一、乙型肝炎病毒的亚克隆及其应用（论文文献综述）
罗煜杭[1]（2021）在《戊型肝炎病毒ORF3蛋白单克隆抗体的制备及其应用》文中进行了进一步梳理戊型肝炎（Hepatitis E）是一种由戊型肝炎病毒（HEV）引起的自限性疾病。大多数个体感染后若干周内能够自行康复,但在器官移植患者、血液肿瘤患者和HIV感染者中,HEV感染后将会引起慢性肝炎,并迅速发展为肝纤维化和肝硬化,同时伴有病毒性脑炎、后循环缺血、周围神经病变等肝外症状。在我国,HEV-1和HEV-4是造成戊型肝炎的主要病原体。其中,HEV ORF3蛋白在病毒感染早期表达且会引起体内抗体的产生,因此抗ORF3蛋白抗体的滴度检测可以作为早期急性感染、慢性感染或准包膜状态的辅助诊断指标。目前市面上HEV商品化检测试剂盒主要利用间接ELISA方法进行检测,其灵敏性和特异性较高,可以同时检测HEV-1到4型,但该方法对包被抗原的纯度要求较高,且无法进行不同基因型鉴别诊断。基于此,本研究选取基因1型HEV的代表株SAR55,利用原核表达系统表达可溶性HEV-1 ORF3SAR55重组蛋白,并利用该蛋白免疫小鼠,通过杂交瘤融合技术筛选制备了抗HEV-1的ORF3蛋白的单克隆抗体,并通过与HEV-3和HEV-4 ORF3抗原交叉反应筛选得到1株抗HEV-1 ORF3蛋白特异性的单抗,并进行HRP标记,利用标记的HRP蛋白建立了检测人血清中抗HEV抗体的竞争ELISA,为HEV感染的临床诊断提供了新方法。本研究的主要内容和结果如下:1.成功构建了pET-21b-ORF3SAR55重组质粒,将其导入表达菌BL21（DE3）进行诱导表达,SDS-PAGE分析表明成功表达出与预期大小一致14 k Da的可溶性ORF3SAR55重组蛋白;利用Ni柱亲和层析法进行纯化,得到了纯度较高的ORF3SAR55重组蛋白,产量约为32 mg/L。2.利用ORF3SAR55重组蛋白免疫Balb/c小鼠,冲击免疫一周后采集脾脏进行细胞融合,并通过i ELISA及亚克隆筛选,获得3株稳定分泌ORF3SAR55抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为3C11,1D2和8H8。将杂交瘤细胞腹腔注射给小鼠10天后收集腹水,利用Protein G beads纯化后成功获得了单克隆抗体,同时对单抗亚型进行鉴定,结果显示3C11属于Ig G2b,1D2和8H8均属于Ig G2a,且与HEV-3和HEV-4 ORF3蛋白交叉反应显示,单抗1D2与HEV-1 ORF3蛋白特异反应,不同其它基因型的反应。3.将单抗1D2与HRP进行体外标记,然后利用HRP-1D2为竞争试剂,ORF3SAR55蛋白为包被抗原,建立了HEV抗体检测的竞争ELISA。该方法的抗原最佳包被量为50μg/孔,HRP-1D2（1 mg/m L）最佳稀释度为1:1000,血清最佳稀释比为1:10,反应时间为37℃1 h;其敏感性为100%,特异性为99.2%;板内板间变异系数为1.38%～7.13%。并且与基因3型HEV抗体阳性兔血清和4型阳性猪血清无竞争性。综上所述,本研究成功筛选和制备了抗基因1型HEV ORF3蛋白的单抗,并成功偶联HRP,利用该HRP标记单抗建立了检测人血清中HEV抗体的竞争ELISA方法,为临床中HEV感染的检测提供了新的方法。
鲁友铭[2]（2020）在《基于氧化石墨烯特种光纤光栅生物传感器的肝癌患者血清sPD-L1、AFP快速检测方法研究》文中提出肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）约占原发性肝癌的90%以上,是最常见类型的原发性肝癌（primary hepatic carcinoma）,HCC是全球范围内第五大癌症,且为全球致死率第三大癌症。肝癌的预后较差,而且有很高的复发风险,对HCC早期诊断显得尤为重要。甲胎蛋白（alpha-fetoprotein,AFP）作为HCC早期诊断的标记物已被普遍使用多年,但AFP诊断肝癌的敏感性仅为60%70%,它的临床诊断价值极其有限。近年来诸多研究表明可溶性程序性死亡因子配体1（sPD-L1）在肝细胞癌患者的血清中较健康人血清呈现显着性差异,预示着sPD-L1可以作为HCC临床诊断的辅助性血清标志物。大量研究证实肝癌标志物联合检测可显着提高敏感性和诊断的准确性。目前血清标志物检测方法主要包括酶联免疫吸附技术（ELISA）、免疫胶体金技术、蛋白质芯片法、化学发光免疫分析法等。其中ELISA法实验步骤繁琐,耗时耗力,结果易受外部因素影响。免疫胶体金技术检测灵敏度不高,只能定性,不能定量,蛋白质芯片法对实验室设备要求较高,且仪器设备价格昂贵。化学发光免疫分析法消耗样本少、操作简便、且检测结果较为准确,但需要患者承担高昂的检测费用。因此探索高效、特异、准确、低成本的检测技术对于肝癌的快速诊断具有十分重要的意义。目前肝癌标志物的血清学检测主要依赖于抗原抗体反应,但国内的肝癌血清标志物抗体产品质量参差不齐,进口产品价格较昂贵。制备高效价、特异性强、低成本的肝癌血清标志物抗体可为肝癌的早期快速诊断提供有效的试剂。极大角度光纤光栅（excessively tilted fiber grating,Ex-TFG）生物传感器具有检测灵敏度高、特异性好、无需标记、成本低、可实现实时检测的优点。前期本实验室已成功将Ex-TFG生物传感器运用于心力衰竭生物标记物N末端脑钠肽前体（NT-proBNP）、猪圆环病毒2型（PCV2）、新城疫病毒（NDV）、禽流感病毒（AIV）和降钙素原（PCT）的检测,将抗原抗体反应的特异性与光纤光栅传感器检测的敏感性结合,在检测的灵敏度上取得了突破,并发表了高水平研究论文。本文通过对前期研制的Ex-TFG生物传感器进一步进行改进,以提高其检测灵敏度、稳定性和特异性。本文通过原核表达系统制备血清标志物蛋白AFP、sPD-L1,将sPD-L1采用长程免疫法免疫BALB/c小鼠,利用聚乙二醇（PEG）细胞融合技术制备抗sPD-L1单克隆抗体,为HCC的早期快速诊断提供有效试剂。对Ex-TFG进行羟基化、硅烷化修饰后,在光栅表面涂覆金纳米壳（AuNS）与氧化石墨烯（GO）。并活化GO表面的羧基（-COOH）。使其与抗体通过-NH-CO-共价键结合。利用脱脂奶粉对光栅表面空余位点进行封闭,进行不同浓度抗原的检测,并对传感器的重复性,特异性,临床样本检测等进行验证。从而初步建立起一种基于Ex-TFG生物传感器的血清标志物快速检测技术,为肝癌的快速诊断提供新的检测手段。本文的研究内容如下:（1）根据GenBank发布的人源PD-L1基因序列（GenBank登录号:AY254342.1）,AFP基因序列（GenBank登录号:NM001134.2）分别对序列分析后进行大肠杆菌密码子偏好性优化,使其适合于大肠杆菌表达系统。化学合成法分别合成全长目的基因sPD-L1、AFP。并将其分别连接至质粒载体pET28a（+）。从而构建重组质粒sPD-L1-pET28a（+）、AFP-pET28a（+）。将重组质粒分别转化至大肠杆菌感受态细胞BL21（DE3）进行诱导表达,并对诱导表达条件进行优化。利用镍柱对目的蛋白进行亲和层析,利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、二喹啉甲酸（BCA）法、蛋白免疫印迹（Western blot）对纯化所得的重组蛋白sPD-L1、AFP进行纯度、浓度、特异性鉴定。（2）将上述制备所得的重组蛋白sPD-L1与佐剂进行乳化,作为免疫原对BALB/c小鼠进行长程免疫。取4次免疫后的小鼠脾脏制成脾细胞悬液,与SP/20细胞混合,采用PEG法进行细胞融合。采用间接ELISA法,对融合细胞及亚克隆后的细胞进行两轮以上筛选。将筛选得到的单克隆阳性细胞株进行扩大培养,注射入BALB/c小鼠腹腔从而制备腹水型单克隆抗体。对单克隆细胞株进行抗体亚型鉴定,利用Protein A柱对腹水型单抗进行纯化,利用SDS-PAGE、二喹啉甲酸（BCA）法、蛋白免疫印迹（Western blot）和酶联免疫吸附测定（ELISA）对纯化所得的腹水型单抗进行鉴定。（3）利用5%的HNO3、无水乙醇、离子水（RO）对光栅进行洁净化处理,取浓度为0.2M的NaOH溶液对光栅表面进行浸泡,使其表面富含大量的羟基（-OH）,从而实现羟基化。将羟基化的栅区表面浸没于适量的1%3-巯丙基三甲氧基（MPTMS）溶液使光栅表面带上巯基（-SH）从而实现硅烷化。将离心处理后的金纳米壳（AuNS）涂覆光栅表面过夜。金纳米壳氨基化后取200uL氧化石墨烯（GO）分散液浸泡栅区隔夜。利用1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）活化GO表面的羧基（-COOH）。分别修饰sPD-L1单克隆抗体以及AFP单克隆抗体,利用5%脱脂奶粉对光栅进行封闭处理,分别检测不同浓度的sPD-L1、AFP抗原,并对生物传感器的灵敏度、特异性、重复性等进行评价,再对临床血清样本进行测试分析。结果:（1）重组质粒pET28a（+）-sPD-L1、pET28a（+）-AFP经过酶切鉴定后,分别在668bp、1875bp处有明显的特异性条带出现,且测序结果与已知对应序列一致,说明重组质粒构建成功。重组菌株pET28a（+）-sPD-L1/BL21（DE3）在37℃,0.5mmol/L IPTG,9h的诱导条件下,目的蛋白sPD-L1的表达量最高;经过SDS-PAGE鉴定显示,重组蛋白sPD-L1、AFP的沉淀表达量均高于上清表达量。经过镍柱亲和层析后的目的蛋白sPD-L1、AFP纯度均能达到90%以上且浓度分别能够达到945.7ug/mL以及191.1ug/mL,经过Western blot鉴定显示,目的蛋白sPD-L1、AFP能够分别与相应的市售单克隆抗体发生良好的结合,且于28KD以及75KD左右有特异性条带出现。（2）细胞融合实验显示,细胞融合率为86.7%,阳性率为80.4%,经过两轮亚克隆筛选共获得4株单克隆细胞株,分别命名为1-3H,2-2G,2-9G,1-10C。单抗亚型鉴定结果表明1-10C、2-2G为IgG2b型、2-9G为IgG2a型。SDS-PAGE鉴定显示纯化后的腹水型单抗于50KD、25KD位置出现条带,与IgG型抗体重链、轻链条带相符。经过BCA法浓度测定,纯化后的腹水单抗浓度较高,达到2.064mg/mL。ELISA鉴定结果显示2-2G、2-9G腹水单抗效价均能够达到1:2048000以上。4株杂交瘤细胞株经反复冻存、复苏及多次传代,均能分泌高效价抗体,经Western blot鉴定后证实所获得单抗是特异性针对sPD-L1抗原。