用去分化脂肪细胞构建工程化脂肪组织的实验研究》文中提出背景及目的随着整复重建外科的发展,自体组织移植及人工材料替代修复软组织缺损成为重要的治疗手段,尽管这能有效地改善受区的组织缺损状况,但自体移植物的来源十分有限,又常受到血供及其供区的继发畸形的限制,游离脂肪移植的自体吸收率较高,人工材料易产生排斥反应等,故目前这些方法的治疗效果均不是十分理想,难以完全满足临床的需要。组织工程技术的出现为临床上更好的解决组织缺损等难题提供了一个新的思路。近年来,组织工程技术能以少量种子细胞,经体外扩增后与生物材料复合,修复较大的组织或器官缺损,重建生理功能,为真正实现无损伤修复组织缺损和真正意义上的形态、结构与功能重建开辟了新的途径。组织工程学的发展需要几个必备的因素,即：（1）可获得的种子细胞,并能控制其生长和组织形成；（2）结构精确的三维支架,以适合再造需要的组织量和形状,而且与细胞具有良好的组织相容性；（3）适宜的微环境,能提供充分的血供和营养,维持细胞增殖和组织功能。近年来,人脂肪组织来源的干细胞（Adipose derived stem cells, ASCs）成为当今干细胞研究领域的一大热点。但ASCs是位于人脂肪组织内的一个混杂细胞群体。只有大约40%的细胞能向脂肪细胞分化。因此,ASCs并不能完全满足脂肪组织工程的发展需要。故寻找一种分离容易、增殖能力强、成脂分化率高的更优秀的种子细胞仍然是研究热点。脂肪组织内含有多种不同的细胞,主要有成熟脂肪细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞、组织细胞和干细胞等。大量的脂质聚集使脂肪细胞具有的漂浮性,导致细胞难于体外培养,因此对该细胞的特性研究很少。脂肪细胞由此被认为是处于分化终末期,缺乏增殖能力的一种细胞。有研究表明,成熟脂肪细胞在体外培养的过程中,能脱去脂滴,重新启动增殖机制,开始分裂增生。我们把这种生理转变称之为脂肪细胞去分化。脂肪细胞去分化将开创细胞生理学一个令人惊喜的领域,改变人们对于组织再生能力的许多观点。然而,关于去分化脂肪细胞（dedifferentiate adipocyte, DA）的细胞生物学特性研究还很少。前期研究证实DA在体外定向诱导培养下具有向成脂、成骨、成软骨分化等多向分化能力,且较之ASCs有更高的成脂能力。因此,DA有可能成为脂肪组织工程更具前景的种子细胞来源。组织工程常用的支架材料分为天然材料和人工合成材料,天然材料包括：天然多糖类材料有纤维素、甲壳素、透明质酸等；天然蛋白质类材料有胶原和纤维蛋白等；人工合成的材料有聚乳酸（PLA）、聚乙醇酸（PGA）或两者聚合物聚乳酸-聚乙醇酸（PLGA）、聚四氟乙烯、羟基磷灰石、聚乙烯醇、海藻酸盐等。依据他们各自特点,被不同程度地应用于组织工程的研究。由于应用脂肪细胞组织工程技术修复软组织缺损近期才引起学者们的关注,故而用于构建脂肪组织工程有效的生物材料支架研究不多,目前常用的有可降解的多孔泡沫,如PLGA、透明质酸、膨体聚四氟乙烯等,然而,究竟何种材料能成为脂肪组织工程种子细胞的理想载体尚不十分明确,如果能找出最适合构建工程化脂肪的支架材料,将能大大促进脂肪组织工程的研究。本实验拟研究人DA向脂肪细胞、成骨细胞体外定向诱导分化中相关基因表达,同时判断种子细胞与Ⅰ型固态胶原支架及纤维蛋白胶可注射支架复合后在体内构建组织工程化脂肪组织的可能性,以寻找适宜的脂肪组织工程种子细胞载体,探索构建组织工程化脂肪组织的有效方法；另外,对DA进行AD、EGFP体外荧光标记,观察该标记物对细胞生物性状的影响,为种子细胞研究寻找理想的细胞标记方法。方法1、DA、ASCs的分离、培养及检测自成人吸脂术后抽吸物提取成熟脂肪细胞及ASCs,天花板贴壁培养法诱导成熟脂肪细胞去分化,观察细胞形态变化,获得DA。同时对细胞进行体外定向成脂、成骨诱导分化,并以油红0染色、茜素红染色进行鉴定。Real-time PCR分析细胞内PPARγ、C/EBPα、C/EBPβ、Leptin、LPL、RUNX2、SOX9的表达水平。2.Ad.EGFP转染并标记DAAd.EGFP按不同感染复数（multiphcity of infection, MOI）值（MOI=0,10,20,30,50,100）体外转染DA,进行EGFP荧光标记,倒置显微镜及荧光显微镜观察细胞生长情况及传代后荧光强度的变化；测定腺病毒转染DA的效率；油红0染色检测细胞标记后成脂能力。使用MTT比色分析法检测标记前后细胞的增殖情况,同时将培养细胞上清液进行乳酸脱氢酶（LDH）含量测定,检测Ad.EGFP对细胞的毒性。3、DA与海绵状Ⅰ型胶原蛋白、纤维蛋白胶生物相容性的检测将标记后的DA分别与Ⅰ型胶原蛋白海绵支架、纤维蛋白胶体外联合培养,测定细胞在支架上的黏附率,相差显微镜及电子显微镜动态观察细胞在支架上黏附、伸展、生长和增殖情况；使用台盼蓝拒染法检测细胞活力,油红0染色检测细胞复合支架后成脂能力。4、体内工程化脂肪组织的构建将Ⅰ型胶原支架与纤维蛋白胶可注射支架分别与GFP标记的成脂诱导后DA或ASCs混合,设空白支架为对照组,同体双侧植入裸鼠背部皮下,12周后取出植入物。进行组织工程新生物大体观察和湿重测定后荧光显微镜观察大体组织标本,最后组织学检测、HE染色定性。血管计数法检测新生物血管密度。结果1.分离培养的DA形态类似于成纤维细胞,具有很强的增殖及多向分化能力。在脂肪、成骨分化诱导培养基的作用下,分化出成熟的脂肪细胞和成骨细胞,油红0、茜素红染色阳性。细胞诱导分化前,DA内PPARγ、C/EBPβ的表达高于ASCs,而RUNX2.SOX9的表达低于ASCs.细胞成脂诱导后,DA内PPARγ、C/EBPα、C/EBPβ、Leptin、LPL的基因表达始终高于ASCs,增加的幅度更大；而成骨诱导后,ASCs内RUNX2的表达水平始终高于DA。2.Ad.EGFP可成功进入DA。24h可见绿色荧光,5d荧光表达强度明显较高,DA传代后仍有强荧光表达。转染DA后,不影响其增殖活性。MOI为0、10、20、30、50、100时转染率分别为0%、11.3%、28.5%、43.7%、95.8%、96.3%。细胞标记后不影响向脂肪细胞分化的能力。3.DA可以在海绵状Ⅰ型胶原蛋白支架、纤维蛋白胶支架上生长并逐渐黏附,细胞与不同的支架混合,细胞在支架上的黏附率也不同：DA在海绵状Ⅰ型胶原蛋白支架组（n=6）的细胞黏附率为77.67%±3.33%；DA在纤维蛋白胶组（n=6）的细胞黏附率为91.83%±2.79%,两组采用独立样本t检验比较差异有统计学意义（t=7.996,P<0.001）。而DA在海绵状Ⅰ型胶原蛋白支架组（n=6）的细胞成脂分化率为63.0%±3.0%；DA在纤维蛋白胶组（n=6）的细胞成脂分化率为63.2%±3.3%,两组采用独立样本t检验比较无显着性差异（t=0.091,P=0.929）。DA与支架混合培养后不影响细胞的形态、生长增殖状况,细胞与支架复合后不影响向脂肪细胞分化的能力。4.术后12w取材发现,DA-胶原蛋白组、ASCs-胶原蛋白组、DA-纤维蛋白胶组、ASCs-纤维蛋白胶组于移植物包埋区均可观察到新生组织形成；空白对照组（完全培养基-胶原支架组、完全培养基-纤维蛋白胶组）均未见新生组织形成。DA-胶原蛋白组（n=6）新生组织平均湿重为0.0728±0.0184g；ASCs-胶原蛋白组（n=6）新生组织平均湿重为0.0732±0.0198g；DA-纤维蛋白胶组（n=6）新生组织平均湿重为0.1109±0.0020g, ASCs-纤维蛋白胶组（n=6）新生组织平均湿重为0.1080±0.0028g。DA-胶原蛋白组与ASCs-胶原蛋白组、DA-纤维蛋白胶组与ASCs-纤维蛋白胶组之间湿重比较,无显着性差异（均为P>0.05）。HE染色证实新生组织均为成熟脂肪组织,支架已完全吸收降解；免疫荧光染色阳性证实新生组织为外源性。各组新生微血管密度分别为：DA-胶原蛋白组11.22±2.53;ASCs-胶原蛋白组15.22±2.39；DA-纤维蛋白胶组10.72±2.42:ASCs-纤维蛋白胶组15.00±2.54。DA-胶原蛋白组与ASCs-胶原蛋白组、DA-纤维蛋白胶组与ASCs-纤维蛋白胶组之间微血管密度比较,差异有统计学意义（P均<0.05）。各组新生物纤维化程度分别为：DA-胶原蛋白组24.90%±0.49%；ASCs-胶原蛋白组25.10%±0.73%;DA-纤维蛋白胶组25.00%±0.75%；ASCs纤维蛋白胶组24.70%±0.72%。DA-胶原蛋白组与ASCs-胶原蛋白组、DA-纤维蛋白胶组与ASCs-纤维蛋白胶组之间纤维化程度比较,无显着性差异（均为P>0.05）。在体内,DA表达内皮细胞表面标记——CD31,参与血管的形成。讨论种子细胞是构建组织工程脂肪核心问题之一。在脂肪组织中成熟脂肪细胞已被证实能去分化为DA, DA具有强增殖能力,多向分化能力,高成脂分化率。本实验从人脂肪组织成功获取脂肪细胞,天花板贴壁培养诱导去分化获得DA。DA作为种子细胞与其他细胞相比具有相当的优越性,该细胞来源广泛、取材容易,大量获取,高成脂分化率。组织工程另一核心内容是寻找具有组织再生潜力的支架材料。在生物材料方面,已开发和研制了适用于不同组织构建的生物支架材料。各类材料都具有各自的优点和缺点,而胶原蛋白在组织工程构建中作为支架材料的效果已被肯定。在这个实验中,显示胶原蛋白作为支架材料与ASCs有良好的相容性及黏附性,对细胞无毒性,不影响细胞增殖。同时,细胞标记一直是困扰组织工程技术修复机制研究的一大难题,其在干细胞来源的种子细胞的缺损修复研究中尤为重要。寻找一种直观、长期稳定,同时不影响细胞组织形成能力的标记方法非常重要。在本实验中,EGFP对DA成功进行了标记,且具有上述优点。在这个实验中,脂肪分化诱导后的DA与ASCs一样,与Ⅰ型胶原、或纤维蛋白胶支架混合培养后能在裸鼠皮下新生结构功能完整的脂肪组织块。该研究提示,DA作为种子细胞的确可以应用于脂肪组织的组织工程研究,并且能合成具有三维结构及功能的脂肪组织。结论1、本实验成功地从人皮下脂肪组织中诱导培养出DA,建立了一整套有关DA分离、培养和鉴定的较简便的方法。DA具有很强的增殖和自我更新能力,具有向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞分化的潜能,尤其是高成脂分化力。DA来源丰富、取材容易,创伤小,是理想的组织工程种子细胞,具有广阔的应用前景。2、腺病毒是较好的基因载体,是一个高效、安全快捷的基因修饰操作系统,EGFP在DA中能持续稳定表达,将为基因治疗和细胞示踪提供有效的实验方法。EGFP对细胞无毒副作用,安全性高,对细胞的生长增殖及成脂分化无明显影响。3、DA可以在海绵状Ⅰ型胶原蛋白、纤维蛋白胶支架上逐渐黏附,细胞黏附率高,生长、增殖良好。支架对细胞无毒性反应。海绵状Ⅰ型胶原蛋白、纤维蛋白胶材料与DA之间具有良好的生物相容性。4、以胶原蛋白和可注射型纤维蛋白胶为支架材料,复合体外培养的人DA,能在体内成功构建成熟的脂肪组织块,并证实细胞参与血管内皮的构成。该研究提示,DA也能为将来软组织缺损的组织工程修复提供重要的种子细胞来源,并为体内研究脂肪细胞的生长代谢提供了研究模型。