（3）极大角度光纤光栅经过光纤表面羟基化、硅烷化、涂覆金纳米壳、氨基化、涂覆氧化石墨烯、活化羧基、修饰sPD-L1抗体、封闭后进行测试分析,结果显示其各步骤的波长红移量为:0.235nm、0.255nm、0.866nm、0.006nm、0.64nm、0.076nm、0.3nm、0.04nm。表明各步骤修饰均较为理想。该生物传感器对sPD-L1抗原的检测下限为1pg/mL。检测范围为1pg/mL10ng/mL。对极大角度光纤光栅表面经过上述羟基化至活化羧基修饰过程最后修饰AFP抗体、封闭后进行测试分析,结果显示其各步骤的波长红移量为0.225nm、0.047nm、0.832nm、0.736nm、1.152nm、1.168nm、1.408nm、1.68nm,修饰结果较为理想,检测范围为5 pg/mL10ng/mL。经过特异性实验显示,其与不同浓度的布鲁氏菌病血清学标志物BP26蛋白均不发生特异性反应,表明此传感器特异性良好。利用研制的免疫传感器分别对肝癌患者和健康人血清中的AFP、sPD-L1进行检测,结果显示肝癌患者血清和健康人血清的谐振波长偏移量在两种标志物的检测中均存在显着性差异,并在同一患者中AFP和sPD-L1检测结果呈现一定的正相关性,表明该传感器对AFP、sPD-L1检测具有高度的特异性,可满足临床检测要求。结论:本研究构建了sPD-L1、AFP基因工程菌,并成功实现了在原核表达系统中高效表达sPD-L1、AFP蛋白。通过长程免疫法进行抗原免疫、PEG法细胞融合、有限稀释法亚克隆筛选后得到了4株能稳定分泌抗sPD-L1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,利用制备的抗原、抗体,初步建立了基于极大角度光纤光栅生物传感器的AFP、sPD-L1快速检测方法,并对传感器的灵敏度、重复性,特异性以及临床应用等进行了测试,该方法具有较高的灵敏度、特异性强、可重复性较好等优点,可用于血清样品中的AFP、sPD-L1检测,为肝癌的诊断提供了新的检测技术和手段。
张晓晨[3]（2018）在《基于乙型肝炎病毒两表位肽段组合的ELISA检测方法研究》文中提出乙型肝炎是全球关注的传染病之一,是由乙型肝炎病毒（HBV）感染所致。有研究表明,HBV表面大蛋白前S1区（PreS1）在病毒感染宿主细胞过程中发挥重要作用,因此,针对PreS1的抗体检测受到广泛关注。目前特异性抗体主要采用酶联免疫吸附试验方法进行检测,但由于乙型肝炎患者群感染的HBV基因序列复杂多变,临床实际应用仍缺乏精确有效的抗体检测方法。本研究应用分子仿生学思想,以人体内多克隆抗体的抗体存在环境为仿生原型,旨在基于前期利用多基因型肽段组合包被检测患者PreS1 94‐117表位抗体（P94抗体）的研究基础,通过PreS1关键表位（21‐47和94‐117表位）肽段的组合包被模拟PreS1全长包被,检测PreS1抗体,为后续通过多基因型多表位肽段组合模拟大样本乙型肝炎患者群中HBV的复杂基因序列状态,开发适用于大样本群抗体检测的商品化试剂盒奠定基础。本研究首先通过对中国乙型肝炎患者群的基因分型研究,创新性地建立了一种基于关键表位氨基酸序列的基因分型方法。随后通过优化肽段组合包被方式,建立了仿生肽段组合检测P94抗体的间接酶联免疫吸附法（Enzyme‐Linked Immunosorbent Assays,ELISA）,并分别利用B和C基因型的P94肽段作为抗原,通过小鼠免疫法制备了三种针对不同基因型应答不同的单克隆抗体,作为定量化检测抗体的标准品。然后利用上述建立的ELISA方法检测了大量乙型肝炎患者血清样本中的P94抗体,对P94抗体含量与乙型肝炎患者HBV DNA载量和患病阶段进行了统计学分析。最后验证了组合包被PreS1两关键表位肽段检测抗体与包被全长蛋白检测抗体结果之间的一致性,为临床应用提供了支持。主要研究结果如下:（1）研究HBV基因分型。本文成功地对232例乙型肝炎患者进行了病毒测序分型,创新性地建立了基于氨基酸序列的基因分型方法,为利用关键表位的ELISA基因分型方法研究提供了理论依据。（2）建立并优化了P94抗体的ELISA检测方法。本文进一步优化了肽段组合检测P94抗体的包被浓度和方式,确定包被方式为B和C基因型P94肽段组合包被,其包被浓度为各5μg/mL。对单一包被B基因型、单一包被C基因型和组合包被两种基因型,这三种不同包被方式的ELISA检测方法进行分析,组合包被检测的平均变异系数显着低于单B或单C包被检测的平均变异系数,且具有较高的一致性,说明肽段组合包被的抗体检测方法重复性好且准确性高。（3）开发单克隆抗体以实现抗体检测定量化。本文制备了三种针对不同基因型应答不同的单克隆抗体,分别为对B和C基因型均应答的单抗B11、只对B基因型应答的单抗B19和只对C基因型应答的单抗C04,确定了阳性判断值,可实现P94抗体定量化检测。（4）分析了P94抗体与HBV DNA载量和患病阶段之间的相关性。本文检测了631例乙型肝炎患者血清中的P94抗体,并对乙型肝炎患者的P94抗体浓度、患病阶段以及HBV DNA载量进行了统计学分析。结果表明,当P94抗体为阳性时,P94抗体随着HBV DNA载量的升高而逐渐增加,但随着患者病情逐渐加重呈下降趋势。（5）建立了两表位肽段组合检测PreS1抗体的方法。本文对比了四种不同的包被方式（包被PreS1全长、单一包被P21表位肽段、单一包被P94表位肽段、组合包被P21和P94表位肽段）的抗体检测结果,并进行统计学分析,结果表明PreS1关键表位肽段的组合包被可有效地替代全长蛋白来实现PreS1抗体检测。
张婷玉[4]（2015）在《乙型肝炎病毒中国流行株C基因型稳定转染细胞模型的评价与应用》文中研究表明乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus,HBV）感染及其引起的一系列相关疾病是一种严重影响人类健康的全球性疾病,世界各国的科学家们从不同的方面对HBV感染的有效防治进行了大量的相关研究、探索和尝试。乙肝疫苗、干扰素（Interferon,INF）和核苷（酸）类似物（Nucleotide analogues,Nas）是现阶段防治慢性乙型肝炎病毒感染有效的主要手段,乙肝疫苗虽然可起到预防作用,但对已感染者、免疫耐受者和病毒逃逸株无效,而现阶段使用的抗病毒药物,存在副作用较大（干扰素）、易产生耐药（核苷类药物）、抗原血清转换率低等诸多缺点。建立细胞模型是研究病毒感染史、生物学特性、评价药物疗效、优化治疗方案、研究高效疫苗和开发新产品高效便捷的技术手段。现有的细胞模型包括病毒感染细胞模型、病毒瞬时转染细胞模型和病毒稳定转染细胞模型。对于病毒感染细胞模型,虽然近年发现了HBV的受体分子钠离子一牛磺胆酸共转运蛋白（Sodium taurocholate co-transporting polypeptide,NTCP）,但其感染效率仍然较低并且操作复杂,另外由于HBV严格的物种和组织特异性属性,限制了此种细胞模型的应用,病毒的瞬时转染系统在肝癌细胞中的病毒复制很难长期保持稳定,不适合实验的标准化的需要,如药物敏感试验。20余年来国内外已经建立了可以复制和分泌HBV病毒颗粒的稳定细胞系,如国际上公认的Hep G2.2.15细胞和Hep AD38细胞。其他实验室为了满足抗病毒耐药变异研究的需求,也相继建立起了耐药突变的HBV稳定复制细胞株,但仍然缺少我国流行的（B和C基因型）HBV毒株稳定复制细胞系和多重耐药细胞株;另外一些细胞株人为诱导的HBV突变细胞株,不能反映出病毒的自然遗传特征。因此,建立HBV中国流行株B和C基因型稳定复制细胞模型,符合我国临床实际,对于抗病毒药物的评价及乙肝防治方案的本土化具有积极作用。本实验室在前期的工作中通过联合应用PB转座子及其他技术构建了中国流行株C基因型野生株和耐药株的稳定转染细胞,本研究旨在对此稳转细胞的各项指标进行分析,并将其初步应用在体外抗HBV药效学评价上,期望该稳转细胞能够为抗HBV新药药效评价提供理想的细胞模型。目的:检测分析本实验室前期构建的HBV中国流行株C基因型稳转细胞:Hep G2.CW和Hep G2.LER细胞系的各项复制指标,评价该稳转细胞特性与经典HBV稳转细胞模型的差异;用临床常用核苷类药物来评价稳转细胞系用于药物评价的可靠性;设计用于表达新型小发卡rna（shorthairpinrna,shrna）的慢病毒载体,并考察其用于抗乙型肝炎病毒的可行性。方法:1、hbv稳定转染细胞特征分析:1)化学发光法定量检测hepg2.cw和hepg2.ler细胞上清hbv表面抗原（hepatitisbvirussurfaceantigen,hbsag）的表达和e抗原（hepatitisbviruseantigen,hbeag）的表达;2)荧光定量rcr法检测hepg2.cw和hepg2.ler细胞上清hbvdna的含量;3)酶联免疫吸附法定性检测胞内乙型肝炎病毒表面抗原和e抗原的表达;4)间接免疫荧光法检测胞内乙型肝炎病毒表面抗原的表达;5)间接免疫荧光法检测胞内乙型肝炎病毒核心抗原的表达;6)酶联免疫吸附法定性检测hepg2.cw和hepg2.ler细胞系细胞上清乙型肝炎病毒前s1抗原（hbvpres1）的表达。2、用临床常用核苷类药物来评价hepg2.cw和hepg2.ler细胞系用于药物评价的可靠性:选用我国三种临床常用核苷类药物:拉米夫定（lam）、恩替卡韦（etv）、阿德福韦酯（adv）,稀释为0、0.001、0.01、0.1、1、10、100μm的一系列的浓度梯度,分别作用于hepad38（阳性对照）、hepg2.cw和hepg2.ler三种细胞系,连续正常培养九天后用荧光定量rcr法检测三种细胞上清乙型肝炎病毒dna的含量。3、新型小发卡rna慢病毒表达载体的构建及抗乙型肝炎病毒应用评价:对慢病毒载体骨架sapi位点进行突变,并将用于表达新型小发卡rna的结构亚克隆到改造后的慢病毒载体;设计靶向hbv保守序列的shrna并克隆到该慢病毒载体,包装含有shrna序列的重组慢病毒并进行定量,考察单个及多个shrna结构串联对慢病毒滴度的影响;将重组慢病毒感染hbv稳定转染肝细胞系hepg2.cw（moi=3）,用氲稻霉素（blasticidin）筛选稳定克隆1周后,将其重新消化,并以1×105/孔接种于24孔板中,于铺板96h后取细胞上清检测hbsag、hbeag表达水平和hbvdna的含量。结果:1、稳定转染细胞特征分析结果:1)阳性对照hepg2.2.15细胞上清hbsag表达水平约为79ng/ml,hepg2.cw和hepg2.ler细胞上清hbsag表达水平约为85ng/ml和8ng/ml;2)阳性对照的hepg2.2.15细胞上清hbeag表达水平约为63ncu/ml,hepg2.cw和hepg2.ler细胞上清hbeag表达水平约为78ncu/ml和70ncu/ml;3)hepg2.cw和hepg2.ler细胞的hbvdna的含量均比阳性对照细胞hepg2.2.15高;4)hepg2.cw细胞胞内hbsag的表达水平比阳性对照hepad38细胞高,而hbeag的表达水平就比阳性对照hepad38细胞低;hepg2.ler细胞胞内hbsag和hbeag的表达水平均比阳性对照hepad38细胞低;5)hepg2.cw和hepg2.ler两种细胞系均有较好的表面抗原表达;6)hepg2.cw和hepg2.ler两种细胞系均有较好的核心抗原表达;7)阳性对照Hep AD38细胞上清HBV Pre S1表达水平OD值约为2.5,Hep G2.CW和Hep G2.LER细胞上清HBV Pre S1表达水平OD值约为3.5和0.8。2、用临床常用核苷类药物来评价Hep G2.CW和Hep G2.LER细胞系用于药物评价的可靠性,发现随着药物浓度的增加,阳性对照细胞Hep AD38和待评价细胞Hep G2.CW细胞上清HBV DNA的量均出现均匀的下降趋势;而Hep G2.LER细胞上清HBV DNA对LAM和ETV敏感度下降,ETV的作用也仅在药物浓度1μM之后对HBV DNA的量有一定抑制趋势,ADV在药物浓度0.1μM时即对HBV DNA的量有明显的抑制。3、构建了一种用于表达新型小发卡RNA的慢病毒载体,通过设计靶向HBV保守序列的sh RNA实现了HBV复制的高效抑制,发现两个和三个sh RNA串联效果优于单个sh RNA。结论:1、两种稳转细胞系Hep G2.CW和Hep G2.LER细胞能够稳定支持HBV的复制和表达;2、Hep G2.CW对三种临床常用抗乙肝核苷类药物均敏,Hep G2.LER细胞株对LAM和ETV敏感度下降;3、本文构建的新型sh RNA慢病毒表达载体可作为防治慢性病毒感染如HBV感染的潜在有效手段之一。
马星[5]（2014）在《荧光定量PCR检测乙型肝炎病毒DNA的研究》文中认为目的用荧光定量PCR对HBV-DNA载量进行实验性研究。方法扩增含有3个乙肝病毒基因组pBR322质粒中的乙肝病毒目的序列,并通过AT亚克隆至pBS-T载体中。经过筛选、鉴定及测序验证保证相对更高的拷贝数。对3个保守序列进行了常规PCR退火温度的优化和灵敏度的检测,建立荧光定量PCR反应体系从而制备标准曲线。结果曲线相关系数为99.5%,具有较高的可信度。负相关范围在5×1035×109copies/μl。不论是批内还是批间其变异系数值均小于5%。结论荧光定量PCR检测乙型肝炎病毒DNA可以灵敏度好,准确度高,应加大研究降低成本应用于检验应用。
李磊[6]（2009）在《乙型肝炎病毒慢性感染小鼠模型的建立及初步应用》文中研究说明目的：1．构建中国地区流行的B基因型HBV可复制性克隆，验证其在体内和体外的复制能力，为HBV复制相关研究及建立细胞和动物模型奠定基础。2．将具有良好复制能力的B基因型中国株HBV可复制性克隆亚克隆到腺相关病毒载体内，建立HBV慢性感染小鼠模型，同时建立A基因型HBV慢性感染小鼠模型。3．通过高压尾静脉注射的方法将逆转录病毒和非病毒shRNA表达载体导入到小鼠体内，比较其抗HBV的时效，以期获得较长期的HBV抑制效果。方法：1．以一例中国HBV B基因型感染患者来源的全基因克隆为母板，使用SapⅠ将HBV基因组切下后在体外自身环化。使用环化后的基因组为模板分两段分别扩增HBV1.3倍基因组片段，依次将其连接到克隆载体pBluescriptⅡKS（+）上获得含HBV1.3基因组的克隆。通过转染Huh7细胞系和高压尾静脉注射BAL B／cJ小鼠建立体外和体内HBV复制模型，采用ELISA、Southern Blot、Northern Blot以及免疫组织化学染色等方法检测HBV抗原分泌、复制中间体、转录子、抗原肝细胞内表达等情况，评价构建克隆的复制能力。2．将复制能力良好的HBV1.3倍基因组亚克隆到腺相关病毒载体pAAV-MCS内构建pAAV-HBV1.3质粒，体外转染Huh7细胞，检测其复制能力。采用高压尾静脉注射的方式将pAAV-HBV1.3克隆导入到C57 BL／6小鼠肝脏内，定期采血、取肝组织标本通过ELISA、Southern Blot、RT-PCR以及免疫组织化学染色等方法检测HBV抗原分泌、抗体产生、复制中间体、转录子、抗原肝细胞内表达等情况。同时使用Huang LR等报导的pAAV-HBV1.2克隆高压注射以建立A基因型的慢性感染小鼠模型。3．根据所构建的B基因型HBV可复制性克隆X区序列设计RNAi靶点，构建shRNA表达逆转录病毒载体，同pAAV-HBV1.3体外共转染Huh7细胞，筛选对HBV复制抑制效果较好的干扰靶点shRNA表达载体，并据此构建非病毒shRNA表达载体。将逆转录病毒及非病毒shRNA表达载体高压尾静脉注射导入小鼠肝脏，观察其抗HBV效果。结果：1．所构建的HBV1.3倍基因组克隆在Huh7细胞内和在BAL B／cJ小鼠可以正常分泌HBsAg和HBeAg，检测到复制中间体和转录子的产生。小鼠血清中可以检测到高滴度HBV DNA并随注射时间出现动态变化，小鼠肝细胞内可以检出呈胞浆型和胞膜型表达的HBcAg。2．pAAV-HBV1.3和AAV-HBV1.2两种克隆均可在C57 BL／6小鼠体内形成慢性HBV复制状态。在注射后的252天（A）／340天（QS）仍可在血清HBsAg阳性小鼠肝组织内检测到HBV复制中间体及HBV转录子的存在，肝细胞内有HBcAg表达，而HBsAg阴性的小鼠则无法检出。小鼠血清HBV DNA含量可维持在105-107 copies／mL水平，A组血清HBV DNA含量较QS组约高0.6-1.6log。但病毒血症持续时间不及QS组长，慢性化比例也低于QS组，注射24周时A组阳性率14.3％；QS组44.4％。3．非病毒shRNA表达载体干预组小鼠血清HBsAg阳性率、HBsAg含量、血清病毒滴度的有效抑制时间为1周以内。逆转录病毒shRNA表达载体干预组HBV抑制时间可持续4-6周，HBsAg阳性率在注射后前4周均保持在较低水平（18.2-27.3％），HBsAg含量下降第2周仍可达81.0％，血清病毒滴度下降1.619-2.758log，小鼠肝组织内HBcAg阳性细胞数目明显减少。两组的抑制效果均随着注射时间的延长而逐渐下降。结论：1．成功构建了B基因型HBV可复制性克隆，在体内外均具有良好的复制能力。2．建立了B基因型和A基因型的HBV慢性感染小鼠模型。3．直接高压尾静脉注射逆转录病毒shRNA表达载体可以有效延长RNAi作用时间，有效抑制时间可持续至少4周。本课题的创新点：1．首次构建了同我国流行情况相符合的B基因型HBV可复制性克隆，并建立了HBV慢性感染小鼠模型。2．证实通过高压尾静脉注射方式导入逆转录病毒shRNA载体可以有效抑制HBV复制持续达4周以上。本课题研究的意义：1．构建B基因型HBV可复制性克隆为研究B基因型HBV相关病毒变异、复制能力等HBV生物学研究提供了良好的基础。2．建立的B基因型和A基因型的慢性HBV感染小鼠模型，具有易获取、制备简单、费用低廉、具有正常的机体免疫功能等优点。为研究抗病毒治疗、HBV复制机制、HBV感染慢性化机制、免疫发病机制、免疫调节等基础和应用研究提供了良好的小动物模型。3．高压尾静脉直接将逆转录病毒shRNA载体导入体内即可达到较长期抑制靶基因表达，具有无需包装病毒、安全、有效、时程长、操作简便等优点。为特定基因功能研究、导入特定外源基因至体内表达、肝脏靶向性治疗等方面研究奠定基础。
杨志军[7]（2008）在《我国慢性传染病预防与治疗监测的经济学分析 ——以慢性乙型肝炎为例》文中研究指明传染病是世界范围内引起死亡最多的疾病,也是我国死亡率最高的三类疾病之一。医学技术的进展使传染病的预防与控制取得了重要成果。传染病预防与治疗监测进行经济学分析对传染病防治和医学技术发展策略的制定具有重要意义。本文的目的是建立传染病预防与治疗监测经济学分析的数学模型,并分析和评估我国慢性乙型肝炎的预防和治疗监测技术的经济学影响。本文的第一章为绪论,简要介绍了本文的研究背景、研究内容和研究方法以及拟解决的关键问题。同时对文章的结构安排进行了说明。本文的第二章为文献综述,对传染病的经济负担、卫生经济学中的评估工具、慢性传染病防治技术的发展、卫生经济学中关于生产和成本研究、新技术的扩散、新技术的评价以及我国慢性传染病防治研究的现状进行了综述,完整介绍了国内外在本文相关领域的研究成果,为本文的研究提供了充分的背景资料。本文第三章建立了模拟传染病扩散和估算我国慢性传染病经济负担的数学模型。传染病扩散模型可以估算人群中感染者、易感染和健康者的数量,估算传染病经济负担的模型可以根据感染者所处的不同疾病状态的直接和间接成本估算出疾病负担。据此估算的我国2007年慢性乙型肝炎的直接医疗成本高达367亿元人民币。如果不进行免疫预防,我国2007年出生的人口在将来造成的经济损失高达1154亿元人民币。在此之前,本章还分析了我国经济法发展与传染病控制的相关关系。第四章建立了分析疫苗免疫技术经济学影响的数学模型,并对我国乙型肝炎疫苗免疫的经济学影响进行分析和评价。根据最新公布的慢性乙肝调查数据,通过成本-效果分析、成本-效益分析和成本-效用分析,证明疫苗免疫的经济效果非常显着,每年可以节约50多亿元人民币的治疗费。第五章建立数学模型对慢性传染病治疗监测进行经济学分析和评价。建立了确定最佳耐药检测时间的数学模型、确定定性检测条件下更换治疗方案的最优策略的数学模型、确定定量检测条件下更换治疗方案的最优策略的数学模型以及不同检测方法比较评价的数学模型。确定拉米夫定耐药监测时间间隔,分析和评估拉米夫定耐药检测经济学影响,发现如果采用慢性乙型肝炎治疗监测手段,每年可以节约治疗费用5亿多元人民币。最后一章给出本文的如下结论:（1）现阶段我国传染病发病率与国内生产总值和国家财政支出呈显着负相关,病死率与农村恩格尔系数呈显着正相关;（2）我国慢性传染病的经济负担非常沉重,采用疫苗预防具有很高的经济效果;（3）采用本文建立的马尔科夫决策模型和增量成本效果分析模型可以对慢性传染病的预防与治疗监测进行经济学分析和评价;（4）我国慢性乙型肝炎的经济负担十分严重,采用疫苗免疫和合适的治疗监测可以节约大量治疗费用。文章的最后根据研究结果提出了对我国传染病防治与医学技术发展的政策建议。