江汕[3]（2010）在《组织工程骨原位构建修复股骨缺损的示踪研究》文中认为研究背景骨组织工程的研究具有广阔的临床应用和产业化开发前景。然而,长期以来,对于组织工程骨及其相关组织的体内构建过程和机制缺乏客观深入的了解,严重制约着骨组织工程在临床骨缺损尤其是大段负重骨缺损修复方面的应用。骨组织工程的基本含义是指将种子细胞、合成材料或处理过的天然材料、细胞因子和基因治疗综合应用于体内的骨组织重建。其中,种子细胞是构建有活力的具备生理替代作用骨组织的基础,是组织工程骨体内外研究和临床应用的重要前提。同时,宿主自身的细胞、血管、神经及其它成份也在组织工程骨的构建过程中发挥着重要的作用——如何准确地识别这些细胞,并在体内外追踪不同细胞的分布、生长、增殖、分化和迁移等情况,对于我们研究骨组织工程的相关机制、优化临床构建理念和构建模式具有十分重要的意义。针对缺乏明确标志的各种细胞,以绿色荧光蛋白基因（GFP）或红色荧光蛋白基因（RFP）等报告基因加以修饰后,就可以在体内外有效分辨单个荧光基因修饰的细胞甚至亚细胞结构,这目前在软组织的示踪研究中十分常用。然而,骨组织或含钙生物材料由于透光性差、坚硬和／或脆性大的特性,各种常规的观测方法难以有效、准确、直观地分辨和研究骨组织或材料内部的荧光蛋白基因修饰的细胞。对此,国内外目前尚缺乏成熟的研究方案。因此,对组织工程骨原位构建修复大段骨缺损进行示踪研究,是至关重要而又极富挑战性的课题。研究目的1.通过基因修饰技术获得长期、稳定、安全表达荧光的兔骨髓间充质干细胞；2.通过两种荧光蛋白报告基因对种子细胞和宿主血管神经组织的分别修饰,探讨原位构建血管神经化组织工程骨修复股骨缺损的作用机制；3.通过两种荧光蛋白转基因小鼠对原位构建组织工程骨修复股骨大段骨缺损进行示踪研究。研究内容第一部分慢病毒载体介导的荧光蛋白报告基因对兔骨髓间充质干细胞的修饰[方法]①生产携带mRFP和eGFP基因的重组慢病毒载体（LV）,测定病毒滴度；②以LV-mRFP和LV-eGFP对兔骨髓间充质干细胞（rBMSC）进行基因修饰,观察长期体外培养后rBMSC-mRFP和rBMSC-eGFP细胞的荧光基因表达的情况；③探讨基因修饰对于rBMSC-mRFP增殖与分化功能的影响。[结果]①LV-mRFP的滴度均值为5.2×10e6 TU/mL （n=5）,流式细胞仪检测转染后rBMSC-mRFP的阳性百分比均值为81.1%（n=5）,体外传25代（24w）后,rBMSC-mRFP的阳性百分比均值为35.4%（n=5）;②LV-eGFP的滴度均值达4.6×10e6 TU/mL （n=5）,流式细胞仪检测转染后rBMSC-eGFP的阳性百分比均值为93.3%（n=5）,体外传25代（24w）后,rBMSC-eGFP的阳性百分比均值为85.5%（n=5）;③rBMSC-mRFP和野生型rBMSC的增殖曲线在各检测时间点均无显着差异,时间和组别的交互效应也不显着（F时间×分组=2.550,P时间×分组=0.092）；④rBMSC-mRFP能够分别经成骨、成软骨和成脂诱导而出现多向分化；⑤由于缺乏特异性抗兔的流式抗体,无法用流式细胞术确定rBMSCs的细胞表面标志。[小结]本部分实验获得了携带荧光蛋白报告基因的LV-eGFP和LV-mRFP,高效转染rBMSCs后获得的rBMSC-eGFP和rBMSC-mRFP可以长期稳定表达荧光；mRFP基因的修饰对rBMSC-mRFP的增殖活性和多向分化潜能未产生明显影响。第二部分双重荧光蛋白报告基因示踪血管神经化组织工程骨的体内构建[方法]①将rBMSC-mRFP细胞复合于圆柱体p-磷酸三钙（β-TCP）生物材料中（直径8 mm×高15 mm,一侧有纵行侧槽,法国Bio-lu公司）,体外培养7d后用于体内实验；②以MTT、细胞计数和半固体脱钙等技术构成的研究体系,比较负压吸附法和MagIC法两种细胞接种方法的效果；③批量生产的LV-eGFP,超高速离心浓缩后,用于体内实验,测定病毒滴度的变化；④原位构建血管神经化的组织工程骨：手术制备兔股骨15mm大段骨与骨膜缺损,骨缺损局部植入以MagIC法接种的rBMSC-mRFP与P-TCP支架的复合物,六孔微型钢板和螺钉固定；局部分离出股动静脉束及其伴行的隐神经,以浓缩后的LV-eGFP原位注射感染后,将隐神经和股动静脉束植入生物支架材料的侧槽内；⑤术后4w、8w、12w和24w,分别以X线摄片、冰冻切片观察、组织学特殊染色、定量PCR等方法探讨骨缺损修复的机制。[结果]①MagIC法与负压吸附法相比,可以将更多的rBMSC-mRFP细胞植入β-TCP材料,两种方法复合细胞的材料以MTT法检测,其OD值分别为（2.96±0.06）vs（1.01±0.02）,差异有统计学意义（t=52.695,P=0.000）；以细胞计数法计数材料吸附细胞的数目,分别为（4.17±0.15）vs（1.37±0.15）,差异有统计学意义（t=22.450,P=0.000）；以荧光倒置显微镜、扫描电镜、半固体脱钙+激光扫描共聚焦显微镜等技术证实,MagIC法可使细胞更有效地分布于材料之中。②-80℃冻存的病毒,解冻后的病毒滴度平均为冻存前的56.3%（n=5）；浓缩前和浓缩后的病毒滴度均值分别为3.0×10e6 TU/mL （n=5）和220×10e6TU/mL （n=5）, LV-eGFP经浓缩后病毒滴度提高了73.3倍。③不同时间点X线摄片显示,术后8w材料开始降解,骨痂明显增多；术后12w骨缺损区出现愈合；术后24w时出现髓腔再通迹象。④各时间点取材的冰冻切片显示,材料球孔中的红色荧光细胞逐渐增多；术后8w球孔之间形成大量红色荧光的胶原纤维相互沟通；术后12w部分球孔逐渐融合,形成不规则片状或条索状,新生软骨中可见大量红色荧光细胞；术后24w新生骨中有大量骨基质样物质沉积,红色荧光的成骨细胞沿新生骨周边排列,红色荧光的骨细胞环绕中央的小血管呈同心圆状排列；随着骨质的成熟,荧光逐渐减弱至消失。球孔内及骨基质中可见较多呈红色荧光的细小血管；骨髓腔内可见伴行的动静脉束呈绿色荧光,脂肪组织呈现红绿荧光交织现象；在材料与周边组织的连接处,较大的血管神经束呈现明亮的绿色荧光；软骨内成骨的局部可见少量绿色荧光的神经纤维。MASSON染色、银染以及HE染色进一步验证了荧光下所见的组织。⑤定量PCR分析显示,在组织工程骨中间、组织工程骨两端和进材料血管神经束三个部位的组织中,mRFP基因表达分别为0.465±0.110、0.034±0.029和0.097±0.010,差异有统计学意义（F=43.641, P=0.000）; eGFP基因表达分别为0.003±0.001、0.003±0.002和0.026±0.009,差异有统计学意义（F=4.199, P=0.028）; VEGF表达分别为14.095±2.887、9.422±0.815和13.851±1.310,差异有统计学意义（F=8.728, P=0.003）。CGRP和CGRP-R的表达在组织工程骨中间>组织工程骨两端>进材料血管神经束,差异有统计学意义（P≤0.002）; NK-R和VIP-R的表达具有类似趋势,差异有统计学意义（P≤0.014）。NPY和NPY-R在各组之间的表达差异无统计学意义（P>0.05）。[小结]本部分实验通过系列技术建立了荧光辅助示踪骨组织工程研究体系（fluorescence aided tracer of tissue engineered bone, FATTEB）,该研究体系可在体内外对组织工程骨的构建进行客观、微观的研究。通过本部分的实验发现,种子细胞（rBMSC）的增殖分化与新生组织工程骨的成软骨、成骨、骨皮质内血管的形成、骨髓腔内细胞的来源密切相关；宿主自身植入材料的血管神经束不仅分布于侧槽中,还分支长入了新生的骨髓腔内,并有部分神经纤维分布于软骨内成骨的组织内；骨髓腔内的脂肪成份可以分别来源于rBMSC的分化或植入血管束周围附带的脂肪；种子细胞和外源血管共同构建了组织工程骨内的血管网。定量PCR结果提示组织工程骨构建过程中新生骨的不同部位,两种荧光蛋白报告基因修饰的细胞根据其分布及功能的不同而发生增殖、分化和迁移,血管新生和神经作用的相关基因在组织工程骨的成骨局部表达旺盛。第三部分利用eGFP和mRFP荧光蛋白转基因小鼠原位构建组织工程骨的初步示踪研究[方法]①FVB种系的eGFP转基因雌性小鼠,无菌获取双侧股骨骨髓细胞,以全骨髓贴壁培养法,采用小鼠间充质干细胞专用条件培养基培养细胞,3w后获得小鼠BMSC （eGFP-mBMSC）;②将5×10e6的eGFP-mBMSC以MagIC法复合于圆柱型β-TCP材料（直径3mmx长5mm,自行制备纵行侧槽,法国Bio-lu公司）,常规体外培养7d后用于体内实验；③FVB种系mRFP转基因雄性小鼠,以无菌1.5%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后,术侧下肢备皮,显微手术暴露该侧股骨,制备5mm股骨中段骨与骨膜缺损,以23G无菌注射器针头作为“髓内钉”进行内固定,观察术后小鼠大段骨与骨膜缺损模型的自身愈合情况及内固定的稳定情况。④同法制备上述小鼠骨缺损模型,然后在骨缺损处植入负载eGFP-mBMSC的β-TCP支架材料,并用丝线将材料经侧槽固定在内固定上,术后4w、8w、12w摄X线片观察小鼠的骨骼愈合情况；⑤小鼠灌注固定：以10%水合氯醛按1g/kg的剂量经腹腔麻醉小鼠,开胸,在心脏搏动状态下将导管插入主动脉内,固定导管后,剪开左心耳,依次以37℃生理盐水、37℃的4%多聚甲醛和4℃的4%多聚甲醛（pH=7.4,下同）灌注固定小鼠；取小鼠术侧股骨等组织,于4%多聚甲醛中后固定,制备冰冻切片观察；⑥定量PCR组织取材：新鲜获取mRFP小鼠原位构建的组织工程骨局部少量组织,以液氮冷冻碾碎后以Trizol法抽提mRNA,通过定量PCR检测eGFP基因。[结果]①eGFP-mBMSC与β-TCP支架材料体外复合良好,细胞增殖旺盛。②术后4个月,FVB种系mRFP转基因小鼠的5mm大段骨与骨膜缺损不能自行愈合,所用的内固定方式稳定可靠。③术后12w骨缺损区出现愈合,可见材料逐渐降解。④术后12w取材大体标本可见骨缺损区已出现完整的骨皮质；冰冻切片显示,中央残存的材料孔隙中布满细胞及胶原组织,部分孔隙已开始成骨。材料近骨髓腔一侧已有较成熟的骨皮质形成,并有大量骨性胶原深入到材料的孔隙中；材料远离骨髓腔的一侧,外周有少量肌肉及纤维组织包裹。新生软骨与新生骨中可见,红绿荧光的细胞和组织交织存在；材料中央的球孔内见到大量细胞增殖,孔壁增厚,细胞分别带有绿色荧光或红色荧光,部分细胞相互融合生长（呈现棕红色或黄色荧光）,球孔中央出现红色荧光的小血管；局部新生的骨髓腔内可见大量绿色荧光的骨髓细胞成份,其中生长少量红色荧光细胞;组织工程骨内胶原增生,呈现红色荧光,胶原中散布绿色梭形或多形性荧光细胞；组织工程骨周围可见红绿荧光细胞交织形成的血管壁和肌肉组织。