本文的主要创新之处卫生技术经济学分析的研究在我国处于刚刚起步阶段,有许多理论和实践的具体问题需要探索和研究。本论文针对我国慢性传染性疾病的预防和控制的特点,建立评估我国传染病经济负担的数学模型、评价传染病预防技术及策略的数学模型和评价传染病治疗监测的数学模型,同时详细估算了我国慢性乙型肝炎的经济负担、预防技术和策略的经济学影响和治疗监测技术的经济学影响。主要创新点有以下几个方面:1、建立了确定慢性传染病治疗监测最优策略的数学模型:国内外的研究人员虽然对疾病负担、预防技术、诊断技术和治疗技术的评估进行了广泛研究,但对治疗监测技术的经济学分析缺乏深入研究,这可能与治疗监测技术仅仅在最近几年才得到迅速发展有关。本论文应用马尔可夫决策方法建立了确定慢性传染病治疗监测最优策略的数学模型,为更加有效地治疗慢性传染性疾病、降低医疗费用和节约卫生资源提供了理论依据。2、建立了确定慢性传染病最佳治疗监测时间的数学模型:虽然对慢性传染病的治疗效果进行监测已经成为临床专家的共识,但目前对治疗监测时间的确定仍然基于专家的经验判断,缺乏理论上的支持。本论文采用决策分析方法,建立了确定慢性传染病最佳治疗监测时间的数学模型,为慢性传染病的治疗监测提供了理论依据。3、建立了对慢性传染病治疗监测技术进行经济学分析的数学模型:治疗监测技术是近几年发展起来的基于药物基因组学的新技术,其临床应用的范围日益扩大,但对其进行经济学分析的研究尚未见报道。本文采用成本-效益分析方法建立了对治疗监测技术进行经济学评价的模型,为进一步研究慢性疾病治疗监测策略的经济学意义奠定了基础。4、系统分析了我国慢性乙型肝炎的经济负担、预防技术和策略的经济学影响以及慢性乙型肝炎治疗监测技术的经济学影响:我国是慢性乙型肝炎重负担国家,但目前仍缺乏对我国慢性乙型肝炎的经济负担估算的系统研究。对免疫预防技术的评估也仅限于城市区域,对慢性乙型肝炎治疗监测技术的经济学分析的研究尚未见报道。本文采用我国2006年慢性乙型肝炎全国普查的最新资料（本资料于2008年4月21日公布）对我国慢性乙型肝炎的经济负担进行估算,并根据我国乙型肝炎免疫规划分析疫苗免疫接种的经济学影响,同时还对目前的慢性乙型肝炎治疗监测策略进行经济学分析和评价,为我国慢性乙型肝炎的预防和控制决策提供了具体的资料。
陈宗艳[8]（2008）在《DHBV侵染规律和preS蛋白原核表达及在评价抗人类乙肝新药的应用》文中研究说明鸭乙型肝炎病毒（Duck Hepatitis B Virus,DHBV）与乙型肝炎病毒（Hepatitis BVirus,HBV）同属嗜肝DNA病毒科,这类病毒的特征是有强的嗜肝细胞特性,在病毒形态、基因组结构、复制过程等生物学特性相似。DHBV感染鸭模型是研究HBV的生物学特性、致病机制和抗HBV药物的实验动物模型。本文通过调查四川地区麻鸭自然携带DHBV的情况,分离DHBV毒株,以此毒株为模板,扩增主要抗原基因preS。通过构建DHBV-preS原核表达质粒并诱导表达,从而对表达蛋白免疫原性、表达蛋白抗体介导的免疫组化检测人工感染DHBV后在体内的蛋白定位分析与侵染规律,以期系统地了解的入侵方式和复制机理,为阐明DHBV的发病机制提供关键的实验数据。同时建立基于定量检测DHBV的FQ-PCR方法,用于DHBV疾病模型研究,并结合体外模型HepG2.2.15细胞研究抗乙型肝炎新药,结果如下:DHBV毒株的分离及分子特征解析结果表明:四川麻鸭自然携带DHBV 4%,证实四川麻鸭是研究实验性DHBV感染动物模型的良好鸭种;对分离到的其中3株DHBV阳性血清全基因克隆、测序并进行生物信息学分析,发现全基因组均含3006个核苷酸（GenBank登录号EU429324,EU429325,EU429326）,具有X-like开放阅读框特征;进一步研究ORF-S还表明该基因编码33个氨基酸,有四个疏水区,无N-糖基化位点,也无豆蔻酰化位点,在1～30aa内有一个明显的信号肽,在19～20aa处有断点,跨膜螺旋预测为外膜蛋白,抗原位点主要分布于preS区氨基酸序列中。根据DHBV-preS序列,设计一对特异性引物,以分离的DHBV毒株为模板扩增目标基因并将其克隆至pMD18-T载体,经PCR、酶切和DNA测序鉴定后,将DHBV-preS基因正向插入原核表达载体pET-32a（+）的ApaI和NcoI位点间,成功构建了重组表达质粒pET32a（+）/DHBV-preS。重组表达质粒pET32a（+）/DHBV-preS转化表达宿主菌BL21（DE3）,用IPTG诱导,能表达出了大小约为37kD的preS重组蛋白,与预期表达蛋白分子量大小相符;经对不同诱导时间及诱导剂IPTG浓度等条件进行优化,确定重组质粒pET32a（+）/DHBV-preS的最佳诱导条件为0.8mmol/LIPTG、37℃条件下诱导4h。表达产物用镍柱亲和层析纯化后,将得到的preS重组蛋白做梯度稀释,初步建立ELISA检测DHBsAb的方法（间接法）;同时将纯化的重组蛋白与等量弗氏佐剂混合制备preS重组蛋白免疫原,四次免疫家兔,获得的兔抗DHBV-preS高免血清经辛酸-硫酸铵粗提后,阴离子交换柱层析纯化抗体IgG。建立DHBV-preS基因表达蛋白抗体介导的免疫组化方法;针对DHBV的保守序列设计并合成引物及荧光标记探针,建立实时荧光定量聚合酶链反应（fluorsescencequantitative polymerase chain reaction,FQ-PCR）检测方法。建立的标准曲线循环阈值（cycle threshold,Ct值）与模板浓度具有良好的线性关系,相关系数为0.993,将其检测极限的Ct值通过标准曲线换算成拷贝数约为5copies/L,未检测到鸭病毒性肝炎、鸭瘟病毒、鸭源致病性大肠埃希氏菌、鸭源致病性沙门氏菌、鸭疫里默氏杆菌,表明FQ-PCR检测DHBV方法灵敏、特异性强。采用鸭乙型肝炎病毒人工方法感染1日龄四川麻鸭,攻毒后于不同时间采血分离血清,采集肝脏、胰腺、肾脏、脾脏等组织或器官,经建立的DHBV-preS基因表达蛋白抗体免疫组化方法和FQ-PCR方法检测DHBV在感染鸭体内侵染过程与定位分布,并结合组织学和血液生化指标对DHBV在感染鸭体模型侵染规律进行系统观察。结果显示:感染后2d可在血清和肝组织中检测出DHBV DNA,血清中DHBV DNA从感染后第10d～30d DHBV DNA的拷贝数保持在1.00E+09以上,肝组织中DHBVDNA的含量从感染后第5d～52d保持在5.00E+09以上;肝脏DHBV DNA第14d达到最高水平,而血清中DHBV DNA第22d达到最高水平。肝脏、胰腺、肾脏、脾脏的损伤程度与DHBV DNA水平成正相关;在感染后3～52d内的不同时间点从肝脏、胰腺、肾脏、脾脏及大脑六种组织器官中检测出DHBsAg,DHBsAg主要分布在细胞浆,少部分分布于细胞核,未能从食道、腺胃、肺、心脏、生殖器和肌肉中检测到DHBsAg,表明DHBV嗜肝的同时具有泛嗜性,且在靶器官的侵染与分布具有一定选择性;在感染后1～3d、52d以后各组织相继不能检出DHBsAg,感染后12～31d病毒在机体内各组织的分布最为广泛,感染后4d肝脏开始出现DHBsAg阳性细胞,感染后6d肾脏、胰腺、脾脏相继开始出现DHBsAg阳性细胞,而脑组织在感染后10d出现阳性细胞;肝脏的检出率最高,持续至52d,大脑的检出率最低,分析表明该蛋白可能是膜蛋白,具有运输核浆与引导病毒组分进入核内参与病毒复制的功能。DHBV感染后第4d,总蛋白和白蛋白含量开始降低,谷丙、谷草转氨酶活性升高（P＜0.01）,乳酸脱氢酶活性升高（P＜0.01）,肌酐和尿素有变化但无规律,表现为升高趋势,感染后44d开始,各项血液生化指标逐渐趋于正常值,表明DHBV引起肝脏损伤的同时累及肾脏。在建立的抗人类乙型肝炎新药体内药效评价的技术平台和体外模型HepG2.2.15上评价抗乙型肝炎新研制药物-核苷类似物（代号PNA）的作用。在HepG2.2.15细胞系中,PNA有明确的抑制HBV DNA复制作用,抑制HBsAg和HBeAg,在7.8～62.5μg/mL剂量范围内有剂量—时间依赖关系,未见到明显细胞学毒性;在鸭乙肝动物模型中,PNA对DHBV DNA抑制率达50%的最低用药剂量为口服20mg/kg,口服40mg/kg、80mg/kg PNA对DHBV的抑制率与拉米夫定口服组（50mg/kg）基本一致,可以减轻鸭脏炎症,抑制DHBsAg在肝脏中的表达。
袁媛,陈强,杨继红,刘中来,熊国梅[9]（2007）在《HBV前C区部分序列亚克隆与FQ-PCR标准曲线的制备》文中提出目的探讨HBV前C区基因用于乙型病毒性肝炎早期诊断价值和意义并基于此靶基因制备荧光定量PCR标准曲线。方法设计特异性引物,将pBR322-HBV质粒前C区部分序列PCR产物AT亚克隆至pBS-T载体,提取和纯化质粒DNA,制作标准品并在FQ-PCR仪上得到标准曲线,进而对精确度和重复性进行统计分析。结果获得了预期希望的质粒。荧光定量PCR标准曲线的相关系数为0.995,线性范围5×103 copies/μl5×109 copies/μl。批内、批间变异系数值均小于5%,精确度高,重复性好。结论HBV前C区基因用于乙型病毒性肝炎早期检测和诊断有一定价值和意义。且FQ-PCR标准曲线的成功制备,临床早期检测乙肝病毒感染奠定了基础。