⑤定量PCR分析显示,在组织工程骨中间、组织工程骨两端和术侧股骨肌肉三个部位组织中,eGFP/ABL基因的表达分别为：0.436±0.036、0.140±0.038和0.098±0.024,具有显着差异（P=0.000）,与荧光显微镜下观察的结果相一致。[小结]本部分实验分别以两种荧光蛋白转基因小鼠作为动物模型和种子细胞的来源,可以排除病毒介导基因转染效率和感染靶向性等因素对研究结果的干扰,更全面、客观和便捷地对组织工程骨原位修复骨缺损进行示踪研究和机制探讨。荧光蛋白转基因小鼠股骨大段骨缺损（5mm）及稳定内固定动物模型的制备,为后续进行组织工程骨原位修复的相关研究奠定了基础。本部分的研究结果初步提示：种子细胞和宿主自身的细胞组织共同参与了新生组织工程骨的形成,eGFP-mBMSC植入体内后不仅分化为软骨细胞和成骨细胞,还向肌肉、血管等组织出现多向分化。结论和展望本课题的研究初步建立了一整套从体外种子细胞与支架材料的复合到体内血管神经化组织工程骨原位构建修复大段骨缺损的荧光示踪研究体系（FATTEB）。有利于客观、微观地研究体内外组织工程骨的构建进程,为进一步探索骨组织工程的相关机制,优化组织工程骨的构建理念和构建模式提供了一个良好的研究平台。本研究建立起的MagIC接种法有助于种子细胞与多孔支架材料的体外复合,进而有利于组织工程骨的体内成骨；半固体脱钙技术有助于示踪研究体外种子细胞与支架材料的复合情况,并对体内组织工程骨早期构建的示踪研究具有应用前景；定量PCR方法的应用,为组织工程骨中各种基因的表达提供了一种敏感、有效、精确的检测手段；荧光蛋白转基因小鼠股骨大段骨缺损（5mm）及稳定内固定动物模型的制备,为后续进行组织工程骨原位修复的相关研究奠定了基础。示踪研究的初步结果提示种子细胞和宿主自身的细胞组织共同参与了组织工程骨及其相关组织的构建,在不同组织中的分布则各有侧重并呈现一定的规律性。未来的组织工程骨作为人体的一个替代性组织,必然需要与人体全身的机械运动、循环、神经和内分泌等体内大环境相协调。所以,本课题目前的研究成果在有关成骨和血管神经化问题的探讨方面,还具有进一步向纵深发展的研究空间。荧光蛋白转基因动物体内组织工程骨的原位构建研究,如果能选择更大型的、负重骨条件更接近人体的动物模型进行深入的机制研究,则必将对骨组织工程的临床应用产生深远的影响。
金玲[4]（2009）在《慢病毒载体介导hTERT基因修饰的人羊膜上皮细胞重建角膜表层的实验研究》文中研究表明组织工程化角膜上皮需要合适的种子细胞,人羊膜上皮细胞（human amnioticepithelium cells,hAECs）容易获得、取材方便,在伦理问题上也不存在任何争议,经研究发现hAECs具有类似胚胎干细胞或多能干细胞的多向分化潜能,在不同生长因子和微环境调控下能分化成多种不同组织的细胞,其极可能诱导分化成角膜上皮细胞。因此,hAECs可能是组织工程角膜上皮一种新的细胞来源。但是由于hAECs属于终末分化细胞,体外生存期短、培养困难,限制了其广泛应用。有鉴于此,本研究利用慢病毒载体携带目的基因人端粒酶催化亚基（hTERT）和标记基因增强型绿色荧光蛋白（EGFP）组成的融合基因转染hAECs,使其生长周期延长甚至达到永生化,然后应用转基因hAECs构建复层上皮细胞-角膜基质移植材料重建角膜表层,探讨转基因hAECs做为组织工程化角膜表层一种新的细胞来源的应用价值。第一部分人羊膜上皮细胞（hAECs）的体外培养和其生物学鉴定目的:研究人羊膜上皮细胞（hAECs）体外培养的生物学特性,探讨hAECs体外培养的方法及其干细胞特性,为基因转染hAECs并进行角膜表层重建奠定实验基础。方法:1采用酶消化法体外分离培养hAECs,观察细胞在体外培养条件下的生长情况,并对生长良好的原代细胞进行消化传代,在光镜下对细胞进行形态学观察和HE染色观察;2对传代的hAECs进行细胞角蛋白CK7、CK8和CK18免疫组化染色鉴定及免疫荧光检测hAECs中干细胞转录因子OCT-4的表达;3对传代的hAECs进行流式细胞仪检测干细胞表面分子标记CD29、CD34、CD44、CD45、CD105的表达。4免疫组化检测传代hAECs中端粒酶催化亚基hTERT蛋白的表达。结果:1在体外培养条件下,hAECs能贴壁生长,细胞呈典型的上皮细胞样外观,正常情况下可传7—8代。HE染色可见细胞大小较均一,呈不规则的多角形,细胞连接成片。2免疫组化结果显示培养的hAECs胞浆中见CK7、CK8、CK18单克隆抗体染色阳性,OCT-4免疫荧光结果显示hAECs的胞浆中有荧光表达。3流式细胞仪检测发现hAECs干细胞标记分子CD29、CD34的表达为阳性,但干细胞标记分子CD44、CD45、CD105的表达为阴性。4免疫组化结果显示培养的hAECs胞浆中hTERT单克隆抗体染色阴性。结论:1通过酶分离法可成功分离出纯度较高的hAECs,获得的细胞能在体外进行短期内培养。2培养的hAECs是单层上皮细胞来源,并具有干细胞的某些特征。第二部分真核表达载体pLenti6/V5-DEST-hTERT-EGFP的构建目的:利用慢病毒载体构建携带有目的基因人端粒酶催化亚基（hTERT）和标记基因增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的真核表达载体pLenti6/V5-DEST-hTERT-EGFP,为基因转染hAECs奠定实验基础。方法:1基因重组穿梭质粒pDONR221-hTERT-EGFP的构建和鉴定以PCI-neo-hTERT质粒为模板PCR法获取目的基因hTERT,通过BP反应,将hTERT定向克隆至pDONR221得pDONR221-hTERT;以质粒pEGFP-N1为模板,通过PCR反应得到-linker-EGFP-产物。通过双酶切,T4-DNA连接酶反应,得到pDONR221-hTERT-EGFP产物。然后转化大肠杆菌DH5α,卡那霉素筛选,挑克隆行PCR、酶切及测序鉴定。2 pLenti6/V5-DEST-hTERT-EGFP重组载体的构建和鉴定取pDONR221-hTERT-EGFP重组质粒和pLenti6/V5-DEST载体,进行LR重组反应,得到pLenti6/V5-DEST-hTERT-EGFP重组质粒,之后转化入大肠杆菌STB13感受态,涂含氨苄霉素的LB平板,挑取单菌落扩增培养,提取质粒,并进行测序鉴定。3含hTERT-EGFP病毒颗粒上清的包装和收集利用脂质体转染法将pLenti6/V5-DEST-hTERT-EGFP质粒转入293FT细胞,培养24h后,更换完全培养基,再48 h-72 h后,采用过滤法收集含病毒颗粒的上清液,一80℃保存备用。结果:1慢病毒入门载体pDONR221-hTERT-EGFP的构建和鉴定结果本实验成功扩增出长达约3.4Kbp的attB1-hTERT-attB2片段,行PCR、酶切及测序鉴定,证实hTERT已克隆入入门载体pDONR221,并成功获得pDONR221-hTERT-EGFP产物。2慢病毒入门载体pDONR221-hTERT的1547位点定点突变（将1547位点突变的碱基G变回原序列A）测序结果表明慢病毒入门载体的目的基因hTERT存在1547位点发生错义突变,经设计含1547位点正确碱基的引物,通过定点突变技术将慢病毒入门载体pDONR221-hTERT的1547位点定点突变,经测序证实突变成功。3慢病毒表达载体pLenti6/V5-DEST-hTERT-EGFP的构建和鉴定结果经LR重组反应构建得慢病毒重组质粒pLenti6/V5-DEST-hTERT-EGFP,将重组质粒送去测序,证实重组质粒pLenti6/V5-DEST-hTERT-EGFP构建成功。4含hTERT-GFP病毒颗粒上清液的制备结果将pLenti6/V5-DEST-hTERT-GFP与VirapowerTMPackaging Mix利用脂质体共转染包装细胞293FT细胞,终止转染72h后收集上清液,过滤,即得含hTERT-GFP病毒颗粒的上清液。结论:1首次成功构建慢病毒重组质粒pLenti6/V5-DEST-hTERT-EGFP。第三部分慢病毒表达载体pLenti6/V5-DEST-hTERT-EGFP的转染和表达一、pLenti6/V5-DEST-hTERT-EGFP基因转染hAECs目的:在本实验中,利用慢病毒将目的基因人端粒酶逆转录酶基因（hTERT）和标记基因EGFP转染入人羊膜上皮细胞（hAECs）,并扩增培养含hTERT-EGFP基因的克隆细胞,观察转染细胞的生长特性,用流式细胞仪检测转染细胞EGFP阳性表达率和检测hTERT基因转染对hAECs生长周期的影响,为下一步转染细胞的活体移植奠定实验基础。方法:1人羊膜上皮细胞的传代培养2慢病毒载体的转染2.1杀稻瘟菌素筛选浓度的确定2.2慢病毒载体转染人羊膜上皮细胞制成两孔转染实验组（转基因组）、两孔转空载对照组、两孔正常对照组,共六孔,24h后终止转染。3筛选稳定表达的抗性细胞克隆并扩增培养细胞终止转染后,继续培养24 h,加入含杀稻瘟菌素终浓度为1ug/ml的完全培养基,对细胞进行加压筛选,筛选10天左右,直至单个细胞克隆形成。重组细胞克隆形成后,换为不加筛选药物的DMEM完全培养基继续培养,至细胞接近融合时,消化传代,扩增培养。扩增培养时,仍加杀稻瘟菌素进行筛选。4荧光显微镜下观察转染基因的瞬时表达细胞终止转染后,用不加筛选药物的含10%胎牛血清的DMEM完全培养基继续培养12h、24h、48h、72h、96h,荧光显微镜下观察每个时间段瞬时转染细胞和稳定转染细胞绿色荧光蛋白的表达。5倒置显微镜下观察转染细胞的生长形态6流式细胞仪检测转染细胞EGFP阳性表达率分别收集未转染的hAECs、瞬时转染12h、24h、48h、96h的hAECs,制成单细胞悬液,行流式细胞仪检测,利用cell-quesL软件分析EGFP阳性细胞表达率。7流式细胞仪检测hTERT基因转染对hAECs生长周期的影响分别收集稳定转染后第2代培养48h的hAECs（转基因组）,常规传1代培养48h的hAECs（正常对照组）,以及转染空载体传1代培养48h的hAECs（转染空载体组）,调细胞浓度为1×106个/ml,用流式细胞仪检测标记细胞,CellQuest软件处理资料,全部数据采用SPSS11.0统计软件包进行处理,PI值比较采用单因素方差分析,以P＜0.05定为差异具有统计学意义。结果:1杀稻瘟菌素的抗性筛选接种于6孔板中的人羊膜上皮细胞,当加入杀稻瘟菌素浓度为1ug/ml时,培养14d细胞全部死亡,从培养时间上考虑选1ug/ml作为杀稻瘟菌素的筛选浓度。2倒置显微镜下所见培养的人羊膜上皮细胞加入转染液12h后,有少数细胞从培养板上脱落下来漂浮于培养液中,大多数转染细胞筛选出的抗性克隆以及培养的克隆细胞均与正常细胞在形态上无显着差异。3荧光显微镜下观察GFP的阳性表达3.1瞬时转染12h后即可见发绿色荧光的人羊膜上皮细胞,但数量较少,强度教弱,每个低倍视野下可见0-2个;24h后发绿色荧光的人羊膜上皮细胞逐渐增多强度增强,每个低倍视野下可见5-8个左右;48h后发绿色荧光的人羊膜上皮细胞继续增多,每个低倍视野下可见10个以上;72h后发绿色荧光的人羊膜上皮细胞与48h的人羊膜上皮细胞差别不大;96h后发绿色荧光的人羊膜上皮细胞逐渐减少,每个低倍视野下可见5个左右,经1ug/ml的杀稻瘟菌素筛选10d后,观察有单细胞克隆出现。3.2消化收集经1ug/ml的杀稻瘟菌素筛选获得稳定表达的人羊膜上皮细胞,接种于6孔板中扩增培养,贴壁后可见密集荧光。4人羊膜上皮细胞pLenti6/V5-DEST-HTERT-EGFP基因转染效率检测结果流式细胞仪检测结果显示:未转染组人羊膜上皮细胞中,GFP阳性细胞数为零,瞬时转染12h、24h、48h、72h、96h组的人羊膜上皮细胞均可见GFP阳性表达,其中48h转染组的人羊膜上皮细胞GFP阳性表达率最高,为18.53%,与12h、24h、96h转染组比较差异具有统计学意义（P＜0.05）,与72h转染组比较差异不显着,无统计学意义（P＞0.05）。5细胞周期检测结果转基因组人羊膜上皮细胞与正常对照组比较,处于S期和G2/M组的细胞比例增加,PI值升高,两者有显着性差异（P＜0.05）,转空载体组人羊膜上皮细胞与正常对照组比较,PI值无显着变化（P＞0.05）。结论:1首次证明目的基因人端粒酶逆转录酶基因（hTERT）和标记基因EGFP经慢病毒介导转染入人羊膜上皮细胞（hAECs）后,并可在细胞内获得瞬时表达和稳定表达,且瞬时转染48h,人羊膜上皮细胞（hAECs）EGFP阳性表达率最高,为18.53%。2转染入目的基因人端粒酶逆转录酶基因（hTERT）后,人羊膜上皮细胞（hAECs）的增值指数PI值明显升高,生长周期明显延长。3慢病毒介导的转染方法对人羊膜上皮细胞（hAECs）的形态、分化和增殖能力等生物学特性无明显影响,再次证明是一种相对安全的基因转染方法。二、pLenti6/V5-DEST-hTERT-EGFP基因在转基因hAECs中的表达目的:在本实验中,利用荧光定量PCR和Western blot方法从mRNA和蛋白质水平检测hTERT基因在转基因hAECs中的表达,并通过免疫组织化学法检测转基因hAECs中端粒酶催化亚基hTERT蛋白的表达,再通过裸鼠试验检测转染细胞的致瘤性,研究转染有hTERT基因的hAECs的生物安全性,为基因转染人羊膜上皮细胞并进行角膜表层重建奠定实验基础。方法:1应用荧光定量PCR（Real Time-PCR）方法检测hTERT mRNA在转染细胞中的表达1.1总RNA提取（整个过程要求在超净台内进行）分别提取常规传1代培养48h的hAECs（第1组,即正常对照组）、传1代培养48h的HepG2肝癌细胞（第2组,即阳性对照组）、以及稳定转染pLenti6/V5-DEST-hTERT-EGFP基因后第2代培养48h的hAECs（第3组,即稳定转染实验组）、瞬时转染48h的hAECs（第4组,即瞬时转染实验组）、用慢病毒空载体转染48h的hAECs（第5组,即空载转染对照组）的总RNA。1.2总RNA纯度和完整性检测1.2.1纯度检测:取双蒸水99μl加入比色杯中,再加入1μl总RNA样品,在核酸蛋白检测仪上测定OD值。1.2.2总RNA完整性检测:取RNA样品2μl,1%琼脂糖凝胶电泳80V×30min,用凝胶成像系统观察总RNA的5s rRNA、18s rRNA和28s rRNA条带。1.3逆转录:得1st strand cDNA:取上述5组细胞RNA液各2ul,转移到无菌PCR管中,行PCR反应。1.4荧光定量qRT-PCR1.4.1检测序列片段大小1.4.2设计引物1.4.3反应体系:2×2×SYBR green premix10μl+Primers mix0.8μl+cDNA1μl+H2O 8.2μl,总体积为20μl;1.4.4反应条件:95℃10min,95℃15s,65℃30s,72℃30s读板,共40个循环;1.4.5融解曲线分析:温度55℃-95℃,每分钟读1次,每个样设置3个复孔。2 Western blotting法检测转基因hAECs中端粒酶蛋白的表达2.1样品的制备取上述5组细胞,加入单去污剂裂解缓冲液,收集细胞裂解物,加入等体积凝胶加样缓冲液,离心后,将上清夜移至另一管中,待用。2.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）2.2.1正确安装电泳槽玻璃板,加入分离胶,待分离胶完全聚合后,再在分离胶上灌注浓缩胶,快速插入干净的梳子,浓缩胶聚合后,小心移出梳子。2.2.2将凝胶固定于电泳装置上,加入电泳缓冲液。按预定顺序加样,连接电泳装置与电流。当染料接近分离胶底部时,关闭电源。卸下玻璃板,分离玻璃板,标记凝胶方位。2.3 Western Blotting法检测电泳完毕后,将凝胶取下,贴于PVDF膜上,将胶、膜、滤纸、海绵和转移夹板夹成“三明治”状,进行转膜,闭膜,加一抗溶液孵育过夜。再加到二抗溶液中,摇床孵育1h。然后显色,感光,显影和定影,与之前预染的Marker对比,观察结果,拍照分析。3免疫组化法检测转基因hAECs中端粒酶催化亚基hTERT蛋白的表达采用链酶亲和素-过氧化物酶（SABC）法,检测盖玻片上常规培养的上述五种细胞中端粒酶催化亚基hTERT蛋白的表达情况。4裸鼠致瘤实验取稳定转染有目的基因hTERT的hAECs及HepG2肝癌细胞,取BALB/c—nu/nu品系裸鼠12只,6只接种转基因hAECs,6只接种HepG2肝癌细胞,于动物背部皮下无菌接种细胞悬液,屏障环境下饲养两周,观察细胞注射部位有无肿瘤生长以及肿瘤的大小。结果:1实时荧光定量PCR检测结果第1组即正常对照组和第5组即空载转染对照组hTERTmRNA的相对含量为0即不表达hTERT,第2组即阳性对照组hTERT mRNA的相对含量为450,第3组即稳定转染组目的基因hTERT mRNA的相对含量为200,第4组即瞬时转染组目的基因hTERTmRNA的相对含量约为185,说明瞬时转染和稳定转染的hAECs内均有hTERTmRNA基因表达,而没有进行基因转染的hAECs和转染空载体的hAECs内无hTERTmRNA基因表达。2 Western Blotting检测结果第2组即阳性对照组细胞裂解产物,在相对分子量为314KD处呈现一条特异性蛋白条带,而第1组即正常对照组、和第3组即稳定转染组和第4组即瞬时转染组和第5组即空载转染对照组则无相应条带出现,这可能因为稳定转染组细胞中hTERT蛋白表达过少或没有表达。3免疫组化检测结果端粒酶催化亚基hTERT抗体在第1组即正常对照组、第4组即瞬时转染组和第5组即空载转染对照组的hAECs细胞胞浆中不着色,说明这些细胞不表达hTERT蛋白,而端粒酶催化亚基hTERT抗体在第2组即阳性对照组中细胞胞浆中呈深褐色着色,说明其hTERT蛋白表达呈强阳性,,TERT抗体在第3组即稳定转染组的hAECs中呈浅褐色着色,说明其hTERT蛋白表达呈弱阳性。4裸鼠致瘤实验结果裸鼠在屏障环境下饲养一周后,接种HepG2肝癌细胞的裸鼠注射部位即有肿瘤长出,并随着饲养天数的延长逐渐长大,而接种转基因hAECs的裸鼠注射部位无明显变化。结论:1首次从mRNA水平检测到hTERT基因在体外培养的hAECs中成功转染和表达,但蛋白质水平上没有检测到转染细胞中hTERT蛋白的表达,说明hTERT基因在mRNA水平和蛋白质水平的表达并不平衡。2转染有目的基因hTERT且稳定表达的人羊膜上皮细胞目前尚未发现有致瘤性。第四部分应用转基因hAECs重建角膜表层的研究目的:研究转基因人羊膜上皮细胞（hAECs）在新鲜角膜基质片上的生存情况,并将生长有转基因hAECs的新鲜角膜基质片移植到角膜缘干细胞缺乏的兔眼表面重建角膜表层,观察转基因人羊膜上皮细胞的存活情况及眼表的稳定性,探讨转基因HAECs在活体兔眼表面的转归,为基因转染hAECs并进行角膜表层重建奠定实验基础。方法:1制备兔角膜缘干细胞缺损模型取实验兔12只,麻醉后,开睑器开睑,在兔右眼角膜表面滴用正庚醇数滴去除角膜上皮,环形切除角膜缘内2mm浅板层组织,剪去第3眼睑,结膜下注射庆大霉素及地塞米松,连续观察2个月,对角膜结膜化、新生血管情况进行记录。2转基因pLenti6/V5-DEST-HTERT-EGFP人羊膜上皮细胞克隆的体外扩增培养3新鲜兔角膜基质片的制备取新西兰大白兔眼球,暴露角膜,吸取少量正庚醇,滴加到角膜表面去除角膜上皮层,留下光滑的角膜基质面。然后再在角膜缘处做一小板层切口,用无菌虹膜恢复器分离浅层角膜基质层。用7.5mm环钻钻取角膜基质,将其放在无菌超净台内风干,然后放入96孔板中,备用。4在新鲜角膜基质片上种植转基因pLenti6/V5-DEST-HTERT-EGFP人羊膜上皮细胞并复层化将转基因hAECs消化后,接种到96孔板中的新鲜角膜基质上,小心放入培养箱中静置培养。大约3天后,角膜基质片上的细胞形成单层融合时,取出基质片,放入事先放在6孔板内的带微孔滤膜、三维立体插入式细胞培养器中。置入细胞培养箱中静置培养,大约培养10天左右,自然形成上皮细胞的复层结构。5新鲜角膜基质片上细胞的HE染色观察新鲜角膜基质片上的细胞培养3天后和利用气液界面培养10天后,固定、脱水、包埋、切片,进行HE染色后光学显微镜观察。6转基因hAECs移植片的眼表移植6.1动物分组:将上述12只右眼角膜缘干细胞缺乏模型兔随机分成2组,按构建角膜移植片是否有细胞,分为:A组（对照组,n=6）:新鲜角膜基质片上不种任何细胞,B组（pLenti6/V5-DEST-hTERT-EGFP基因转染组,n=6）:种子细胞为含目的基因hTERT和标记基因EGFP的慢病毒载体转染的hAECs。6.2模型兔麻醉后,开睑器开睑,用7.0mm环钻钻取兔右眼角膜中间组织,钝性分离及板层切除中央角膜组织,将转基因人羊膜上皮细胞移植片平铺于角膜创面,然后间断缝和移植片与角膜上。结膜下注射庆大霉素及地塞米松,局部涂四环素可的松眼膏,间断缝合上下睑缘。7术后处置术后术眼滴氧氟沙星滴眼液于结膜囊内,肌肉注射庆大霉素,并在饲料中加环胞霉素A。每日氧氟沙星滴眼液滴眼,每日观察植片的存活状况及眼表的稳定性。8术后观察及检测8.1大体观察术后第一周内,每天在裂隙灯下观察,以后每周观察2-3次,连续观察2个月。对角膜水肿、混浊、结膜化、新生血管情况进行记录。8.2移植眼角膜组织的HE染色观察8.3移植眼角膜组织细胞角蛋白CK8、CK18、CK12免疫组化检测结果:1兔角膜缘干细胞缺乏模型制备角膜缘干细胞缺乏模型术后观察,两个月后有10只兔眼表现为角膜表面结膜化,新生血管膜形成,全角膜灰白色混浊。另2只兔眼角膜没有出现明显的结膜化,但已长出大量新生血管,并逐渐向角膜中间蔓延。2新鲜角膜基质片上细胞在倒置显微镜下所见转基因hAECs接种到新鲜兔角膜基质片后,3h开始贴壁,12h细胞呈团块状堆积,24h后细胞呈棒状伸展,3d左右变成多角形,部分区域已连接成片。3新鲜角膜基质片上细胞HE染色转基因hAECs在新鲜兔角膜基质上3-5d左右形成致密的单层结构,细胞排列紧密,然后应用插入式细胞培养器形成的气.液界面培养法培养10d左右,转基因人羊膜上皮细胞能形成类似角膜上皮的3-5层复层结构,形成的复层上皮细胞与角膜基质连接紧密,不易脱落。4.移植术后移植片的大体外观所见A组:术后一个月观察,6只兔眼均表现为整个角膜高度水肿,角膜浑浊程度较重,有大量新生血管,角膜炎症反应重,分泌物多。术后两个月观察,角膜结膜化,角膜血管化严重,已向角膜中央侵犯。B组:术后一个月观察,有6只兔眼角膜透明度有不同程度提高,角膜周边有新生血管,6只兔眼缝线已大部分脱落。术后两个月观察,5只兔眼角膜均恢复透明,角膜上皮光滑,只有1只兔眼角膜透明度较低,新生血管较多。5.角膜移植片的HE染色所见角膜上皮重建术后2月,B组角膜组织HE染色可见角膜表面上皮出现部分类似角膜上皮的复层排列,角膜基质层可见新生血管增生。6.移植眼角膜组织免疫组化检测结果角膜上皮重建术后2月,角膜组织免疫组化染色可见上皮细胞角蛋白CK8、CK18和角蛋白CK12均呈阳性表达,角膜表面上皮部分细胞胞浆呈棕黄色,细胞核蓝色。结论:1新鲜角膜基质有利于人羊膜上皮细胞形成类似角膜上皮的复层排列,且表达角膜上皮细胞特异性抗体CK12。2转基因pLenti6/V5-DEST-hTERT-EGFP人羊膜上皮细胞可以成为重建角膜表层的一种新的种子细胞。