许君[10]（2007）在《抗乙型肝炎病毒药物体外筛选评价体系的建立及绿茶提取物抗乙肝病毒研究》文中认为乙型肝炎病毒（HBV）严重威胁着人类的健康，采用合适的模型和可靠的检测手段来筛选新型的抗HBV药物一直是人们研究的热点。本文中，我们建立一套荧光定量PCR检测HBV共价闭合DNA（cccDNA）的方法；对两个HBV的稳定表达细胞模型进行了动态分析；并结合ELISA，利用HepG2-N10细胞和所建立的HBV cccDNA荧光定量体系，体外研究了绿茶提取物（GTE）和原核表达的重组苦瓜蛋白的抗乙肝病毒作用。第一章：文献综述。概括介绍了乙型肝炎病毒、乙型肝炎的发病机理和治疗、HBV cccDNA检测的意义、药物筛选模型及绿茶提取物等植物抗病毒因子的生物学活性等。并在本章最后介绍了本论文的研究目的、内容和意义。第二章：实时荧光定量PCR检测HBV cccDNA方法的建立。采用一对跨越HBV基因组正负两链的两个缺口的特异性引物，利用基于Eva greenTM荧光染料的荧光定量PCR技术，用构建的含有HBV基因组的质粒为定量标准品，分别对乙型肝炎患者及健康者的血清、HBV稳定表达细胞系进行检测。结果显示，该系统灵敏度高，重复性好。对血清样本的检测结果显示：六例大三阳患者的血清中有五例检测到了cccDNA，而其他小三阳等样本中没有检测到cccDNA，在HepG2 2．2．15和HepG2-N10细胞核中也检测到cccDNA的存在。第三章：两种稳定表达乙型肝炎病毒的细胞系的动态分析。利用ELISA和Real-time PCR，分别从细胞的增殖、病毒的抗原表达、胞外HBV DNA的合成、细胞内HBV复制型中间体及细胞核内HBV cccDNA水平等方面对两种乙型肝炎病毒的稳定表达细胞系HepG2 2．2．15和HepG2-N10进行了动态分析，结果显示，HepG2-N10具有较快的生长速度，而且能分泌较多的乙肝表面抗原（hepatitis B s Antigen，HBsAg）、乙肝e抗原（Hepatitis B e Antigen，HBeAg）和Dane颗粒；而HepG2 2．2．15的细胞内复制型中间体的量要明显高于HepG2-N10，而且细胞核内的cccDNA的载量比HepG2-N10多一倍。抗病毒试验显示，HepG2-N10能够更快速地验证抗病毒药物的抑制作用，3TC作用六天即可显示出明显的抗乙肝病毒效果。因此，HepG2-N10是一个生长速度较快、易于培养的乙肝病毒表达细胞系，能用于研究HBV生物学特性、乙肝的发病机制、体外抗HBV药物筛选等多项研究。第四章：绿茶提取物（GTE）体外抗乙型肝炎病毒研究。利用HepG2-N10，ELISA测定GTE及其主要成份表没食子儿茶素没食子酸脂（EGCG）作用前后HBeAg和HBsAg的变化。结果显示：GTE在最小有效剂量10μg／ml时即可有效抑制HBV的产生。HBsAg和HBeAg的抑制与GTE作用成剂量依赖关系，并随药物浓度的增加和作用时间的延长，抑制作用也随着增强，差异显着（P＜0.01）；EGCG单独作用于HepG2-N10时，对乙型肝炎病毒也有很强的抑制作用，但与GTE相比作用较弱。用Real-time PCR分析了药物作用前后HepG2-N10细胞培养基上清HBV DNA、细胞内复制性中间体，以及细胞核内的cccDNA的影响；采用One-step reverse transcriptase PCR分析了GTE对于HBV的转录的抑制作用。结果预示以GTE有望成为治疗乙型肝炎的另一种替代或辅助治疗药物。第五章：重组苦瓜抗病毒蛋白MAP30的克隆表达与生物学活性研究。分别采用PCR和RT-PCR扩增出编码MAP30蛋白的基因和cDNA，经测序鉴定后将MAP30 cDNA克隆到原核表达载体pET-28a实现高效表达，结果表明该融合蛋白主要以可溶的形式存在。活性验证表明重组蛋白MAP30具有抗金黄色葡萄球菌生长和抑制真菌菌丝延伸作用，而且对于人正常肝细胞株L-02没有毒性，而作用于癌细胞时，细胞毒性随浓度的增加而增加，二者成剂量依赖性关系，ID50为0.0283mg／ml。将纯化的重组MAP30作用于HBV稳定转染细胞系HepG2-N10，并测定HBV的抗原表达变化，结果表明，重组MAP30具有抗乙型肝炎病毒作用，在所试验的最高浓度0.04mg／ml时，对HBsAg的抑制率最高为12.9％，对HBeAg的最高抑制率为26.7％。
二、乙型肝炎病毒的亚克隆及其应用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、乙型肝炎病毒的亚克隆及其应用（论文提纲范文）
（1）戊型肝炎病毒ORF3蛋白单克隆抗体的制备及其应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 戊型肝炎研究进展 |
| 1.1.1 戊型肝炎的分类 |
| 1.1.2 戊型肝炎的危害 |
| 1.1.3 病毒形态及理化特性 |
| 1.1.4 病毒的基因组结构 |
| 1.1.5 戊型肝炎病毒的检测方法 |
| 1.2 单克隆抗体技术 |
| 1.3 目的和意义 |
| 第二章 HEV-1 ORF3 蛋白的表达与纯化 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 质粒和菌株 |
| 2.1.2 主要试剂耗材 |
| 2.1.3 主要仪器和设备 |
| 2.1.4 基础试剂配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 重组表达载体的构建 |
| 2.2.2 ORF3~(SAR55)重组蛋白在大肠杆菌中的表达 |
| 2.2.3 ORF3~(SAR55)重组蛋白的纯化 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 ORF3~(SAR55)重组表达载体的构建 |
| 2.3.2 SDS-PAGE分析HEV-ORF3~(SAR55)重组蛋白在大肠杆菌中的表达 |
| 2.3.3 SDS-PAGE分析ORF3~(SAR55)重组蛋白的纯化情况 |
| 2.3.4 BCA蛋白浓度测定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 抗HEV-1 ORF3 蛋白单克隆抗体的筛选与鉴定 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 试验相关蛋白和细胞 |
| 3.1.2 试验相关试剂耗材 |
| 3.1.3 试验相关仪器设备 |
| 3.1.4 主要试剂配制 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 Balb/c小鼠的免疫与血清抗体效价检测 |
| 3.2.2 细胞融合 |
| 3.2.3 间接ELISA法筛选阳性克隆 |
| 3.2.4 细胞亚克隆 |
| 3.2.5 腹水的制备与纯化 |
| 3.2.6 单克隆抗体的亚型鉴定 |
| 3.2.7 间接ELISA检测单抗与免疫原的反应性 |
| 3.2.8 Western Blot检测单抗与免疫原的反应性 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 免疫后小鼠血清效价 |
| 3.3.2 腹水纯化单克隆抗体 |
| 3.3.3 单克隆抗体的亚型鉴定 |
| 3.3.4 间接ELISA检测单抗与抗原反应性 |
| 3.3.5 单克隆抗体的免疫印迹分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 抗HEV-1 ORF3 单克隆抗体竞争ELISA方法的建立与评价 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 相关血清 |
| 4.1.2 试验相关试剂耗材 |
| 4.1.3 试验相关仪器设备 |
| 4.1.4 主要试剂配置 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 人HEV阳性血清筛选 |
| 4.2.2 单克隆抗体的HRP标记 |
| 4.2.3 HRP标记的单克隆抗体与抗原的反应性 |
| 4.2.4 HRP标记的单克隆抗体与其他基因型HEV ORF3 蛋白的交叉反应性 |
| 4.2.5 基于HRP-IgG抗体的竞争ELISA方法的建立 |
| 4.2.6 竞争ELISA方法评价 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 人HEV阳性血清筛选 |
| 4.3.2 HRP标记的单克隆抗体效果检测 |
| 4.3.3 HRP标记的单克隆抗体与ORF3 抗原的反应性 |
| 4.3.4 基于ORF3~(SAR55)单克隆抗体的竞争ELISA方法的建立 |
| 4.3.5 竞争ELISA方法评价 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）基于氧化石墨烯特种光纤光栅生物传感器的肝癌患者血清sPD-L1、AFP快速检测方法研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写索引 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 肝细胞癌概述 |
| 1.1.1 肝细胞癌简介 |
| 1.1.2 肝细胞癌发病机理 |
| 1.1.3 肝细胞癌的诊断方法 |
| 1.1.3.1 影像学方法 |
| 1.1.3.2 蛋白免疫方法 |
| 1.1.3.3 病理学方法 |
| 1.1.3.4 基因诊断方法 |
| 1.1.3.5 细胞学方法 |
| 1.1.4 癌症标志物sPD-L1、AFP简介 |
| 1.1.4.1 可溶性程序性死亡因子配体 |
| 1.1.4.2 甲胎蛋白 |
| 1.1.5 血清标志物检测方法进展 |
| 1.1.5.1 酶联免疫吸附技术进展 |
| 1.1.5.2 免疫胶体金技术进展 |
| 1.1.5.3 蛋白质芯片技术进展 |
| 1.1.5.4 化学发光免疫分析法进展 |
| 1.2 光纤光栅生物传感器 |
| 1.2.1 光纤布拉格光栅(fiber Bragg grating,FBG) |
| 1.2.2 长周期光纤光栅(Long-period fiber grating,LPG) |
| 81°)倾斜光纤光栅(ETFGs)'>1.2.3 极大角度(>81°)倾斜光纤光栅(ETFGs) |
| 第2章 sPD-L1、AFP原核表达及鉴定 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株与质粒 |
| 2.1.2 仪器设备 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 序列分析与合成 |
| 2.2.2 重组质粒的酶切鉴定 |
| 2.2.3 重组质粒的转化 |
| 2.2.4 重组质粒的表达与鉴定 |
| 2.2.5 重组质粒诱导表达条件筛选 |
| 2.2.6 重组蛋白的大量表达及包涵体处理 |
| 2.2.7 重组蛋白的纯化 |
| 2.2.8 重组蛋白SDS-PAGE鉴定 |
| 2.2.9 纯化样品BCA法浓度测定 |
| 2.2.10 重组蛋白Western blot鉴定 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 重组蛋白sPD-L1 原核表达、纯化及鉴定结果 |
| 2.3.1.1 酶切鉴定结果 |
| 2.3.1.2 重组蛋白s PD-L1 的诱导表达鉴定 |
| 2.3.1.3 重组蛋白s PD-L1 的最佳诱导条件的筛选 |
| 2.3.1.4 重组蛋白s PD-L1 的纯化以及SDS-PAGE鉴定 |