金旭红[5]（2008）在《磁标记骨髓间充质干细胞构建组织工程软骨MRI活体示踪技术研究》文中研究指明背景多种原因所致的关节软骨缺损在医学临床较为常见,目前所用的保守治疗和手术治疗方法均存在明显缺陷。关节软骨组织工程技术可为其再生修复提供新的治疗手段。近年来骨髓间充质干细胞（BMSCs）因具有良好的体外扩增能力、且具有软骨分化潜能,已成为体外构建组织工程软骨的重要种子细胞来源,许多实验表明移植入宿主体内的BMSCs能促进宿主体内缺损功能的修复,展示了光明的前景。然而目前困扰关节组织工程技术临床应用的一个重要难题――对体内原位种子细胞的研究缺乏有效的识别和追踪监测手段,因而难以明确外源性种子细胞在软骨缺损修复中的作用和转归,体内新生软骨组织的细胞来源,细胞移植术的疗效。因此迫切需要探索一种对体内原位移植细胞进行追踪和监测的安全、有效、无创的手段,以促进组织工程软骨修复关节软骨缺损技术研究的进一步深入。目的本项目拟在课题组既往关节软骨组织工程研究获得重要进展的基础上,借鉴国内外最新研究成果,研究体外SPIO标记种子细胞BMSCs的适宜方法、磁标记物对种子细胞生物学特性的影响、MRI监测体外磁标记细胞的灵敏度、准确度及MRI活体示踪自体皮下移植磁化标记BMSCs的可行性,最后通过不同时相点1.5T MRI在体示踪种子细胞在活体内的存活、迁徙及分布,以及结合BrdU细胞示踪技术作为阳性对照,并判定其磁标记细胞的分化转归过程,完成其自体移植修复关节软骨缺损的动物实验应用研究,为关节软骨组织工程种子细胞的在体示踪提供一种安全无创、动态直观的新技术和新方法。方法1、体外纳米磁标记BMSCs的体外细胞生物学特性及其MR成像从兔骨髓中分离培养BMSCs,不同浓度SPIO（50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml）联合硫酸鱼精蛋白转染剂与BMSCs孵育12h,未标记细胞设为对照组。普鲁士染色和电镜检查鉴定细胞内是否含铁颗粒;胎盼蓝染色检测细胞存活和MTT法测定生长曲线的变化;磁标记BMSCs转入各定向培养基中进行诱导培养2w后;鉴定磁标记BMSCs的多向分化潜能:对成骨定向诱导组进行钙结节茜素红染色和碱性磷酸酶（ALP）组化染色,对成脂肪定向诱导组观察细胞形态学变化或油红-O染色,对成软骨定向诱导组进行番红-O染色和II型胶原免疫组化染色检测胞外基质的分泌和表达;应用1.5T MR梯度回波T2加权（GRET2*WI）扫描序列和自旋回波T2加权（SET2WI）扫描序列对磁标记细胞成像示踪。2、MR成像示踪磁标记兔BMSCs自体皮下移植BMSCs经体外采用SPIO和BrdU双重标记后,与壳聚糖-甘油磷酸钠（C-GP）支架复合植入兔自体大腿皮下,在术后1h、第5d及2w、4w、8w应用0.2T MR GRET2*WI序列对磁标记细胞成像行连续示踪,扫描后即处死动物并取材行组织切片普鲁士染色及免疫组化BrdU检查。实验组为自体皮下移植SPIO标记BMSCs（n=6）,设立自体皮下移植未标记BMSCs（n=6）和皮下单纯注射SPIO组（n=2）为两组对照。3、MR在体成像示踪磁标记的BMSCs修复兔关节软骨缺损建立兔膝直径4mm深约3mm的股骨髁软骨缺损模型,1周后将经SPIO和BrdU双重标记的BMSCs与C-GP支架1ml复合,然后注射到自体软骨损伤关节腔中,术后1h、4w、8w及12w应用1.5T MR GRET2*WI序列对膝关节腔内注入的磁标记BMSCs进行扫描示踪,并与组织切片普鲁士染色及免疫组化BrdU对照。实验组为损伤侧膝关节注入1ml含1×108个磁标记BMSCs与C-GP支架混悬液;设立注入1ml含1×108个未标记BMSCs与C-GP支架混悬液、损伤侧膝关节不做任何处理为两组对照（n=6）。结果1、体外纳米磁标记BMSCs细胞生物学特性及其MR成像磁标记细胞普鲁士染色和电镜检查显示细胞胞浆内含致密铁颗粒;胎盼蓝染色和MTT分析测定生长曲线证实磁标记对BMSCs活性和增殖无影响（P>0.05）;纳米磁标记BMSCs在体外具有向成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞表型诱到的潜能。1.5TMR扫描GRET2*WI序列和SET2WI序列提示与未标记细胞SI相比,1×106个标记细胞、5×105个标记细胞信号强度均有不同程度显着性下降（P<0.05）其中GRET2*WI的信号强度衰减率显着性高于T2WI序列（P<0.05）。在两个序列中1×106（标记细胞）信号强度衰减率均高于5×105（标记细胞）信号强度衰减率,但不具有有显着性差异。2、MR成像示踪磁标记兔BMSCs自体皮下移植自体皮下移植的磁标记兔BMSCs在GRET2*WI序列成像时产生特征性的低信号改变至少维持8周。术后1h兔后肢0.2T MR GRET2*WI序列成像示磁标记细胞在皮下注入部位形成直径约1.5cm的特异性类圆形低信号影。术后5d观察到距注射部位后侧0.5cm处皮下出现孤立的特异性低信号影,原皮下注射部位特异性低信号影直径扩大至1.7cm,低信号强度未见减弱。术后2w见皮下孤立的特异性低信号影已与原皮下注射部位特异性低信号影融合,并呈线性延伸为0.6cm,低信号区域直径扩大为2.0cm,侵及肌层。术后4w见低信号区域进一步扩大。术后8w见皮下注射部位向周围发出的低信号线显着长达1.1cm,低信号区域直径扩大为2.6cm,侵及肌肉深层,低信号强度减弱。MRI信号改变区域与组织学切片普鲁士染色及免疫组化BrdU显示植入细胞结果相对应。术后第5d移植部位见植入细胞密集,植入物与宿主组织界面周围散在出现植入细胞。术后2w至4w见移植部位与宿主组织界面周围出现的植入细胞较前增加,但植入细胞主要聚集在移植部位内,术后8w移植部位植入细胞减少,宿主组织内出现的植入细胞较前显着增加。HE染色观察到术后初期在植入区域出现炎性反应,但术后1周炎性反应消失,所有动物的移植部位均未出现切口红肿和分泌物。3、MR在体成像示踪磁标记的BMSCs修复兔关节软骨缺损体外磁标记的BMSCs与C-GP复合注射入关节腔后1.5T MR GRET2*WI序列成像显示关节腔内磁标记BMSCs产生弥漫性颗粒状低信号影改变至少12w,术后1h可见关节腔内出现弥漫性颗粒状异常低信号改变,主要分布于和腘窝部位,术后4w观察到软骨缺损部位、软骨下骨处特异性低信号影改变。但随着移植时间延长,低信号强度逐渐减弱,术后12w软骨缺损处特异性低信号影不明显,而关节腔内髌上囊、腘窝处结节状低信号改变仍清晰存在。MRI信号改变区域与组织学切片普鲁士染色及免疫组化BrdU显示植入细胞结果相对应。术后4w见软骨修复区有少量植入细胞存在,大量植入细胞主要分布于髌上囊、腘窝处滑膜和软骨下骨,术后8w软骨修复区植入细胞消失,滑膜中植入细胞数目亦减少,术后12w软骨修复区亦未见植入细胞,而髌上囊滑膜和软骨下骨部位仍较多存在植入细胞。结论1、SPIO联合硫酸鱼精蛋白转染剂能成功标记BMSCs,磁标记对细胞存活、增殖及潜在多向分化能力无影响,磁标记细胞在MR上产生特征性的低信号改变,临床1.5TMR成像示踪标记细胞可行,以GRET2*WI序列成像最为敏感。2、自体皮下移植的磁标记兔BMSCs在0.2T GRET2*WI序列产生特征性的低信号改变至少8w,术后1h、第5d、2w、4w、8w不同时相MR连续成像观察到植入细胞从皮下移植部位向远处迁移并逐渐进入宿主组织。术后2w、4w、8w时植入细胞的组织学改变与MRI结果基本一致。移植的磁标记细胞在具有免疫功能的皮下未诱发明显的免疫反应。利用0.2T MR连续示踪自体皮下移植的磁标记BMSCs活体内的分布和迁移是可行的。3、兔BMSCs经SPIO标记后仍然具有成软骨细胞诱导能力;磁标记后植入关节腔内的BMSCs可以在临床1.5T MR上产生明显的低信号改变至少12w,术后1h、4w、8w、12w时不同时相MR连续成像观察到关节腔内部分植入细胞向软骨缺损迁移聚集随后又逐渐减少,至术后12w时软骨缺损部位植入细胞消失,此时植入细胞主要分布于关节腔内髌上囊、腘窝、软骨下骨。术后4w、8w、12w时植入细胞的组织学改变与MRI结果基本一致,关节腔内注入体外扩增培养的磁标记BMSCs,不能促进软骨缺损修复。应用MRI在体示踪磁标记细胞技术可以连续示踪组织工程软骨种子细胞BMSCs在活体关节腔内的分布和迁移,可望为组织工程种子细胞的示踪提供一种无创动态、直观简便的方法。
孔永[6]（2008）在《腺病毒介导CTLA4Ig和CD40Ig基因转染对人皮肤成纤维细胞免疫性能影响的体外研究》文中进行了进一步梳理异基因（异体、异种）皮肤移植后的排斥反应主要是由活化T细胞主导的急性细胞性排斥反应,此过程中T细胞共刺激信号的参与对于T细胞活化和免疫排斥的发生是必需的,阻断共刺激信号,可导致T细胞无反应、细胞凋亡或克隆丢失,从而诱导免疫耐受。在已发现的多种T细胞共刺激信号中,公认最为重要的是B7-CD28信号和CD40-CD40L信号。利用蛋白或抗体可有效对其阻断,诱导免疫耐受,但存在制备复杂、成本较高、半衰期短和需要长期施用等弊端。腺病毒载体安全性高、制备容易以其介导基因治疗的方式将共刺激分子基因导入靶细胞中,使治疗性蛋白在特定区域表达,阻断共刺激信号,有望降低成本、延长效应时间。皮肤成纤维细胞易获取、培养及大量扩增,也是常用的组织工程皮肤种子细胞和皮肤基因治疗理想的靶细胞。因此本研究以体外培养的人皮肤成纤维细胞为靶细胞,用腺病毒介导CTLA4Ig和CD40Ig基因转染阻断公认最为重要的B7/CD28和CD40/CD40L信号,通过对Adv-CTLA4Ig、Adv-CD40Ig感染人皮肤成纤维细胞的效率检测、感染后细胞形态和增殖能力检测、目的蛋白表达检测及对其免疫性能影响检测,研究、评价腺病毒基因治疗方式介导CTLA4Ig和CD40Ig阻断双共刺激信号应用于人皮肤成纤维细胞修饰和治疗的效果和可行性,为其应用提供基础资料。其主要内容如下:1.采用流式细胞分析技术检测腺病毒对体外培养人皮肤成纤维细胞的转染效率。结果表明:Adv-EGFP在感染复数（MOI）为50,100时对人皮肤成纤维细胞转染效率约为51.7±7.24%、69.99±3.26%,同时对细胞形态和增殖能力无明显影响。因此本研究选用100为腺病毒感染人皮肤成纤维细胞的MOI。2.采用形态学观察和MTT法细胞活力检测重组腺病毒转染对体外培养人皮肤成纤维细胞生长形态和增殖能力的影响。结果表明:重组病毒Adv-CTLA4Ig、Adv-CD40Ig在MOI为100时单独和混合转染人皮肤成纤维细胞后,实验组与对照组细胞形态均呈长梭形、不规则三角形,平行、放射状或漩涡状分布,有较长胞质突起,轮廓清晰,并且各组细胞增殖能力无显着差异（P＞0.05）。3.采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测重组腺病毒介导CTLA4Ig和CD40Ig在体外培养人皮肤成纤维细胞培养上清中的表达情况。结果显示:重组病毒Adv-CTLA4Ig、Adv-CD40Ig在MOI为100单独和混合转染人皮肤成纤维细胞后,在培养上清中均检测到相应目的蛋白的表达,其表达量分别是:Adv-CTLA4Ig转染组:CTLA4Ig 2.79±0.08ug/ml;Adv-CD40Ig转染组:CD40Ig 1.25±0.11ug/ml;Adv-CTLA4Ig+Adv-CD40Ig转染组:CTLA4Ig2.14±0.21ug/ml,CD40Ig 1.00±0.04ug/ml。4.采用重组腺病毒Adv-CTLA4Ig、Adv-CD40Ig转染后的体外培养人皮肤成纤维细胞与人外周血单个核细胞混合培养检测对人皮肤成纤维细胞免疫性能的影响。结果显示:重组病毒Adv-CTLA4Ig、Adv-CD40Ig以MOI为100单独和混合转染的体外培养人皮肤成纤维细胞对人外周血单个核细胞增殖抑制均优于对照组,有显着性差异（单处理组P＜0.05,混合组P＜0.01）,Adv-CTLA4Ig和Adv-CD40Ig混合处理组抑制效果优于各单处理组（P＜0.05）达到31.67±2.25%,Adv-CTLA4Ig处理组（23.41±1.23%）优于Adv-CD40Ig（19.83±4.71%）（P＜0.05）。综上所述,重组腺病毒Adv-CTLA4Ig、Adv-CD40Ig可以有效转染体外培养人皮肤成纤维细胞;介导CTLA4Ig和CD40Ig表达;对细胞生长形态和增殖能力无明显影响;通过腺病毒介导方式能有效阻断B7/CD28、CD40/CD40L共刺激信号,抑制体外培养人外周血单个核细胞增殖,阻断B7/CD28信号诱导抑制效果优于CD40/CD40L信号,阻断双信号可更大程度诱导免疫抑制,因共刺激信号多样、免疫反应复杂性及施用量、处理时间的原因,并不能完全抑制。结论:腺病毒基因治疗方式介导CTLA4Ig和CD40Ig阻断B7/CD28、CD40/CD40L共刺激信号可应用于人皮肤成纤维细胞修饰和治疗。
杨波[7]（2008）在《VEGF165基因转染脂肪干细胞促进工程化脂肪组织的血管化研究》文中研究表明研究背景组织工程是应用细胞生物学和工程学原理,对病损组织结构和功能的修复与重建进行研究开发的一门新兴学科。20世纪80年代组织工程开始应用于医学领域的研究,到目前已经能够成功地将体外大量扩增的细胞与生物材料复合后植入体内以达到恢复、替代、维持或提高组织器官功能的目的。然而,随着研究的进一步深入,学者们发现当组织的体积达到数立方毫米时,其内部的细胞将难以通过渗透作用获得营养和氧分的支持,而必须要求毛细血管的长入才能维持其正常的代谢。对血循环的重建而言,血管内皮细胞生长因子（vascular endothelialgrowth factor,VEGF）作为血管内皮细胞的特异性丝裂原是血管形成最重要的调节因子,在新生血管形成过程中起重要作用,而通过将VEGF编码基因导入细胞的基因修饰已成为获得血循环重建的最具发展潜力的治疗模式之一。国外有些研究机构开始尝试将细胞移植与生长因子联合应用,并获得很好的疗效。但就目前的研究而言,不论是国内或是国外文献,尚未见在组织工程脂肪研究上同时植入由生长因子修饰的脂肪干细胞来改善组织工程脂肪血管形成的研究。研究目的1.研究从成人脂肪抽吸物液体部分中获取的脂肪组织来源干细胞（adipose-derived stem cell,ASCs）作为脂肪组织工程理想种子细胞的优势。2.对ASCs进行腺病毒重组增强型绿色荧光蛋白（recombinedadenovirus-enhanced green fluorescent protein,Ad-EGFP）体外转染和标记,观察其对细胞生物性状的影响,为脂肪干细胞研究寻找理想的细胞标记方法。3.探讨腺病毒为载体对种子细胞进行VEGF165基因修饰的可行性。4.利用Ⅰ型胶原蛋白作支架材料和ASCs在体内构建组织工程化脂肪的可行性。5.通过VEGF165基因修饰干预组织工程脂肪组织血管形成,评价促进组织工程脂肪血管形成的效果,使再生的脂肪组织内部获得血供能力而保证其长期稳定存活,提高组织工程化脂肪成活水平。材料与方法1.ASCs的分离培养及鉴定取人吸脂术抽吸物的液体部分,使用直接离心过滤法进行原代培养,观察细胞形态及功能变化,细胞传至第4代后供实验用。利用流式细胞仪检测细胞表面部分与干细胞相关的分子,确定细胞类型;台盼蓝拒染法测细胞活性并绘制细胞生长曲线;同时对细胞进行体外定向成脂、成骨、成软骨诱导分化,并以油红0染色、茜素红染色和阿新蓝染色进行鉴定。2.Ad.EGFP转染并标记ASCsAd.EGFP按不同感染复数（multiphcity of infection,MOI）值体外转染ASCs,进行EGFP荧光标记,倒置显微镜及荧光显微镜观察细胞生长情况及传代后荧光强度的变化;测定腺病毒转染ASCs的效率;检测细胞标记后成脂能力。使用台盼蓝拒染法检测细胞活力和绘制细胞生长曲线,同时将培养细胞上清液进行乳酸脱氢酶（LDH）含量测定,检测Ad.EGFP对细胞的毒性。3.Ad.VEGF165基因转染ASCs后目的基因表达按上述试验确定的MOI值（50）进行Ad.VEGF165体外转染ASCs,通过免疫细胞荧光检测VEGF在细胞内的表达情况;同时利用ELISA测定细胞培养上清液中VEGF浓度水平。4.Ⅰ型胶原构建工程化脂肪的实验研究将脂肪干细胞接种于支架材料形成复合物,将培养细胞上清液进行乳酸脱氢酶（LDH）含量测定,检测材料的细胞毒性;细胞-支架粘附率检测;最后扫描电镜观察细胞与载体的黏附性。在确定细胞和支架材料生物相容性较好的情况下,准备三组植入物（细胞被EGFP标记）:Ⅰ组为空支架,Ⅱ组为ASCs和支架,Ⅲ组为成脂分化的ASCs和支架,分别在不同部位植入同一裸鼠皮下。在8w取新生标本,进行组织工程新生物大体观察和湿重测定后,荧光显微镜观察大体组织标本,最后组织学检测、油红0染色定性。5.VEGF165促进工程化脂肪血管新生准备三组植入物:Ⅳ组为成脂分化的ASCs和支架,Ⅴ组为EGFP基因转染的ASCs、成脂分化的ASCs和支架,Ⅵ组为VEGF165基因转染的ASCs、成脂分化的ASCs和支架。分别植入同一裸鼠皮下。按2w、12w取新生标本,通过大体观察、HE染色和免疫荧光观察新生组织结构和血管生长情况。结果1.吸脂物液态部分分离培养的ASCs形态类似于成纤维细胞,具有很强的增殖及多向分化能力。在脂肪、成骨及成软骨分化诱导培养基的作用下,分化出成熟的脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞,油红0、茜素红染色和阿新蓝染色阳性。实验检测到细胞表面抗原分子CD29、CD44持续表达,说明ASCs具有干细胞特性。2.Ad.EGFP可成功进入ASCs。24h可见绿色荧光,5d荧光表达强度明显较高,ASCs传代后仍有强荧光表达。转染ASCs后,不影响其增殖活性。MOI为0、10、20、30、50、100时转染率分别为0%,10.3%,26.6%,47.6%,94.7%,96.8%。3.经免疫荧光和ELISA检测证实腺病毒能成功地将人VEGF165基因转染至人ASCs中,并获得有效的表达。4.支架与ASCs有良好的相容性及黏附性,对细胞无毒性,不影响细胞增殖。8w时,Ⅰ组植入物已降解,Ⅱ和Ⅲ组均有新生组织形成,Ⅱ组新生物平均湿重为18.83±0.71mg,Ⅲ组新生物平均湿重为21.10±1.16mg;Ⅲ组比Ⅱ组形成的脂肪组织结构更完整及更多。Ⅱ和Ⅲ组相互间均有统计学意义（P＜0.05）。常规病理切片及油红0染色均证实有脂肪组织形成,EGFP荧光显色阳性。5.术后2w,Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ组的脂肪组织存活湿重分别为20.85±1.35mg,22.52±0.75mg,22.95±0.79mg。Ⅳ与Ⅵ组,P＜0.01;Ⅳ与Ⅴ组P＜0.05;Ⅴ与Ⅵ组,P＞0.05。血管计数显示:组Ⅳ的血管密度为6.50±2.07个/HPF;组Ⅴ为9.56±2.73个/HPF;组Ⅵ为12.00±2.45个/HPF。术后12w,Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ组的脂肪组织存活湿重分别为13.53±1.16mg,21.20±1.00mg,22.80±0.72mg;Ⅳ与Ⅴ、Ⅵ组,P＜0.01;Ⅴ与Ⅵ组,P＜0.05;Ⅵ组与Ⅴ组脂肪组织血管密度有显着差异（P＜0.01）,均高于Ⅳ（P＜0.01）。血管计数显示:11.11±1.94个/HPF;组Ⅴ为15.55±2.77个/HPF;组Ⅵ为18.39±3.73个/HPF。在体内,ASCs这些细胞表达内皮细胞表面标记——CD31,参与血管的形成。讨论种子细胞的大量获取是构建组织工程脂肪核心问题之一。在脂肪组织中已被证实包含具有多向分化潜力的细胞,并有研究已经证实在脂肪基质中包含有多能干细胞。这种干细胞被命名为脂肪组织来源干细胞,缩写为ASCs。本实验从抽脂术液态部分成功获取ASCs。ASCs作为种子细胞与其他细胞相比具有相当的优越性,该细胞来源广泛、取材容易,大量获取,受干扰小。组织工程另一核心内容是寻找具有组织再生潜力的支架材料。在生物材料方面,已开发和研制了适用于不同组织构建的生物支架材料。各类材料都具有各自的优点和缺点,而胶原蛋白在组织工程构建中作为支架材料的效果已被肯定。在这个实验中,显示胶原蛋白作为支架材料与ASCs有良好的相容性及黏附性,对细胞无毒性,不影响细胞增殖。同时,细胞标记一直是困扰组织工程技术修复机制研究的一大难题,其在干细胞来源的种子细胞的缺损修复研究中尤为重要。寻找一种直观、长期稳定,同时不影响细胞组织形成能力的标记方法非常重要。在本实验中,EGFP对ASCs成功进行了标记,且具有上述优点。