| 2.3.1.5 重组蛋白s PD-L1 浓度测定 |
| 2.3.1.6 重组蛋白s PD-L1的Western blot鉴定 |
| 2.3.2 重组蛋白AFP原核表达、纯化及鉴定结果 |
| 2.3.2.1 重组质粒pET28a(+)-AFP酶切鉴定 |
| 2.3.2.2 重组蛋白AFP的纯化以及SDS-PAGE鉴定 |
| 2.3.2.3 重组蛋白AFP法浓度测定 |
| 2.3.2.4 重组蛋白AFP的 Western blot鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 抗sPD-L1 单克隆抗体的制备 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物及细胞 |
| 3.1.2 主要仪器设备 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 主要试剂配方 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 BALB/c小鼠免疫 |
| 3.2.2 抗原最佳包被浓度以及小鼠血清效价测定 |
| 3.2.2.1 抗原最佳包被浓度测定 |
| 3.2.2.2 小鼠血清效价测定 |
| 3.2.3 小鼠腹腔巨噬细胞制备 |
| 3.2.4 SP2/0 细胞的制备 |
| 3.2.5 小鼠脾脏细胞悬液制备 |
| 3.2.6 细胞融合 |
| 3.2.7 阳性杂交瘤细胞筛选 |
| 3.2.8 阳性杂交瘤细胞亚克隆 |
| 3.2.9 小鼠腹水型单抗的制备 |
| 3.2.10 腹水型单抗的纯化 |
| 3.2.11 sPD-L1 单克隆抗体鉴定 |
| 3.2.11.1 单抗纯度鉴定 |
| 3.2.11.2 单抗浓度测定 |
| 3.2.11.3 单抗亚类鉴定 |
| 3.2.11.4 单抗效价测定 |
| 3.2.11.5 单抗特异性鉴定 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 最佳包被浓度以及最佳阴阳性血清稀释度的确定 |
| 3.3.2 融合前小鼠血清效价ELISA测定 |
| 3.3.3 细胞融合结果 |
| 3.3.4 杂交瘤细胞筛选以及亚克隆筛选结果 |
| 3.3.5 sPD-L1 单克隆抗体亚型鉴定 |
| 3.3.6 单抗的纯化 |
| 3.3.7 单抗纯度鉴定 |
| 3.3.8 单抗浓度测定 |
| 3.3.9 效价测定 |
| 3.3.10 2-2G单抗Western blot鉴定 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 基于氧化石墨烯Ex-TFG生物传感器的血清标志物快速检测方法的初步研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 样本 |
| 4.1.2 主要仪器设备 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 溶液配制 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 检测平台的搭建 |
| 4.2.2 Ex-TFG生物传感器表面预处理 |
| 4.2.3 Ex-TFG生物传感器表面修饰 |
| 4.2.3.1 Ex-TFG生物传感器表面生物功能化修饰的研究方案 |
| 4.2.3.2 Ex-TFG生物传感器表面修饰实验步骤 |
| 4.2.3.2.1 表面羟基化 |
| 4.2.3.2.2 表面硅烷化 |
| 4.2.3.2.3 涂覆金纳米壳 |
| 4.2.3.2.4 金纳米壳氨基化 |
| 4.2.3.2.5 涂覆氧化石墨烯 |
| 4.2.3.2.6 活化GO上的-COOH |
| 4.2.3.2.7 修饰s PD-L1 单克隆抗体、AFP单克隆抗体 |
| 4.2.3.2.8 封闭 |
| 4.2.4 Ex-TFG生物传感器灵敏度检测实验 |
| 4.2.5 Ex-TFG生物传感器重复性实验 |
| 4.2.6 Ex-TFG生物传感器特异性实验 |
| 4.2.7 Ex-TFG生物传感器临床性实验 |
| 4.2.7.1 血清标志物s PD-L1 检测 |
| 4.2.7.2 血清标志物AFP检测 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 传感器表面修饰过程光谱演变 |
| 4.3.2 Ex-TFG表面修饰AuNS-GO |
| 4.3.3 Ex-TFG生物传感器灵敏度检测实验 |
| 4.3.4 Ex-TFG生物传感器重复性实验 |
| 4.3.5 Ex-TFG生物传感器特异性实验 |
| 4.3.6 Ex-TFG生物传感器临床性实验 |
| 4.3.6.1 血清标志物s PD-L1 检测 |
| 4.3.6.2 血清标志物AFP检测 |
| 4.3.6.3 sPD-L1、AFP临床实验结果相关性比较 |
| 4.4 分析与讨论 |
| 第5章 总结与展望 |
| 5.1 全文总结 |
| 5.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文及取得的研究成果 |
（3）基于乙型肝炎病毒两表位肽段组合的ELISA检测方法研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 研究目的与意义 |
| 1.2 国内外研究现状 |
| 1.2.1 酶联免疫吸附测定 |
| 1.2.2 乙型肝炎病毒结构 |
| 1.2.3 单克隆抗体 |
| 1.2.4 关键表位肽段组合的仿生学思想 |
| 1.3 研究内容与方法 |
| 1.4 研究路线图 |
| 第2章 基于关键表位氨基酸序列的基因分型研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 试剂 |
| 2.2.2 主要仪器设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 血清样本采集 |
| 2.3.2 乙肝病毒DNA提取 |
| 2.3.3 目标片段PCR扩增 |
| 2.3.4 测序和基因分型 |
| 2.3.5 统计学分析 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 血清样本资料 |
| 2.4.2 序列比对和基因分型结果 |
| 2.4.3 三种基因分型结果的一致性分析 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 P94抗体ELISA检测方法的优化 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 试剂 |
| 3.2.2 主要仪器设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 血清样本采集 |
| 3.3.2 P94抗体ELISA检测方法优化 |
| 3.3.3 不同包被方式的批间差异分析 |
| 3.3.4 统计学分析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 P94抗体ELISA检测方法的包被浓度优化结果 |
| 3.4.2 P94抗体ELISA检测方法的包被方式优化结果 |
| 3.4.3 不同包被方式的批间变异系数分析结果 |
| 3.4.4 不同包被方式的相关性分析结果 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 P94表位基因型特异性单克隆抗体制备 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 多肽合成及偶联 |
| 4.3 动物免疫 |
| 4.4 血清滴度测定 |
| 4.4.1 试剂 |
| 4.4.2 实验方法 |
| 4.4.3 结果与讨论 |
| 4.5 与临床样本比对筛选和确认 |
| 4.6 冲击免疫 |
| 4.7 细胞融合 |
| 4.7.1 主要试剂和器材 |
| 4.7.2 实验方法 |
| 4.8 阳性克隆筛选 |
| 4.9 杂交瘤细胞株的筛选和确认 |
| 4.10 杂交瘤细胞株的亚克隆 |
| 4.11 单克隆抗体制备标准曲线绘制 |
| 4.12 本章小结 |
| 第5章 P94抗体临床检测意义的统计学研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 试剂 |
| 5.2.2 主要仪器设备 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 血清样本和信息采集 |
| 5.3.2 大样本血清样本的P94抗体检测 |
| 5.3.3 患者信息的判断标准 |
| 5.3.4 统计学分析 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 血清样本一般资料 |
| 5.4.2 P94抗体与HBVDNA载量的相关性 |
| 5.4.3 P94抗体与患病阶段的相关性 |
| 5.5 本章小结 |
| 第6章 关键表位肽段组合替代全长包被检测的研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验材料 |
| 6.2.1 试剂 |
| 6.2.2 主要仪器设备 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 血清样本采集 |
| 6.3.2 组合包被P21和P94肽段检测抗体 |
| 6.3.3 包被PreS1全长蛋白检测抗体 |
| 6.3.4 包被P21肽段检测抗体 |
| 6.3.5 包被P94肽段检测抗体 |
| 6.3.6 统计学分析 |
| 6.4 结果与讨论 |
| 6.4.1 血清样本一般资料 |
| 6.4.2 多肽性质分析 |
| 6.4.3 不同包被方式检测抗体结果 |
| 6.4.4 不同包被方式检测抗体的显着性分析 |
| 6.5 本章小结 |
| 第7章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 在学期间科研成果 |
| 导师及作者简介 |
| 致谢 |