另外,VEGF应用方式一般可分为直接应用和间接应用。直接应用VEGF有其局限性:①VEGF价格昂贵;②难以在体内保持持续的有效浓度;③不能自我调节。若因子不能持续有效地支持新生血管网的形成,就不能防止血管形成后的退化和塌陷。而间接应用是利用基因转染技术将基因整合进宿主细胞,将一些能产生VEGF的细胞种植在局部组织,使其在较长时间内持续、稳定地产生VEGF。能很好地克服直接应用的缺陷。在这个实验中,我们利用基因转染技术,通过基因载体——腺病毒把VEGF165基因成功转入ASCs内,ASCs能大量、稳定且持续较长时间分泌VEGF。本实验结果表明,通过腺病毒介导,将VEGF165基因转染到体外培养的人ASCs中,应用脂肪组织工程植入物联合移植裸鼠皮下的动物实验模型,发挥了基因的治疗性血管形成作用,促进了工程化脂肪组织的血管新生,血供的及时重建,进而提高其移植存活水平及存活质量。同时通过大体标本及组织学检测,未发现有血管瘤等病变发生,提示此治疗是安全的。另外,在体内,ASCs这些细胞表达内皮细胞表面标记,具有向内皮细胞分化的潜能,参与血管形成,从而促进组织工程脂肪的快速血管化。使再生的脂肪组织内部获得血供能力而保证其长期稳定存活,从而提高组织工程脂肪成活水平具有可操作性。结论:1.从成人脂肪抽吸物液体部分中获取的ASCs,从采集到培养都具有明显优势,将会为脂肪组织工程提供比较理想的种子细胞。2.腺病毒是较好的基因载体,是一个高效、安全快捷的基因修饰操作系统,EGFP在ASCs中能持续稳定表达,将为基因治疗和细胞示踪提供有效的实验方法。3.转染VEGF165基因的ASCs能大量、稳定且持续较长时间分泌VEGF,能为血管形成提供丰富稳定的血管生成因子。4.从抽脂术液态部分获取的ASCs能够满足脂肪组织工程的种子细胞要求,而所选用的Ⅰ型胶原支架能在裸鼠体内降解吸收,在体内能成功构建脂肪组织。5.转染VEGF165基因的ASCs具有促进工程化脂肪组织的血管化,具有向内皮细胞分化的潜能,参与血管形成,使得内皮细胞需要的数量相对减少,增加了脂肪组织工程在临床上应用的可能。
胡运生,马保安,李文海,张勇,范清宇[8]（2007）在《绿色荧光蛋白标记基因体内示踪骨髓间充质干细胞的分化》文中研究指明目的利用绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）标记技术,观察组织工程骨在体内形成过程中种子细胞的变化与转归。方法Adeno-XTM-GFP扩增和纯化后,测定病毒滴度,感染新西兰大白兔骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）,倒置相差显微镜观察细胞形态变化,并在荧光显微镜下观察GFP表达情况。确认标记成功后,将其与未标记的兔MSCs共同成骨诱导培养3周后,接种于磷酸钙骨水泥（calcium phosphate cement,CPC）-纤维蛋白胶（fibrin glue,FG）复合支架材料,构建组织工程骨作为实验组,回植于供体兔皮下。单纯CPC-FG复合支架材料植入对称部位作为对照。术后1、2、3周行碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性测定;4周,激光共聚焦显微镜下对GFP进行示踪观察和型胶原、骨钙素（osteocalcin,OC）免疫组织化学检测成骨细胞功能蛋白,Masson染色观察新骨形成。结果Adeno-XTM-GFP经扩增和纯化后,病毒噬菌斑形成,测得病毒滴度为3×108pfu/ml。Adeno-XTM-GFP感染MSCs后96h,可见GFP表达,感染率达50%70%,细胞分裂增殖基本正常。术后1、2、3周,实验组ALP活性分别为12.546±1.091、16.567±0.659和20.443±0.706,对照组分别为0.453±0.113、0.243±0.018和0.308±0.056,差异有统计学意义（P<0.05）。4周,实验组大体可见组织工程新骨形成,对照组未见新骨形成;组织学显示实验组新生骨小梁围绕材料孔隙形成,CPC-FG复合支架材料部分降解;实验组型胶原、OC免疫组织化学结果阳性,对照组未见阳性染色;实验组可见新生组织内有GFP标记的细胞。结论组织工程骨组织结构与松质骨小梁类似,新生组织表达GFP,提示组织工程骨组织的形成来源于接种的细胞。
朱巍[9]（2007）在《转基因骨髓间充质干细胞与去细胞支架构建组织工程韧带的实验研究》文中研究说明目的:探索行之有效的组织工程韧带（tissue-engineered ligament,TEL）构建方法。方法:（1）构建携带人碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）基因和增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,eGFP）报告基因的重组腺病毒载体Ad.bFGF-eGFP,并进行鉴定、扩增。（2）分离、培养兔骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）,利用Ad.bFGF-eGFP转染兔BMSCs,观察BMSCs表达、分泌bFGF的情况,及bFGF对BMSCs增殖、分化及产生韧带特异性细胞外基质的影响。（3）采用0.01%胰蛋白酶+1%DCA+核酸酶法及TBP法对兔髌韧带行去细胞处理,并进行组织学及生物力学检测,探索最佳的韧带去细胞方法,构建去细胞彻底、胶原结构保持完整、力学性能良好的去细胞韧带支架。（4）将转染Ad.bFGF-eGFP的BMSCs种植于去细胞韧带支架上,体外构建组织工程韧带,观察种子细胞在支架上的生长、增殖情况。结果: （1）成功构建Ad.bFGF-eGFP,其中含有eGFP报告基因;（2） Ad.bFGF-eGFP转染BMSCs后,bFGF蛋白大量表达、分泌,且显着促进BMSCs增殖并向成纤维细胞表型分化及加强韧带特异性细胞外基质的产生;（3）利用0.01%胰蛋白酶+1%DCA+核酸酶方法可完全去除韧带细胞成分,所得去细胞韧带支架力学性能良好、胶原结构保持完整,优于TBP法;（4）转基因BMSCs在去细胞韧带支架上生长良好,增殖显着高于对照组。结论:（1）经转染Ad.bFGF-eGFP改造的BMSCs增殖、向成纤维细胞表型分化及产生韧带特异性细胞外基质的能力显着增强,符合构建TEL种子细胞的要求;（2） 0.01%胰蛋白酶+1%DCA+核酸酶法对韧带作去细胞处理,可构建去细胞彻底、胶原结构保持完整、力学性能良好的TEL支架;（3）利用转基因BMSCs与去细胞韧带支架体外构建TEL可行。
李华壮[10]（2006）在《TGF-β1基因修饰的骨髓间充质干细胞/胶原海绵复合移植修复兔退变椎间盘的实验研究》文中指出下腰痛是当今世界所面临最大的医学和社会问题之一。椎间盘退变是导致下腰痛最主要的原因,一旦开始退变,则难以逆转。椎间盘退变虽是一种自然现象,但过快过重的椎间盘退变所带来的诸多临床难题,目前尚缺乏有效的治疗方法。传统的治疗方法,包括保守治疗和手术治疗,虽然可在一定程度上缓解由椎间盘退变引起的临床症状,但每种方法都有其局限性,如保守治疗时症状顽固存在、难以缓解,手术治疗花费昂贵,且有发生并发症的危险。另外,这些治疗方法主要是针对椎间盘退变的临床症状,而非针对椎间盘退变本身。近年来有关椎间盘退变的研究主要集中在有关椎间盘退变的病理生理机制和延缓椎间盘的退变上。然而,仍没有合适的方法广泛用于临床。因此,研究者开始将更多的注意力放在了组织工程椎间盘的开发和研究上。组织工程成功与否取决于以下三个关键性制约因素:种子细胞,支架材料以及有助于细胞生长、分化的外在环境。其中种子细胞一直是组织工程研究的核心问题,理想的种子细胞应该具有容易获得、容易在体外培养增殖、长期传代不改变生物学特性、抗原性小、组织修复能力强等特征。骨髓间充质干细胞（MSCs）是在骨髓中发现的未分化细胞。它们有向间叶来源的连接组织细胞分化的独特能力。它们的分化能力主要受它们所处的环境控制。诱导骨发生、软骨发生、脂肪形成的条件已经建立。据报道间充质干细胞已在各种领域成功进行移植。几项研究已报道用植入MSCs的胶原凝胶和海绵胶移植修复关节软骨缺损。目前,椎间盘细胞体外研究显示大部分椎间盘细胞有与软骨细胞相同的合成蛋白聚糖抗原决定基的能力和表达软骨样行为的细胞形态学。尽管有报道说椎间盘细胞是残存的脊索细胞,但脊索细胞仅在动物和年轻人髓核中发现,并不表现软骨样行为,从这些事实看,可以假定大部分椎间盘细胞来源于间叶细胞。TGF-β1具有多重生物学效应,它不仅是调控MSCs增殖和向成软骨方向定向分化的主要生长因子之一,而且可抑制多种炎症介质的生物学活性,使同种异体细胞移植更为安全,故TGF-β1是修复软骨类细胞功能障碍的良好生长因子。将自体MSCs移植于椎间盘中的能否存活和增殖?MSCs能否作为种子细胞应用
二、腺病毒绿色荧光表达载体追踪皮肤组织工程种子细胞的转归（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、腺病毒绿色荧光表达载体追踪皮肤组织工程种子细胞的转归（论文提纲范文）
（1）活体生物发光成像追踪大鼠跟腱内移植干细胞（论文提纲范文）
| 0 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 实验动物数量分析 |
| 2.2 脂肪源性干细胞的分离、培养和鉴定 |
| 2.3 缺陷型腺病毒载体转染后脂肪源干细胞的形态变化及增殖情况 |
| 2.4 活体生物发光成像结果 |
| 2.5 跟腱切片荧光显微镜观察 |
| 2.6 不良反应 |
| 3 讨论 |
（2）应用去分化脂肪细胞构建工程化脂肪组织的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 去分化脂肪细胞分化过程中相关基因的检测分析 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 DA体外Ad.EGFP荧光标记及观察标记物对细胞生物性状的影响 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 DA与Ⅰ型胶原蛋白、纤维蛋白胶支架生物相容性的体外实验研究 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第四部分 DA复合Ⅰ型胶原蛋白、可注射性纤维蛋白胶为支架构建组织工程脂肪的体内实验研究 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词对照表 |
| 攻读学位期间的成果 |
| 致谢 |
| 统计学证明 |
（3）组织工程骨原位构建修复股骨缺损的示踪研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 慢病毒载体介导的荧光蛋白报告基因对兔骨髓间充质干细胞的修饰 |
| 第一节 材料与方法 |
| 第二节 结果 |
| 第三节 讨论 |
| 第四节 小结 |
| 第二章 双重荧光蛋白报告基因示踪血管神经化组织工程骨的体内构建 |
| 第一节 材料与方法 |
| 第二节 结果 |
| 第三节 讨论 |
| 第四节 小结 |
| 第三章 利用eGFP和mRFP荧光蛋白转基因小鼠原位构建组织工程骨的初步示踪研究 |
| 第一节 材料与方法 |
| 第二节 结果 |
| 第三节 讨论 |
| 第四节 小结 |
| 第四章 荧光基因标记技术在骨组织工程中的应用(综述) |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 本研究的创新点、不足之处和展望 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
| 统计学审稿证明 |
（4）慢病毒载体介导hTERT基因修饰的人羊膜上皮细胞重建角膜表层的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 1 组织工程化角膜表层重建的研究现状 |
| 2 人羊膜上皮细胞(human amniotic epithelium cells,hAECs)的研究进展 |
| 3 人端粒酶催化亚基(hTERT)的研究现状和研究进展 |
| 4 慢病毒载体的简介与研究进展 |
| 5 标记基因-绿色荧光蛋白(GFP) |
| 6 本研究的目的和意义 |
| 参考文献 |
| 第一章 人羊膜上皮细胞(hAECs)的体外培养和其生物学鉴定 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附图及说明 |
| 第二章 真核表达载体pLenti6/V5-DEST-hTERT-EGFP的构建 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附图及说明 |
| 第三章 慢病毒表达载体pLenti6/V5-DEST-hTERT-EGFP的转染和表达 |
| 引言 |
| 1 慢病毒表达载体pLenti6/V5-DEST-hTERT-EGFP转染hAECs |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附图及说明 |
| 2 pLenti6/V5-DEST-hTERT-EGFP基因在转基因hAECs中的表达 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附图及说明 |
| 第四章 应用hTERT基因修饰的hAECs重建角膜表层的实验研究 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附图及说明 |
| 全文总结 |
| 问题和展望 |
| 英文缩略词 |
| 在读期间发表的文章 |
| 致谢 |
（5）磁标记骨髓间充质干细胞构建组织工程软骨MRI活体示踪技术研究（论文提纲范文）
| Abstract |
| 中文摘要 |
| 论文正文 磁标记骨髓间充质干细胞构建组织工程软骨MRI 活体示踪技术研究 |
| 前言 |
| 第一部分 体外纳米磁标记BMSCs 与MRI 示踪磁标记细胞的实验研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 MRI 活体示踪磁标记兔BMSCs 自体皮下移植的实验研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 MRI 示踪磁标记BMSCs 修复兔膝关节自体软骨缺损的实验研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 全文结论 |
| 致谢 |
| 照片 |
| 参考文献 |
| 文献综述一 骨髓间充质干细胞标记及活体示踪技术研究进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 活体MRI 示踪磁性标记骨髓间充质细胞 |
| 参考文献 |
| 博士研究生期间参与科研学术情况 |
| 英文论着 |
（6）腺病毒介导CTLA4Ig和CD40Ig基因转染对人皮肤成纤维细胞免疫性能影响的体外研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 文献综述 |
| 第二部分 论文正文 |
| 1 前言与实验方案 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 实验方案 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 结果 |
| 3.2 讨论 |
| 4 全文小结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（7）VEGF165基因转染脂肪干细胞促进工程化脂肪组织的血管化研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 一 研究背景及方向 |
| 二 课题总体设计 |
| 第一章 脂肪来源干细胞分离培养及鉴定 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 结论 |
| 第二章 Ad.EGFP转染并标记ASCs的研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 Ad.VEGF_(165)转染ASCs及其表达 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 第四章 Ⅰ型胶原为支架与ASCs构建工程化脂肪组织的研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料 |
| 4.3 方法 |
| 4.4 结果 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 结论 |
| 第五章 VEGF_(165)促进工程化脂肪组织的血管化研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 结论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 中英文缩略词对照表 |
| 攻读学位期间的成果 |
| 致谢 |
（9）转基因骨髓间充质干细胞与去细胞支架构建组织工程韧带的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要英文缩写 |
| 详细摘要 |
| 前言 |
| 一、研究背景 |
| 二、课题总体设计 |
| 参考文献 |
| 第一部分携带人bFGF 基因重组腺病毒载体Ad.bFGF-eGFP 的构建 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 Ad.bFGF-eGFP 转染BMSCs 后bFGF 蛋白表达、分泌及其对BMSCs增殖、分化及产生细胞外基质的影响 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 去细胞支架的构建 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 组织工程韧带的体外构建 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述1：韧带和肌腱修复的组织工程研究进展 |
| 综述2：韧带和肌腱修复的基因治疗进展 |
| 研究生在读期间主要学术活动 |
| 致谢 |
| 附录 |
（10）TGF-β1基因修饰的骨髓间充质干细胞/胶原海绵复合移植修复兔退变椎间盘的实验研究（论文提纲范文）
| 英文缩写词表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 论文正文 FGF-β1基因修饰的骨髓间充质干细胞／胶原海绵复合移植修复兔退变椎间盘的实验研究 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 兔骨髓间充质干细胞的分离纯化、体外培养及诱导鉴定 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 骨髓间充质干细胞在椎间盘中的存活及增殖能力的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 Ad-hTGF-β1对骨髓间充质干细胞的转染及hTGF-β1基因在体外、体内的表达 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分 rGF-β1基因修饰的骨髓间充质干细胞／胶原海绵复合物移植修复兔退变椎间盘的组织工程学可行性研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 致谢 |
| 照片 |
| 文献综述 椎间盘退变的发生机制及椎间盘组织工程研究进展 |
| 参考文献 |
| 博士研究生期间发表的文章 |
四、腺病毒绿色荧光表达载体追踪皮肤组织工程种子细胞的转归（论文参考文献）
- [1]活体生物发光成像追踪大鼠跟腱内移植干细胞[J]. 黄德清,Gary Balian. 中国组织工程研究, 2013(23)
- [2]应用去分化脂肪细胞构建工程化脂肪组织的实验研究[D]. 廖云君. 南方医科大学, 2011(04)
- [3]组织工程骨原位构建修复股骨缺损的示踪研究[D]. 江汕. 南方医科大学, 2010(08)
- [4]慢病毒载体介导hTERT基因修饰的人羊膜上皮细胞重建角膜表层的实验研究[D]. 金玲. 暨南大学, 2009(09)
- [5]磁标记骨髓间充质干细胞构建组织工程软骨MRI活体示踪技术研究[D]. 金旭红. 第三军医大学, 2008(03)
- [6]腺病毒介导CTLA4Ig和CD40Ig基因转染对人皮肤成纤维细胞免疫性能影响的体外研究[D]. 孔永. 西南大学, 2008(09)
- [7]VEGF165基因转染脂肪干细胞促进工程化脂肪组织的血管化研究[D]. 杨波. 南方医科大学, 2008(06)
- [8]绿色荧光蛋白标记基因体内示踪骨髓间充质干细胞的分化[J]. 胡运生,马保安,李文海,张勇,范清宇. 中国修复重建外科杂志, 2007(06)
- [9]转基因骨髓间充质干细胞与去细胞支架构建组织工程韧带的实验研究[D]. 朱巍. 第二军医大学, 2007(03)
- [10]TGF-β1基因修饰的骨髓间充质干细胞/胶原海绵复合移植修复兔退变椎间盘的实验研究[D]. 李华壮. 第三军医大学, 2006(11)