（4）乙型肝炎病毒中国流行株C基因型稳定转染细胞模型的评价与应用（论文提纲范文）
| 英文缩写中英文全称对照表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 实验一 乙型肝炎病毒稳定转染细胞特征分析 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、实验讨论 |
| 实验二 临床常用核苷类药物药效学评价 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、实验讨论 |
| 实验三 新型小发卡RNA慢病毒表达载体的构建及抗乙型肝炎病毒应用评价 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、实验讨论 |
| 全文结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录一：文献综述 |
| 参考文献 |
| 附录二：在校期间论文论着及科研情况 |
（5）荧光定量PCR检测乙型肝炎病毒DNA的研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 引物和探针的设计思路: |
| 1.2.2 PCR扩增pBR22-HBv质粒前e区、e区和X区保守序列: |
| 1.2.3 AT亚克隆: |
| 1.2.4 HBV-DNA荧光定量PCR定量DNA标准的制备: |
| 1.2.5 HBV-DNA荧光定量PCR定量检测标准曲线的制备: |
| 1.2.6 HBV-DNA荧光定量PCR检测线性范围、精度和重复性确定: |
| 2 结果 |
| 2.1 前C区、C区和X区目的片段 |
| 2.2 HBV-DNA标准品制备 |
| 2.3 常规PCR检测灵敏度 |
| 2.4 HBV-DNA荧光定量PCR检测标准曲线 |
| 2.5 HBV-DNA荧光定量PCR精度 |
| 2.6 HBV-DNA荧光定量PCR重复性 |
| 3 讨论 |
| 3.1 常规PCR分析 |
| 3.2 HBV-DNAFQ-PCR检测效果评价 |
（6）乙型肝炎病毒慢性感染小鼠模型的建立及初步应用（论文提纲范文）
| 中英文缩写名词对照表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 中国株B基因型HBV可复制性克隆的构建 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 慢性HBV感染小鼠模型的建立 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 以逆转录病毒RNIA表达载体在HBV慢性感染小鼠模型中 抗病毒效果评价 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 附录 |
| 致谢 |
（7）我国慢性传染病预防与治疗监测的经济学分析 ——以慢性乙型肝炎为例（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究背景与意义 |
| 1.1.1 研究背景 |
| 1.1.2 研究的目的和意义 |
| 1.2 研究的内容和方法 |
| 1.3 拟解决的关键问题 |
| 1.4 内容安排与章节结构 |
| 1.5 主要创新点 |
| 第二章 文献综述 |
| 2.1 慢性传染病的经济负担 |
| 2.2 卫生经济学中的评估工具 |
| 2.2.1 成本-效益分析 |
| 2.2.2 成本-效果分析 |
| 2.2.3 成本-效用分析 |
| 2.3 医学技术发展与慢性传染病防治 |
| 2.4 卫生保健的生产和成本 |
| 2.4.1 卫生保健的投入要素及相互替代 |
| 2.4.2 卫生保健的成本函数 |
| 2.4.3 医学技术的发展及其成本 |
| 2.4.4 医学技术的推广及其影响因素 |
| 2.5 新技术的扩散 |
| 2.5.1 新技术扩散的基本模型 |
| 2.5.2 医学新技术的扩散 |
| 2.5.3 医疗管理与医学技术扩散 |
| 2.6 新技术的评价 |
| 2.6.1 结构 |
| 2.6.2 资料 |
| 2.6.3 一致性 |
| 2.7 我国慢性传染病研究的现状及问题 |
| 第三章 我国慢性传染病的经济负担 |
| 3.1 我国慢性传染病概况 |
| 3.1.1 我国法定传染病种类的历史变迁 |
| 3.1.2 我国法定传染病的发病情况 |
| 3.1.3 我国传染病发病率、死亡率和病死率与经济发展的关系 |
| 3.2 估算传染病经济负担的数学模型 |
| 3.2.1 传染病传播的数学模型 |
| 3.2.2 传染病经济负担的数学模型 |
| 3.3 我国慢性乙型肝炎的经济负担 |
| 3.3.1 乙型肝炎的基本资料 |
| 3.3.2 我国慢性乙型肝炎的经济负担 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 我国慢性传染病预防的经济学分析 |
| 4.1 慢性传染病的预防策略 |
| 4.1.1 传染病预防的基本策略 |
| 4.1.2 传染病预防的全球行动 |
| 4.1.3 我国传染病预防的成就 |
| 4.1.4 我国计划免疫体系 |
| 4.2 疫苗的价值及其发展 |
| 4.2.1 疫苗的价值 |
| 4.2.2 疫苗技术的发展 |
| 4.2.3 疫苗接种的政策影响 |
| 4.3 评价疫苗接种经济效果的数学模型 |
| 4.4 基因工程疫苗预防慢性乙型肝炎的经济学分析 |
| 4.4.1 乙型肝炎基因工程疫苗的生物学特性及接种策略 |
| 4.4.2 我国乙型肝炎疫苗新生儿普遍接种计划的经济学分析 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 我国慢性传染病治疗监测的经济学分析 |
| 5.1 抗感染治疗过程中的耐药现象及其后果 |
| 5.1.1 慢性传染病治疗过程中的耐药现象及其经济损失 |
| 5.1.2 慢性传染病耐药的临床对策 |
| 5.2 传染病治疗监测技术的发展 |
| 5.2.1 检测耐药相关基因突变的技术及其发展 |
| 5.3 模型 |
| 5.3.1 确定最佳耐药检测时间的模型 |
| 5.3.2 定性检测条件下更换治疗方案的最优策略 |
| 5.3.3 定量检测条件下更换治疗方案的最优策略 |
| 5.3.4 不同检测方法的经济学分析和评价 |
| 5.4 慢性乙型肝炎拉米夫定治疗检测及其经济学分析 |
| 5.4.1 拉米夫定耐药检测时间间隔的确定 |
| 5.4.2 拉米夫定耐药检测的成本-效益分析 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 主要结论及政策建议 |
| 6.1 主要结论 |
| 6.2 政策建议 |
| 6.2.1 促进农村经济协调发展，提高农村人口最低收入水平 |
| 6.2.2 重视疾病经济负担的评估，为实现全民医疗保障体系提供可靠的决策参考和财政预算资料 |
| 6.2.3 重视疾病的预防，完善农村免疫接种网络建设 |
| 6.2.4 重视慢性疾病的治疗监测，在提高治疗效果的同时节约卫生资源 |
| 6.2.5 重视医学新技术的研究开发和经济学评估，完善公费医疗项目审核体系 |
| 6.3 研究的局限性 |
| 6.4 进一步研究的展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
（8）DHBV侵染规律和preS蛋白原核表达及在评价抗人类乙肝新药的应用（论文提纲范文）
| 本研究的创新点 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 鸭乙型肝炎病毒的研究进展 |
| 1 DHBV生物学特性 |
| 1.1 包膜蛋白 |
| 1.2 核蛋白 |
| 1.3 P蛋白 |
| 1.4 X抗原 |
| 2 DHBV感染鸭原代肝细胞模型 |
| 2.1 DHBV感染鸭原代肝细胞模型的建立 |
| 2.2 DHBV感染鸭原代肝细胞模型的应用 |
| 3 DHBV感染鸭动物模型 |
| 3.1 DHBV感染动物模型的建立 |
| 3.2 DHBV感染动物模型的影响因素 |
| 4 DHBV感染动物模型的相关研究及应用 |
| 4.1 DHBV感染鸭的各种动物模型 |
| 4.2 DHBV突变株的生物学意义 |
| 4.3 抗HBV药物筛选模型 |
| 4.4 液制品消毒学领域的应用 |
| 5 小结 |
| 5.1 存在的问题 |
| 5.2 展望 |
| 第二章 病毒功能性蛋白的原核表达及其应用的研究进展 |
| 1 概述 |
| 2 病毒功能性蛋白表达采用的原核表达系统 |
| 2.1 原核表达系统 |
| 2.2 外源基因在大肠杆菌细胞中的表达 |
| 2.3 影响克隆基因在大肠杆菌细胞中表达效率的因素 |
| 3 病毒功能性基因的原核表达 |
| 3.1 嗜肝DNA病毒的原核表达 |
| 3.2 鸭乙型肝炎病毒preS蛋白的功能及其原核表达 |
| 4 应用前景 |
| 4.1 preS蛋白的功能研究 |
| 4.2 preS抗原的诊断及预后作用 |
| 4.3 preS抗原与疫苗 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第三章 DHBV阳性血清的分离、全基因组的克隆及序列分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 菌株及质粒 |
| 1.4 主要试剂配制 |
| 1.5 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 阳性血清的分离 |
| 2.2 DHBV全基因组的克隆 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 血清DHBV-DNA的分离 |
| 3.2 DHBV全基因序列扩增和克隆 |
| 3.3 四川麻鸭DHBV全基因测序结果 |
| 3.4 四川麻鸭DHBV全基因序列分析 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 DHBV PRES基因表达质粒的构建与表达 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株及表达载体 |
| 1.2 试验动物 |
| 1.3 常用材料与试剂 |
| 1.4 主要试剂配制 |
| 1.5 仪器与设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 扩增目的基因的引物设计 |
| 2.2 PCR扩增目的基因 |
| 2.3 PCR产物的鉴定 |
| 2.4 原核表达质粒的构建 |
| 2.5 转化表达菌株BL21 |
| 2.6 诱导表达 |
| 2.7 表达产物的SDS-PAGE分析 |
| 2.8 Western blotting检测 |
| 2.9 表达蛋白的可溶性和不可溶性分析 |
| 2.10 表达条件的优化 |
| 2.11 重组蛋白的大量诱导表达 |
| 2.12 Ni—NTA亲和层析纯化重组蛋白的纯化 |
| 2.13 纯化蛋白的应用 |
| 3 结果 |
| 3.1 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳 |
| 3.2 T载体克隆及测序鉴定 |
| 3.3 原核表达质粒的构建及鉴定 |
| 3.4 诱导表达 |
| 3.5 可溶性分析 |
| 3.6 免疫印迹 |
| 3.7 表达条件的优化 |
| 3.8 重组蛋白的纯化 |
| 3.9 SDS-PAGE分析纯化蛋白 |
| 3.10 纯化蛋白的应用 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第五章 基于鸭乙型肝炎病毒PRES蛋白免疫组化方法建立及其病毒感染鸭的抗原定位 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验毒株 |
| 1.2 试验动物 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 主要试剂 |
| 1.5 主要试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 雏鸭人工感染DHBV疾病模型的复制 |
| 2.2 雏鸭人工感染DHBV标本采集 |
| 2.3 免疫组化检测DHBV方法的建立 |
| 3 结果 |
| 3.1 免疫组化方法的建立 |
| 3.2 免疫组化检测各组织器官的定位研究 |
| 4 讨论 |
| 4.1 免疫组化方法检测DHBsAg的建立 |
| 4.2 免疫组化方法检测DHBsAg建立的意义 |
| 4.3 免疫组化方法对DHBsAg的定位研究 |
| 5 小结 |
| 第六章 实时荧光定量PCR检测鸭乙型肝炎病毒方法的建立 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验毒株 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 标准品的制备 |
| 2.2 待检标本的来源 |
| 2.3 FQ-PCR条件的建立和优化 |
| 2.4 FQ-PCR的敏感性检测 |
| 2.5 FQ-PCR的特异性检测 |
| 2.6 FQ-PCR的可重复性检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 反应体系的优化 |
| 3.2 荧光定量PCR标准曲线的建立 |
| 3.3 荧光定量PCR稳定性和重复性试验 |
| 3.4 荧光定量PCR特异性试验 |
| 3.5 荧光定量PCR敏感性试验 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第七章 鸭乙型肝炎病毒在感染鸭体内侵染规律 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验毒株 |
| 1.2 试验动物 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 主要试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 雏鸭人工感染DHBV疾病模型的复制 |
| 2.2 雏鸭人工感染DHBV疾病模型的病理组织学研究 |
| 2.3 DHBV在感染鸭体内的侵染和分布规律 |
| 2.4 雏鸭人工感染DHBV疾病模型的血液生化指标的研究 |
| 3 结果 |
| 3.1 病理组织学变化 |
| 3.2 免疫组化检测各组织器官的变化规律 |
| 3.3 DHBV-DNA在血清和肝组织中的变化规律 |
| 3.4 血液病理学变化 |
| 4 讨论 |
| 4.1 雏鸭人工感染DHBV后在体内的侵染规律及其意义 |
| 4.2 DHBV感染发病机理探讨 |
| 4.3 病理组织学和血液生化指标变化规律 |
| 5 小结 |
| 第八章 免疫组化、FQ-PCR和鸭乙型肝炎病毒感染模型联合评价抗人类乙肝新药的实验研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 供试药物 |
| 1.2 常用材料与试剂 |
| 1.3 仪器与设备 |
| 1.4 试剂配制 |
| 2 体外实验方法 |
| 2.1 细胞株 |
| 2.2 HepG2 2.2.15细胞的传代与培养 |
| 2.3 细胞毒性试验 |
| 2.4 对细胞分泌(上清)的HBsAg、HBeAg的抑制试验 |
| 2.5 上清病毒基因组DNA的分离及定量检测 |
| 2.6 细胞总DNA的提取及定量检测 |
| 3 体内实验方法 |
| 3.1 毒株 |
| 3.2 主要试剂 |
| 3.3 实验动物及分组 |
| 3.4 鸭肝组织标本形态学观察 |
| 4 结果 |
| 4.1 受试药物对HepG 2.2.15细胞毒性作用结果 |
| 4.2 受试化合物细胞水平药效学研究结果 |
| 4.3 FQ-PCR检测血清和肝组织中DHBV-DNA的结果 |
| 4.4 病理学检查结果 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻博期间发表的论文 |
（9）HBV前C区部分序列亚克隆与FQ-PCR标准曲线的制备（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 引物和TaqMan探针设计 |
| 1.2.2 PCR扩增pBR322-HBV前C区基因 |
| 1.2.3 感受态细胞的制备 |
| 1.2.4 AT亚克隆[3] |
| 1.2.5 HBV-DNA荧光定量PCR定量DNA标准的制备 |
| 1.2.6 荧光定量PCR标准曲线的制备 |
| 1.2.7 HBV-DNA荧光定量PCR精确度测定 |
| 1.2.8 HBV-DNA荧光定量PCR重复性测定 |
| 2 结果 |
| 2.1 从pBR322-HBV |
| 2.2 阳性亚克隆的初步鉴定 |
| 2.3 测序结果 |
| 2.4 荧光扩增曲线及标准曲线 |
| 2.5 精确度测定 |
| 2.6 重复性测定 |
| 3 讨论 |
（10）抗乙型肝炎病毒药物体外筛选评价体系的建立及绿茶提取物抗乙肝病毒研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1. 乙型肝炎与乙型肝炎病毒简介 |
| 2. 抗乙型肝炎病毒药物筛选常用的筛选方法与筛选模型 |
| 3. 乙型肝炎病毒共价闭合 DNA 检测意义与方法 |
| 4. 植物抗病毒因子的研究进展 |
| 5. 本论文的研究内容和意义 |
| 第二章 实时荧光定量PCR检测HBV cccDNA方法的建立 |
| 摘要 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 小结 |
| 第三章两种稳定表达乙型肝炎病毒的细胞系的动态分析 |
| 摘要 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 小结 |
| 第四章绿茶提取物体外抗乙型肝炎病毒研究 |
| 摘要 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 小结 |
| 第五章 重组苦瓜抗病毒蛋白MAP30的生物学活性研究 |
| 摘要 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 小结 |
| 第六章 结论 |
| 1. 实时荧光定量 PCR 检测 HBV cccDNA 方法的建立 |
| 2. 两种稳定表达乙型肝炎病毒的细胞系的动态分析 |
| 3. 绿茶提取物体外抗乙型肝炎病毒研究 |
| 4. 重组苦瓜抗病毒蛋白 MAP30 的生物学活性研究 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 已发表和撰写的论文 |
| 致谢 |
四、乙型肝炎病毒的亚克隆及其应用（论文参考文献）
- [1]戊型肝炎病毒ORF3蛋白单克隆抗体的制备及其应用[D]. 罗煜杭. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [2]基于氧化石墨烯特种光纤光栅生物传感器的肝癌患者血清sPD-L1、AFP快速检测方法研究[D]. 鲁友铭. 重庆理工大学, 2020(08)
- [3]基于乙型肝炎病毒两表位肽段组合的ELISA检测方法研究[D]. 张晓晨. 吉林大学, 2018(12)
- [4]乙型肝炎病毒中国流行株C基因型稳定转染细胞模型的评价与应用[D]. 张婷玉. 河南中医学院, 2015(03)
- [5]荧光定量PCR检测乙型肝炎病毒DNA的研究[J]. 马星. 临床合理用药杂志, 2014(32)
- [6]乙型肝炎病毒慢性感染小鼠模型的建立及初步应用[D]. 李磊. 华中科技大学, 2009(11)
- [7]我国慢性传染病预防与治疗监测的经济学分析 ——以慢性乙型肝炎为例[D]. 杨志军. 上海交通大学, 2008(04)
- [8]DHBV侵染规律和preS蛋白原核表达及在评价抗人类乙肝新药的应用[D]. 陈宗艳. 四川农业大学, 2008(01)
- [9]HBV前C区部分序列亚克隆与FQ-PCR标准曲线的制备[J]. 袁媛,陈强,杨继红,刘中来,熊国梅. 中国热带医学, 2007(06)
- [10]抗乙型肝炎病毒药物体外筛选评价体系的建立及绿茶提取物抗乙肝病毒研究[D]. 许君. 中国科学院研究生院（武汉病毒研究所）, 2007(02)